均勻設計法優化重組大腸桿菌產酮基還原酶培養基

石小丹等

摘 要：系統研究了典型碳源、 氮源、金屬離子、磷酸鹽以及初始pH值等因素對重組大腸桿菌產酮基還原酶的影響。單因素試驗結果表明，甘油、酵母浸粉FM888、酵母蛋白胨FP101、MgSO4· 7H2O以及離子濃度為0.1 mol·L-1 pH 值為T7 的磷酸緩沖液對菌體生長以及酶活的表達有一定的促進作用。通過均勻設計試驗及分析得到培養基的最優配方：甘油 6.86 g·L-1， FM888 19.53 g·L-1， FP101 8.37 g·L-1， MgSO4· 7H2O 2.50 g·L-1， K2HPO4 14.96 g·L-1， KH2PO4 7.34 g·L-1。優化條件下酶活為431.21 U·mL-1，比優化前（70.25 U·mL-1）提高了5.13倍。此研究可為工業化大生產提供理論指導。

關鍵詞：酮基還原酶；重組大腸桿菌；培養基優化；均勻設計

中圖分類號：TQ920.1 文獻標識碼：A DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2015.06.001

Abstract： The effects of a number of factors on the production of keto reductase were systematically studied， typically including carbon source， nitrogen source， phosphate and initial pH. The research results of single factor experiment showed that the growth and enzyme activity were promoted by glycerin， yeast extract FM888， yeast peptone FP101， MgSO4 ·7H2O， and phosphate buffer with pH 7 and 0.1 mol·L-1 ion concentration. Through uniform design experiments， the optimal conditions were obtained as follows： Glycerol 6.86 g·L-1， FM888 19.53 g·L-1， FP101 8.37 g·L-1， MgSO4 7H2O 2.50 g·L-1， K2HPO4 14.96 g·L-1， KH2PO4 7.34 g·L-1. Under the optimal conditions， the activity of keto reductase reached 431.21 U·mL-1， which was 5.13 times greater than that of the basic fermentation conditions previously（70.25 U·mL-1）. This research could provide theoretical guidance for large-scale production of keto reductase.

Key words： keto reductase； recombinant Escherichia coli； medium formulation optimization； uniform design

酮基還原酶（Keto reductase， KR）是一類依賴還原型輔酶Ⅱ（Nicotinamide adenine dinucleotide hydro-phosphate acid， NADPH）將酮類化合物不對稱性還原成手性化合物的氧化還原酶，在手性化合物合成與拆分領域中具有廣泛用途。在酮基還原酶的作用下，價格低廉的酮類化合物可被催化還原成手性前體物，這將成為制藥工業的一種新的工藝技術思路[1]。例如4-氯乙酰乙酸乙酯（4-chloroacetoacetate， COBE）經酮基還原酶轉化為手性化合物4-氯-3-羥基-丁酸乙酯（4-chloro-3-hydroxybutyrate， CHBE），后者是合成L-肉堿的前提物[2]。但由于天然酶的表達量較低，因此利用基因克隆技術，將含有KR基因的質粒重組到大腸或者酵母細胞[3]中表達目標酶成為了研究熱點。目前，國內外對KR的研究仍僅限于基因的改造和優化方面的研究[4-6]，對于重組菌發酵生產KR的影響因素及過程調控方面的研究甚少，尤其是針對重組大腸桿菌發酵生產KR的培養基優化方面的報道從未見到。

均勻設計（Uniform design，UD）是中國數學工作者方開泰等[7]于 20 世紀 70年代末提出的一種新的多因素多水平試驗設計方法，其出發點是將試驗點在試驗范圍內安排均勻分散，使試驗點在數值積分范圍內散布均勻，使布點離被積函數的各種值充分接近，所用試驗點不多卻能使積分值得到很好的近似[8]。它與正交設計、響應面方法等其他試驗設計法的最大不同之處就在于，能從盡可能少的試驗次數中揭示出因素對指標的影響大小和規律；能以最少的次數， 從多個因素中找出影響試驗結果的各因素的主次和最優結果。本文首先利用單因素試驗法找出適合重組大腸桿菌生產KR的發酵培養基成分，然后用均勻設計方法對培養基各組分添加量進行優化試驗， 以提高KR的酶活并降低生產成本， 為大規模生產及應用提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種 重組大腸桿菌含有KR外源基因的質粒，由安琪酵母股份有限公司菌種室提供。質粒以氨芐抗性基因作為標記基因，以阿拉伯糖為啟動子。

1.1.2 試劑 L-阿拉伯糖、NADPH、COBE和CHBE等購自美國Sigma公司；酵母蛋白胨（FP101）和酵母浸粉（FM888）為安琪酵母股份有限公司產品。

1.1.3 培養基 LB培養基（g·L-1）：蛋白胨，NaCl，酵母抽提物5，瓊脂粉15。TB培養基（種子以及發酵初始培養基，g·L-1）：甘油4，酵母抽提物24，酵母蛋白胨12，KH2PO4 2.31， K2HPO4 12.54，pH 值7.0。

1.1.4 誘導劑溶液 L-阿拉伯糖溶液濃度為0.05 g·mL-1。

1.1.5 氨芐青霉素貯存液 氨芐青霉素購于北京鼎國昌盛生物技術有限公司， 用無菌超純水配成 100 mg·mL-1， 分裝在EP管中， -20 ℃凍存， 使用時每 1 mL 培養基加入 l μL， 終質量濃度為 100 μg·mL-1。

1.2 儀器與設備

紫外可見光分光光度計：SP-754型，上海天普分析儀器有限公司；超聲波破碎儀： 04711-45型，寧波新芝生物科技股份有限公司。

1.3 方 法

1.3.1 培養方法 種子培養方法：方法參見參考文獻[9]。

發酵培養及誘導產酶：將種子液按1%接種量接入裝有25 mL發酵培養基的250 mL三角瓶后，在30 ℃，180 r·min-1條件下培養2 h后加入 0.5 mL 滅過菌的L-阿拉伯糖溶液， 繼續培養22 h，獲取菌體。

1.3.2 粗酶液獲取方法 將發酵液離心取菌體2 g，向菌體中加入pH值為9.0的 Tri-HCl緩沖溶液20 mL，攪拌均勻后，在4 ℃下超聲波破碎，離心后取上清液即為粗酶液。

1.3.3 檢測方法 菌體量測定 ：發酵結束后，將稀釋適當倍數的發酵液放置分光光度計中，在波長為600 nm下測量吸光值。

KR酶活檢測：以COBE為底物， NADPH為輔酶，利用紫外可見光分光光度計在340 nm下，通過連續測定NADPH消耗量來計算酶活力，具體方法見參考文獻[10]。定義酶活：在40 ℃，pH值為6.0條件下，每分鐘消耗1 μmol NADPH所需要的酶量為1個國際單位（U）。

1.3.4 均勻設計及數據分析 本試驗采用均勻設計優化其發酵培養基，試驗數據采用 DPS 軟件進行逐步回歸分析[11]，篩選顯著變量，建立回歸方程，并通過回歸方程求取極值，得到最優培養基組成。

2 結果與分析

2.1 不同碳源對重組大腸桿菌的生長以及產KR的影響

碳源為微生物生長提供能量，不同微生物利用碳源物質的范圍各不相同，因此為重組菌選擇適合的碳源至關重要。本試驗以TB培養基為基礎培養基，將其碳源改為葡萄糖、甘油、蔗糖、麥芽糖、淀粉，每種碳源以不同的質量濃度（0.5%，1%，1.5%，2%，2.5%，3%）進行添加，其他成分不變， 按照1.3.1方法培養，在誘導發酵22 h后測定酶活和生物量，生物量以菌液OD600表示，結果如圖1。

由圖1可知，不同的碳源對重組大腸桿菌的生長以及產酶的影響很大。相較于其他三者，重組大腸桿菌對葡萄糖和甘油的利用率較好，當二者添加濃度分別為1%和1.5%時OD600達到最大值，分別為 22和 21。就產KR酶的情況而言，添加1%甘油時，酶活最大為70.25 U·mL-1。葡萄糖雖然能更好地促進菌體生長，但酶活產量不高。可能因為葡萄糖進入細胞中后通過糖酵解途徑，會產生丙酮酸，再經其他代謝途徑，會產生乳酸、乙酸等代謝副產物，而這些副產物會抑制KR的合成。選擇合適的碳源添加量非常重要，添加過高或過低對菌體生長和產酶都有一定的抑制作用。因此，基于生長與產酶兩方面考慮，選擇甘油為最佳碳源，且最佳添加濃度為1%。

2.2 不同氮源對重組大腸桿菌的生長以及產KR的影響

氮是微生物細胞中需要量僅次于碳的元素，分為有機態和無機態氮，不同菌種對不同來源的氮素利用程度不同[11]。前期試驗證實，當以無機氮為唯一氮源時，菌體生長和產酶受到了極大的抑制（發酵結束后，OD600低于2，酶活幾乎沒有），因此本試驗以考察不同有機氮源對重組大腸桿菌的生長以及產酶的影響。試驗設計：以甘油為碳源，添加濃度為1%，其他成分不變，將 TB 中的氮源（蛋白胨和酵母膏）替換為胰蛋白胨（Tryptone），牛骨蛋白胨（Beef peptone），酵母蛋白胨FP101，酵母浸出物FM888以及FM818，每種氮源以不同的質量濃度（2%，4%，6%，8%）進行添加，按照1.3.1方法培養，在誘導發酵22 h后測定酶活和生物量，結果如圖2。

潘冬瑞等[12]通過對FM888和FP101對大腸桿菌發酵的研究發現FM888中游離氨基酸含量高，可以迅速被大腸桿菌利用，能夠使菌體快速積累到最大值，而由于肽類含量較低，對于穩定期產酶的持續增效作用不夠，研究還發現當FM888與FP101以7∶3比例混合使用時，可將游離氨基酸和肽類含量調整到合適水平，既能滿足菌體快速生長的營養需求，又可促進鹵醇脫鹵酶的持續高效表達，增強發酵后勁。相較于FM888，FP101游離氨基酸含量稍低，肽類含量卻相對較高。從圖2也可以看出，相較于其他氮源FM888更有利于菌體生長，且當添加量為6%時高達26。而當以4%的FP101為氮源時，KR的酶活最高，為79.53 U·mL-1，說明KR的表達所需的氮源與潘冬瑞等[12]研究重組大腸桿菌產鹵醇脫鹵酶相似。因此結合文獻以及試驗結果選擇FM888和FP101為復合碳源，混合比為7∶3，總添加量為4%。

2.3 不同金屬離子對重組大腸桿菌的生長以及產KR的影響

金屬離子不僅可以調節和維持微生物生長過程中諸如滲透壓、氫離子濃度和氧化還原電位等生長條件，如 Na+和 Ka+有調節細胞滲透壓的作用[13]；還可以參與并穩定微生物細胞的結構，如Mg2+有穩定核糖體和細胞膜的作用；某些金屬離子甚至與酶的組成有關，如Mg2+、Zn2+和Cu2+是許多酶的激活劑[9]。本試驗考察Na+、Mg2+、Ca2+、Zn2+和Cu2+ 等5種金屬離子對重組大腸桿菌的生長以及產酶的影響。發酵培養基中分別添加Nacl， MgSO4· 7H2O， CaCl2， ZnSO4· 7H2O， CuSO4· 5H2O，每種物質以不同的濃度（0， 0.25， 0.5， 1.0， 2.0 g·L-1）進行添加，在甘油為1%，FM888與FP101分別為2.8%，1.2%，TB中其他成分不變條件下發酵，收獲菌體后所測得的結果如圖3所示。

圖3顯示，相較于空白組，5種金屬離子的添加對菌體的生長影響相對較小，但對KR的表達的影響較大，除Ca2+外，其他4種金屬離子在添加量合適的情況下均對酶活有一定的促進作用。尤其是Mg2+，當添加量為0.5 g·mL-1時，酶活達到80.73 U·mL-1。因此，發酵生產KR時，可以在培養基中添加0.5 g·L-1的MgSO4· 7H2O。

2.4 磷酸根離子對重組大腸桿菌的生長以及產KR的影響

在微生物菌體的能量代謝中，磷元素起重要作用。一方面，磷元素是構成三磷酸腺苷、核酸和脂類的重要組分，它的存在有利于能量的代謝；另一方面，培養基中的磷元素常以 PO43-的形式存在，能起緩沖 pH 值的作用。本試驗參考TB培養基，以K2HPO4和KH2PO4為培養基中PO43-來源，配置pH值 為7，離子濃度分別為0.01，0.05， 0.1，0.15，0.2 mol·L-1以及離子濃度為0.1 mol·L-1，pH值 分別為 6.0，6.5， 7.0， 7.5 ，8.0 的緩沖溶液，用磷酸緩沖溶液作為培養基中其他成分（甘油10，FM888 28，FP101 12，MgSO4· 7H2O 0.5）的溶劑配置相應的培養基，考察磷酸根離子的濃度以及培養環境的初始pH值對重組大腸桿菌的生長以及產KR的影響，其試驗結果如圖4所示。

由圖4可知，pH值為7時，磷酸鹽離子濃度對重組大腸桿菌的生長以及產酶的影響較小，根據測量結果可知，離子濃度在0.05～0.2 mol·L-1時KR酶活較高。反之，培養基的初始pH值對菌體繁殖以及產酶影響較大，結果顯示pH 值7 為最佳初始pH值。

2.5 均勻設計優化

單因素試驗已初步選出培養基的主要成分以及最優添加量。試驗結果顯示：選取甘油 10 g·L-1，酵母浸出物（FM888）以及酵母蛋白胨（FP101）7∶3混合物 40 g·L-1，七水硫酸鎂 0.5 g·L-1用pH值為7，離子濃度為0.05 mol·L-1的磷酸鹽配置基礎培養基有利于菌體的生長以及酶活的提高?；趩我蛩卦囼?，以KR酶活為響應值，利用均勻設計進一步優化培養基各成分的最優添加量。試驗因素以及試驗水平設計如表1。

用 DPS 軟件均勻設計模塊對表2的數據進行多元二次逐步回歸分析，得出酶活與各因素關系的方程為：

Y=-1 891.20+302.22X1 +15.62X2 +4 139.311X3-12.44X1×X1-8 728.25X3×X3-35.17X1×X4-181.66X2×X3+0.99X2×X4+3 575.811X3×X4

此方程回歸結果如表 3 所示。

模型的復相關系數 r= 0.999 7，修正的決定系數0.999 3，F= 350.17，P= 0.002 9，剩余標準差 S= 1.596，模型的各個變量在α=0.05的水平上均顯著，說明模型選擇比較恰當。優化后重組大腸桿菌產酮基還原酶培養基配方為：甘油 6.86 g·L-1、FM888 19.53 g·L-1、FP101 8.37 g·L-1、 MgSO4· 7H2O 2.50 g·L-1、 K2HPO4 14.96 g·L-1和 KH2PO4 7.34 g·L-1。酶活擬合結果為448.01 U·mL-1，實測結果為431.21 U·mL-1，與優化前酶活（70.25 U·mL-1）比較提高了5.13倍，說明該培養基配方較佳。

3 結 論

培養基是微生物的生活環境，其組成對微生物的生長和產物的形成有很大的影響，因此在建立一個發酵過程的時候，往往需要對所用的培養基進行優化。本試驗首先利用單因素試驗篩選了培養基組分并初步優化了各組分的添加濃度；其次，為了進一步考察各因素對酶活的相互影響，本試驗選定 U12（122×62）混合水平的均勻設計表對各因素的添加濃度在更小范圍進行優化；試驗最終優化得到的酶活高達431.21 U·mL-1，是優化前（TB培養基）酶活（70.25 U·mL-1）的5.13倍，較大幅度提高了KR生產效率，為KR酶的后續研究奠定了基礎，并對KR酶的工業生產具有一定的指導作用。

參考文獻：

[1] 樸文花，李平作，樸桂花，等. 酮基還原酶在Pichia pastoris中表達策略[J]. 延邊大學醫學學報， 2000， 23（4）： 239-242.

[2] Claodio F， Piero G. On the steric course of baker's yeast mediated reduction of alkyl 4-azido-and 4-bromo-3-oxobutyrate Synthesis of （R）-and （S）-carnitine [J]. Tetrohedron Letters， 1985， 26（1）： 101.

[3] 樸文花. 擲袍酵母酮基還原酶（KR）在Pihcaipastorsi和E.coli中的表達[D]. 延邊：延邊大學，2001.

[4] Hideali Y， Sakayu S， Michihiko K，et al.A novel NADPH-dependent aldehyde reductase， catalyzing asymmetric reduction of fl-keto acid esters， from Sporobolomyces salmonicolor： purification and characterization[J]. Fems Microbiology， 1990， 70（1）： 45-48.

[5] Colleen A C， Robert A P， Micheal A M， et al.Purification， characterization， cDNA cloning and expression of a novel ketoreductase from Zygosaccharomyces rouxii[J]. Eur J Biochem， 2000，267（17）： 5 493-5 501.

[6] Kathrin H， Jan H， Martin H， et al.Identification， Cloning， and Characterization of a novel ketoreductase from the Cyanobacterium Synechococcus sp. strain PCC 7942[J]. Appl Environ Microbiol， 2008， 74（21）： 6 697-6 702.

[7] 方開泰， 王元. 均勻設計與均勻設計表[M]. 北京： 科學出版社，1994.

[8] 左斌 ，胡超 ，謝達平. 均勻設計對大腸桿菌產谷氨酸脫羧酶培養基優化的應用[J].湖南農業大學學報：自然科學版，2008，34（5）：531-533.

[9] 潘冬瑞，李嘯，張瑤，等. Zn2+對基因工程大腸桿菌P84A/MC1061發酵生產鹵醇脫鹵酶的影響[J]. 天津農業科學， 2013，19（8）： 5-9.

[10] 石小丹，李嘯，羅宇笛，等. 發酵液中酮基還原酶活性測定方法的構建[J].中國釀造，2014，33（9）：151-155.

[11] 唐啟義， 馮明光. 實用統計分析及其 DPS 數據處理系統[M]. 北京：科學出版社， 2002.

[12] 潘冬瑞，李嘯，張瑤，等. 重組大腸桿菌E.coli P84A/MC 1061發酵生產鹵醇脫鹵酶的研究 [J] . 天津農業科學， 2013，19（7）：6-9.

[13] Joseph， S， David， WR. Expression of cloned genes in E.coli using IPTG-inducible promoters[M]// Joseph S， David W R. Molecular cloning： a laboratory manual. New York： Cold Spring Harbor Laboratory， Cold Spring Harbor， 2002：14-19.