茅臺(tái)醬香型酒糟中總黃酮及總多酚含量的測(cè)定

王興東，牟明月，任雅奇，許志玲，張前軍*，周清娣

（1.貴州大學(xué) 精細(xì)化工研究開發(fā)中心，貴州 貴陽(yáng) 550025；2.貴州大學(xué) 化學(xué)與化工學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550025；3.貴州茅臺(tái)酒股份有限公司，貴州 仁懷 564501；4.澳大利亞悉尼大學(xué) 化學(xué)學(xué)院，澳大利亞 悉尼 1797）

酒糟是白酒產(chǎn)業(yè)的最大副產(chǎn)物，由于采用的原料、生產(chǎn)工藝各不相同，造成酒糟中營(yíng)養(yǎng)成分種類與含量都各不相同[1-2]。赤水河流域醬香型酒糟是以當(dāng)?shù)厣a(chǎn)的糯性高粱和小麥為原料，經(jīng)酒曲發(fā)酵完后再蒸餾出酒后留下來的固形物，獨(dú)特原料與當(dāng)?shù)靥赜形⑸锶涸谡麄€(gè)發(fā)酵釀酒過程中發(fā)生了復(fù)雜的生物化學(xué)變化，生成多種化學(xué)成分。目前有關(guān)酒糟化學(xué)成分研究報(bào)道較少，王金華等[3]從酒糟中提取得到9.79%的水溶性戊聚糖；張世仙等[4-5]采用氣相色譜-質(zhì)譜法分析茅臺(tái)醬香型酒糟的香氣成分，并探索了從茅臺(tái)醬香型酒糟中提取水溶性膳食纖維的最佳工藝條件；張?jiān)迄i等[6]對(duì)白酒糟植酸提取條件進(jìn)行了優(yōu)化。黃酮和多酚類化合物屬于生理活性顯著、種類繁多的天然產(chǎn)物，大量研究表明，黃酮和多酚類化合物具有抗腫瘤、抗菌、抗病毒以及抗氧化等功效[7-8]，但迄今為止，國(guó)內(nèi)很少有對(duì)酒糟總黃酮和總多酚含量測(cè)定的研究和報(bào)道。

本研究對(duì)以槲皮素為對(duì)照品，采用紫外分光光度法測(cè)定茅臺(tái)醬香型酒糟中總黃酮含量；以沒食子酸為對(duì)照品，用Folin-Ciocateu比色法測(cè)定酒糟中總多酚含量，以期建立醬香型酒糟中總黃酮及總多酚含量測(cè)定方法，為綜合利用該地區(qū)酒糟資源，開發(fā)醫(yī)藥、保健等高附加值的產(chǎn)品奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

醬香型酒糟：貴州省仁懷市茅臺(tái)鎮(zhèn)。

槲皮素（純度為97%）：中國(guó)藥品生物制品藥物檢定所；沒食子酸（純度為98%）：貴州迪大生物有限公司；無水乙醇：天津市富宇精細(xì)化工有限公司；硝酸鋁、鎢酸鈉、硫酸鋰：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；硝酸鈉（NaNO3）、亞硝酸鈉（NaNO2）：成都金山化學(xué)試劑有限公司；氫氧化鈉：天津市永大化學(xué)試劑有限公司；鉬酸鈉：天津市化學(xué)試劑四廠；磷酸：重慶川江化學(xué)試劑廠；碳酸鈉：天津市北聯(lián)精細(xì)化學(xué)品開發(fā)有限公司。所用試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-2450紫外分光光度計(jì)：上海儀電分析儀器有限公司；SB-5200D超聲波清洗器：寧波新芝生物科技股份有限公司；RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、B-220恒溫水浴鍋：上海亞榮生化儀器廠；TP-114電子天平：美國(guó)丹佛儀器公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 總黃酮含量測(cè)定方法

總黃酮含量的測(cè)定采用紫外分光光度法。

（1）供試品溶液的制備

稱取干燥粉碎后的酒糟1.000 g于100 mL的圓底燒瓶中，加入50 mL體積分?jǐn)?shù)75%的乙醇回流2 h，回流3次，將3次濾液合并，旋干，再用體積分?jǐn)?shù)60%的乙醇溶液溶解，置于100 mL的容量瓶中，補(bǔ)加體積分?jǐn)?shù)60%乙醇溶液定容至刻度，搖勻，作為供試品溶液[9]。

（2）槲皮素標(biāo)準(zhǔn)曲線制作[9]

精密稱取槲皮素標(biāo)準(zhǔn)品0.021 g，用體積分?jǐn)?shù)60%的乙醇溶液定容于100 mL容量瓶中，得質(zhì)量濃度為0.210 g/L的槲皮素對(duì)照品溶液。

分別取質(zhì)量濃度為0.210 g/L的槲皮素標(biāo)準(zhǔn)品溶液0、2.5 mL、5.0 mL、7.5 mL、10.0 mL、12.5 mL，置于25 mL容量瓶中，加入體積分?jǐn)?shù)60%的乙醇溶液至12.5 mL，再加5%NaNO20.75 mL，搖勻，放置5 min，加入10%Al（NO3）3溶液0.75 mL，搖勻，放置5 min，加入4%NaOH溶液10 mL；分別用體積分?jǐn)?shù)60%的乙醇定容至刻度，搖勻，放置15 min[10]。分別在波長(zhǎng)510 nm處分別測(cè)其吸光度值，以槲皮素對(duì)照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。按照標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計(jì)算樣品中總黃酮的含量。

1.3.2 總多酚含量測(cè)定

總多酚含量的測(cè)定采用Folin-Ciocateu比色法。

（1）供試品溶液的制備

酒糟干燥粉碎后稱取2.000 g置于100 mL容量瓶中，加入30mL無水乙醇，加熱回流10h，抽濾后減壓濃縮成浸膏，無水乙醇溶解定容至100mL，過濾，濾液作為供試品溶液[12]。

（2）福林-酚（Folin-Ciocalteu）試劑的配制備

稱取鎢酸鈉25 g、鉬酸鈉6.25 g，然后加175 mL的水、12.5 mL的85%磷酸、25 mL的濃鹽酸，置于500 mL的圓底燒瓶中，加入沸石，加熱回流10 h，冷卻，再加硫酸鋰37.5 g、水12.5 mL和溴水適量，加熱煮沸15 min，得金黃色溶液，冷卻，過濾至250 mL的棕色容量瓶中，加水稀釋至刻度。臨用前加水一倍，搖勻[11-12]。

（3）沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作對(duì)照品溶液的制備

精密稱取沒食子酸0.025 7 g，用無水乙醇溶解，轉(zhuǎn)移至100 mL棕色容量瓶中，用無水乙醇稀釋至刻度，搖勻，即得質(zhì)量濃度為0.257 g/L的沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

精密吸取質(zhì)量濃度為0.257 g/L的沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液0、0.05 mL，0.15 mL、0.25 mL、0.35 mL、0.45 mL、0.55 mL置于25 mL容量瓶中，分別加入2.5 mL的Folin-Ciocalteu試劑、4mL10%Na2CO3溶液，用蒸餾水定容，搖勻，室溫條件下顯色80 min，分別在波長(zhǎng)765 nm處測(cè)定吸光度值[13]，以沒食子酸對(duì)照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。按照標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計(jì)算樣品中總多酚的含量。

1.3.3 顯色條件的確定[12]

（1）Folin-Ciocalteu試劑加入量的確定

精密吸取質(zhì)量濃度為0.257 g/L沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液0.2 mL 6份分別置于25 mL容量瓶中，分別加入（1.0 mL、1.5 mL、2.0 mL、2.5 mL、3.0 mL）Folin-Ciocateu試劑和4.0 mL 10%Na2CO3溶液，蒸餾水定容，搖勻，在室溫條件下顯色80 min，以相應(yīng)溶液為空白試劑，在波長(zhǎng)765 nm處測(cè)定吸光度值，確定Folin-Ciocalteu試劑的最佳加入量，整個(gè)試驗(yàn)過程避光操作。

（2）Na2CO3加入量的確定

精密吸取質(zhì)量濃度為0.257g/L沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液0.2mL 6份分別置于25 mL容量瓶中，分別加入2.0 mL、3.0 mL、4.0 mL、5.0 mL、6.0 mL 10%Na2CO3溶液和2.5 mL Folin-Ciocalteu試劑，蒸餾水定容，搖勻，在室溫條件下顯色80 min，以相應(yīng)溶液為空白試劑，在波長(zhǎng)765 nm處測(cè)定吸光度值，確定Na2CO3的最佳加入量，整個(gè)試驗(yàn)過程避光操作。

（3）顯色時(shí)間的確定

精密吸取質(zhì)量濃度為0.257g/L沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液0.2mL 6份分別置于25 mL容量瓶中，加入2.0 mL Folin-Ciocalteu試劑和4.0 mL的10%Na2CO3溶液，用蒸餾水定容，以不加入沒食子酸的為空白試劑，在室溫條件下顯色不同時(shí)間，分別在波長(zhǎng)765nm處測(cè)定吸光度值，確定顯色的最佳時(shí)間，整個(gè)試驗(yàn)過程避光操作。

2 結(jié)果與分析

2.1 槲皮素標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

以槲皮素質(zhì)量濃度（X）為橫坐標(biāo)，吸光度值（Y）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見圖1。

由圖1可知，槲皮素標(biāo)準(zhǔn)曲線線性回歸方程為Y=5.234 0X＋0.005 0，相關(guān)系數(shù)R2=0.997 6，說明槲皮素對(duì)照品在0.021 0～0.105 0 g/L質(zhì)量濃度范圍內(nèi)與吸光度值呈良好的線性關(guān)系。

圖1 槲皮素標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of quercetin

2.2 沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

以沒食子酸質(zhì)量濃度（X）為橫坐標(biāo)，吸光度值（Y）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見圖2。

圖2 沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Standard curve of gallic acid

由圖2可知，沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線線性回歸方程為Y=140.00X－0.005 8，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 7，說明沒食子酸在0.000 5～0.005 7 g/L質(zhì)量濃度范圍與吸光度值呈良好的線性關(guān)系。

2.3 總黃酮測(cè)定方法學(xué)考察

2.3.1 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一供試品溶液5.0 mL置于25 mL的容量瓶中，參照1.3.1方法配制后分別放置0、15 min、30 min、45 min、60 min后測(cè)定吸光度值，分別為0.235、0.242、0.236、0.232、0.239，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）=1.62%。供試品溶液制備后1 h內(nèi)穩(wěn)定，吸光度值無明顯變化。結(jié)果表明，該方法穩(wěn)定性良好。

2.3.2 精密度測(cè)定

取同一供試品溶液5.0 mL 5份，參照1.3.1方法配制后以不加供試品的相應(yīng)溶液作為空白試劑，測(cè)定其吸光度值，分別為0.205、0.203、0.213、0.206、0.208，RSD=1.84%。結(jié)果表明，該方法精密度良好。

2.3.3 重復(fù)性試驗(yàn)

稱取同一批干燥粉碎后的酒糟5份，每份1.000 g，按照1.3.1操作制備供試品溶液，取其5.0 mL供試品溶液置于25 mL的容量瓶中，測(cè)定其吸光度值，結(jié)果分別為0.211、0.222、0.202、0.223、0.235，RSD=5.76%。結(jié)果表明，該方法重復(fù)性良好。

2.3.4 加標(biāo)回收率試驗(yàn)

稱取同一批干燥粉碎后的酒糟5份，每份0.500 0 g，置于100 mL的圓底燒瓶中，按照1.3.1的方法制成供試品溶液，精密加入對(duì)照品適量，測(cè)定吸光度值并計(jì)算回收率，結(jié)果見表1。

表1 總黃酮測(cè)定加標(biāo)回收率試驗(yàn)結(jié)果Table 1 Results of adding standard recovery rate tests for total flavonoids determination

由表1可知，酒糟中總黃酮的回收率為98.37%～100.02%，平均回收率為99.12%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.61%，說明該方法的準(zhǔn)確度較好，能滿足酒糟中總黃酮的檢測(cè)要求。

2.4 福林酚法顯色條件的確定

2.4.1 試劑加入量的確定

圖3 Folin-Ciocalteu試劑加入量對(duì)吸光度值的影響Fig.3 Effect of Folin-Ciocalteu reagent addition on absorbance value

由圖3可知，隨Folin-Ciocalteu試劑的加入量的增加，吸光度值先下降后上升，最后下降，這可能是由于酒糟乙醇溶液本身呈黃色，隨著Folin-Ciocalteu試劑的加入，W+6與體系中酚羥基作用還原成藍(lán)色W+5，與酒糟溶液顏色產(chǎn)生消減，吸光度值降低，當(dāng)Folin-Ciocalteu試劑加到最大量后，體系中的酚羥基作用完全形成深藍(lán)色復(fù)合物，吸光度值達(dá)到最大值。當(dāng)Folin-Ciocalteu試劑體積為2.0 mL時(shí)吸光度值到達(dá)最低，為0.271；當(dāng)Folin-Ciocalteu試劑體積為2.5 mL時(shí)吸光度值到達(dá)最高，為0.284。因此，選擇Folin-Ciocalteu試劑最佳加入量為2.5 mL。

圖4 10%Na2CO3加入量對(duì)多酚含量的影響Fig.4 Effect of 10%Na2CO3addition on absorbance value

2.4.2 Na2CO3加入量的確定光度值，結(jié)果分別為0.323、0.322、0.323、0.323、0.323，RSD=0.138%，可以看出在顯色80 min后的40 min內(nèi)吸光度值變化不大，說明該方法穩(wěn)定性良好。

2.5.3 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

重復(fù)1.3.2方法制備供試品溶液。精密吸取0.6 mL供試品溶液，依照1.3.2方法測(cè)定吸光度值，結(jié)果分別為0.316、0.306、0.308、0.323、0.320，RSD=2.35%，結(jié)果表明，該方法重復(fù)性良好。

2.5.4 加標(biāo)回收率試驗(yàn)

稱取同一批酒糟5份，每份1.000 g左右，依照1.3.2方法制備供試品。精密加入對(duì)照品適量，參照1.3.2方法測(cè)定吸光度值并計(jì)算回收率，結(jié)果見表2。

由圖4可知，隨著Na2CO3溶液加入量的增加，總多酚含量也隨之增加，當(dāng)10%Na2CO3體積為5.0 mL時(shí)，吸光度值為最大。之后稍有下降，因此，選擇10%Na2CO3溶液的最佳加入量為5.0 mL。

2.4.3 顯色時(shí)間的確定

表2 總多酚測(cè)定加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 Result of adding standard recovery rate tests for total polyphenol determination

圖5 顯色時(shí)間對(duì)吸光度值的影響Fig.5 Effect of reaction time on absorbance value

由圖5可知，隨著顯色時(shí)間的延長(zhǎng)，吸光度值呈上升趨勢(shì)，說明多酚含量也逐漸增加。當(dāng)顯色時(shí)間為80 min時(shí)，吸光度值最大，之后隨著顯色時(shí)間的增長(zhǎng)吸光度值趨于平緩，因此選擇顯色時(shí)間為80 min。

2.5 多酚測(cè)定方法學(xué)考察[14-15]

2.5.1 精密度試驗(yàn)

精密吸取同一供試品溶液5份0.6 mL分別置于25 mL容量瓶中，參照1.3.2方法測(cè)定吸光度值，結(jié)果分別為0.318、0.316、0.319、0.317、0.317，RSD=0.359%。結(jié)果表明，該方法精密度良好。

2.5.2 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

精密吸取0.6 mL供試品溶液至25 mL容量瓶中，參照1.3.2方法配制后在波長(zhǎng)765 nm處每隔10 min測(cè)定一次吸

由表2可知，測(cè)定酒糟中總多酚的加標(biāo)回收率為99.40%～100.31%，平均加標(biāo)回收率為99.82%，檢測(cè)結(jié)果相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.33%，說明該方法具有良好的準(zhǔn)確性，能滿足酒糟中總多酚的檢測(cè)要求。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)分別以槲皮素和沒食子酸為標(biāo)準(zhǔn)品，建立了測(cè)定酒糟中黃酮和多酚含量的紫外分光光度法和Folin-Ciocalteu比色法，確定了Folin-Ciocalteu比色法最優(yōu)的測(cè)定條件：加入Folin-Ciocalteu試劑2.5 mL、10%Na2CO3溶液4 mL，室溫下顯色80 min。結(jié)果表明，茅臺(tái)醬香型酒糟中總黃酮含量為20.40 mg/g，總多酚含量為4.78 mg/g?？傸S酮及總多酚分別在0.021 0～0.105 0 g/L（R2=0.997 6）和0.000 51～0.005 765 g/L（R2=0.999 7）與吸光度值線性關(guān)系良好，平均回收率分別為99.12%、99.82%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）分別為0.609%、0.33%。本方法操作簡(jiǎn)單，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，穩(wěn)定性和重復(fù)性良好，適用于醬香型酒糟中黃酮和多酚的定量測(cè)定。茅臺(tái)醬香型酒糟中具有一定含量的黃酮和多酚類化合物，具有醫(yī)藥、化學(xué)品、食品等方面的開發(fā)前景，為酒糟的深度開發(fā)利用提供了參考價(jià)值。

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