遼寧省炭疽芽胞桿菌MLVA分型研究

毛玲玲，田 疆，雷 露，劉學升，張 巍，張眉眉，韓 悅，姚文清

遼寧省炭疽芽胞桿菌MLVA分型研究

毛玲玲1，田 疆1，雷 露1，劉學升1，張 巍2，張眉眉1，韓 悅1，姚文清1

目的 了解遼寧地區炭疽芽胞桿菌的流行特征及菌型基因特征。方法 通過多位點可變數目串聯重復序列(Multiple locus variable numbers of tandem repeats analysis，MLVA)分型實驗，對2001—2011年遼寧省分離到的6株炭疽芽胞桿菌分離株DNA進行檢測，DNA指紋圖譜使用BioNumerics 4.0 軟件進行統計分析，得出聚類分析結果。結果 聚類分析發現，6株炭疽芽胞桿菌株可分為2個基因型。對于炭疽暴發而言，其可變數目串聯重復序列遺傳標記具有高度相似性。結論 炭疽芽胞桿菌基因組中的串聯重復序列可作為炭疽芽胞桿菌基因分型的指標，在炭疽暴發事件中的病原體溯源上具有重要的意義。

炭疽芽胞桿菌；多位點可變數量串聯重復序列分析；基因分型

炭疽(Anthrax)是由炭疽芽胞桿菌(Bacillusanthracis)引起的一種人獸畜共患傳染病，對農業和人類造成嚴重損害[1]。人類主要是通過接觸患畜、進食感染炭疽的牲畜肉類、吸入含有菌體或芽胞的氣溶膠、塵埃以及接觸污染病菌的皮毛而感染本病。炭疽芽孢桿菌耐受不良環境的能力及其傳染性和強致病性，使其成為首選的生物戰劑之一，曾多次被恐怖分子用來發動生物恐怖襲擊。

多位點可變數目串聯重復序列(Multiple locus variable numbers of tandem repeats analysis，MLVA)[2]是近年發展起來的以PCR 為基礎，根據被檢菌株散在于基因組中不同位點的、變數量串聯重復序列(variable number tandem repeat，VNTR)的重復單元拷貝數的差異來進行分子分型的技術。Keim等選擇炭疽芽胞桿菌6個染色體上的VNTR位點和2個質粒上的VNTR位點建立了MLVA-8[3]。歷史上遼寧省很多地區都發生過炭疽疫情，并于近十年間多次發生較大規模暴發疫情，尤其是發生于2011年的炭疽疫情，波及我省2個地市，發病人數達30多例。為了解遼寧地區炭疽芽胞桿菌的流行特征及菌型基因特征，采用MLVA分型方法對遼寧省10年間分離到的6株炭疽芽胞桿菌進行基因分型研究。

1 材料與方法

1.1 材料 2001—2011年間，遼寧省分離自病人、外環境的6株炭疽芽胞桿菌分離株，經生化、藥敏及噬菌體鑒定。菌株詳細資料見表1。

1.2 主要儀器與試劑 核酸提取應用QIAGEN EZ1全自動核酸提取工作站，引物、Premix Ex Taq均由大連寶生物技術有限公司提供，PCR產物測序工作由北京英俊生物工程技術服務有限公司完成。

1.3 方法 采用MLVA-8(8位點可變數目串連重復序列)分型方法，引物序列、擴增體系及反應條件見文獻[1，3]，表2。MLVA反應體系包括10×緩沖液(Mg2+1.5 mol/L)2.5 μL，dNTP(2.5 mmol/L)2 μL，Taq酶(2.5 U/μL)0.5 μL，引物(10 pmol/μL)各1 μL，DNA模板1 μL，用滅菌蒸餾水補至25 μL。擴增參數：95℃預變性5 min，然后以95 ℃變性20 s、60 ℃退火20 s、65 ℃延伸3 0s，進行34個循環，末輪65 ℃延伸5 min。PCR產物由北京英俊生物工程技術服務有限公司進行測序，得到產物片段的大小。

1.4 數據分析 根據PCR產物大小，采用Bio Numerics 4.0軟件，利用非加權配伍組平均法(unweighted pair group method with arithmetic mean，UPGMA)聚類分析。

表1 菌株背景資料

表2 炭疽芽胞桿菌MLVA-8引物序列

2 結 果

采用MLVA-8分型方法(vrrA、vrrB1、vrrB2、vrrC1、vrrC2、CG3、pxO1、pxO2)對6株炭疽芽胞桿菌進行分析。根據其產物大小聚類分析發現，6株炭疽芽胞桿菌株可聚類為2個基因型(見圖1)。基因1型中包含2株菌，分離于2011年暴發疫情的2個病例。基因2型中包含分離自兩個地區不同年份的4株炭疽菌。

3 討 論

目前，基因分型技術廣泛應用于各種病原微生物的研究，MLVA方法是眾多基因分型方法中較為成熟的一種[2]。MLVA具有快速簡便、分辨力高和重復性好、結果易于數字化的特點。目前該方法已廣泛應用于鼠疫耶爾森菌、結核分枝桿菌[2]、布魯氏菌以及腸炎沙門菌等一些細菌的分型分析。由于炭疽芽孢桿菌遺傳變異水平低的特點，MLVA是少數幾種可用于鑒別炭疽芽孢桿菌菌株之間差異的分子分型方法。Keim等[3]選擇炭疽芽胞桿菌6個染色體上的VNTR位點和2個質粒上的VNTR位點建立MLVA-8后，對全世界各地所分離的426株炭疽芽孢桿菌進行MLVA分析，鑒定出89個基因型，聚類分析分為6個主要基因群，其中A3集群分布非常普遍。我國王秉翔等[1]用MLVA8分析來自中國的193株炭疽芽孢桿菌菌株，并揭示了21種新的基因型；聚類分析顯示A、B、C等3個集群。魏建春等[4]選取11個位點，對109株來自全國的炭疽菌株進行了分析，結果提示新疆的菌株類型較復雜。

圖1 6株炭疽芽胞桿菌MLVA聚類分析圖

本研究采用炭疽芽胞桿菌MLVA-8分型引物，對我省的炭疽芽胞桿菌進行分析。結果表明， 6株炭疽芽胞桿菌株可聚類為2個基因型，將其基因型與Keim[3]的結果相對照，均屬于常見的A3集群，該集群在我國分布最為廣泛。對照王秉翔[1]的研究結果，基因1型曾在北京、廣西、河北、山東、新疆的炭疽分離株中發現，在遼寧發現此基因型尚屬首次。本次研究中的基因2型與王秉翔[1]的研究結果一致。有4株分離株聚類到基因2型中，這4株菌分離于兩個地區的不同年份，該基因型是否為遼寧本地主要流行型別尚待進一步監測研究證實。本次研究中的1、2、3號分離株來源于2001年的暴發疫情及其監測，5、6號分離株分離于2011年同一起暴發疫情的2個病例，相同暴發疫情的分離株同源性達100%，因此對于暴發疫情分離到的炭疽菌株而言，其可變數目串聯重復序列遺傳標記具有高度相似性。

MLVA技術在炭疽感染事件中追溯傳染源，甚至菌株的鑒定方面，是一種很好的分析方法。2001年美國“9.1l”炭疽恐怖事件，Hoffmaster等[5]應用MLVA技術分析了來自炭疽事件標本分離到的135株菌，所有的菌株都為同一基因型，并且與實驗室使用的Ames菌株一致。Keim等[3]應用MLVA技術對日本奧姆真理教炭疽事件中的菌株進行了回顧性研究，發現48株菌有一致的基因型，與Sterne菌株的基因型一致。

綜上所述，通過MLVA分析可以從分子流行病學角度及時發現暴發疫情。對傳染源的追蹤，暴發流行調查、生物恐怖事件病原體的溯源具有重要的作用。因此建立我省的炭疽芽胞桿菌菌株MLVA數據庫資料，對于炭疽的防控、打擊恐怖主義和反生物武器具有重要意義。

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[2]Barlow RE, Gascoyne-Binzi DM, Frothingham R, et al. Rapid identification of laboratory contamination withMycobacteriumtuberculosisusing variable number tandem repeat analysis[J] . J Clin Microbiol, 2001, 39(1): 69-74. DOI: 10.1128/JCM.39.1.69-74.2001

[3]Keim P, Price LB, Klevytska AM, et al. Multiple-locus variable-number tandem repeat analysis reveals genetic relationships withinBacillusanthracis[J]. J Bacterio1, 2000, 182(10): 2928-2936. DOI: 10.1128/JB.182.10.2928-2936.2000

[4]Wei JC, Zhang EM, Zhang HJ, et al. Characteristics and distribution of 11 variable number tandem repeats ofBacillusanthracisin China[J]. Chin J Zoonoses, 2012, 28(8): 765-768. (in Chinese) 魏建春, 張恩民, 張慧娟, 等. 中國炭疽芽胞桿菌中11個串聯重復序列位點的特征和分布[J] . 中國人獸共患病學報, 2012, 28(8)：765-768.

[5]Hoffmaster AR, Fitzgerald CC, Ribot E, et al. Molecular subtyping ofBacillusanthracisand the 2001 bioterrorism--associated anthrax outbreak, United States bioterrorism-related anthrax[J]. Emerg Infect Dis, 2002, 8(10): 1111-1116.

Bacillusanthracisisolates analysis by multiple-locus variable-numbers of tandem repeats analysis, Liaoning, China

MAO Ling-ling1,TIAN Jiang1,LEI Lu1,LIU Xue-sheng1, ZHANG Wei2,ZHANG Mei-mei1,HAN Yue1,YAO Wen-qing1

(1.LiaoningCenterforDiseaseControlandPrevention,Shenyang110005,China; 2.AnshanCenterforDiseaseControlandPrevention,Anshan114009,China)

The epidemic characteristics and genotype ofBacillusanthracisstrains in Liaoning Province, China was analyze in this study. SixBacillusanthracisstrains from 2001 to 2011 were studied with multiple-locus variable-number tandem repeat analysis (MLVA). BioNumerics4.0 software was used to analyze the DNA fingerprint of statistics, and cluster analysis results were obtained. Clustering analysis found that the 6 strains could be divided into two genotypes. For anthrax outbreaks, the genetic markers of multiple-locus variable-number tandem repeat were highly similar. It's suggested that MLVA is quite useful for investigation of strain relatedness in regions of outbreaks.

Bacillusanthracis; multiple locus variable numbers of tandem repeats analysis; genotype

Yao Wen-qing, Email: yaowenqing@lncdc.com

10.3969/cjz.j.issn.1002-2694.2015.03.009

國家科技重大專項 艾滋病和病毒性肝炎等重大傳染病防治項目(2012ZX10004-209)

姚文清， Email: yaowenqing@lncdc.com

1.遼寧省疾病預防控制中心， 沈陽 110005； 2.鞍山市疾病預防控制中心,鞍山 114009；

R378.7

A

1002-2694(2015)03-0232-03

Supported by the National Sci-Tech Key Project of China (No. 2012ZX10004-209)

2014-05-29；

2014-10-09