衰老模型聯合β－淀粉樣蛋白1－42建立大鼠阿爾茨海默病模型研究

張淑萍，劉璐，王秀梅，黃作義，宣兆博，楊麗敏，吳成吉，劉文娟

·論著·

衰老模型聯合β－淀粉樣蛋白1－42建立大鼠阿爾茨海默病模型研究

張淑萍，劉璐，王秀梅，黃作義，宣兆博，楊麗敏，吳成吉，劉文娟

目的以3月齡大鼠用D－半乳糖制作衰老模型后聯合β－淀粉樣蛋白1－42(Aβ1－42)制作模擬程度更高、更理想的阿爾茨海默病(AD)大鼠模型。方法2013年3月—2014年3月選取SD清潔級雄性3月齡大鼠60只，12月齡大鼠40只，通過Morris水迷宮實驗后，采用隨機數字表法分為5組:3月齡假手術組20只、3月齡對照組20只、3月齡造模組20只、12月齡對照組20只、12月齡造模組20只。3月齡造模組大鼠采用D－半乳糖皮下注射制作衰老模型，觀察一般狀態、體質量變化，檢測血中超氧化物歧化酶(SOD)及脂質過氧化物(MDA)表達水平。3月齡造模組與12月齡造模組大鼠采用Aβ1－42腦內海馬區注射制作AD模型，Morris水迷宮實驗測試各組大鼠逃避潛伏期和航行距離，觀察各組大鼠海馬區神經元形態改變，對比3月齡對照組、3月齡造模組與12月齡造模組大鼠胸腺指數及脾臟指數。結果大鼠體質量比較，造模與時間有交互作用(P＜0．05);3月齡對照組與3月齡造模組大鼠組間體質量比較，差異有統計學意義(P＜0．05);時間間比較，差異有統計學意義(P＜0．05)。3月齡對照組與3月齡造模組大鼠第4、5周體質量比較，差異有統計學意義(P＜0．05);3月齡對照組大鼠不同時間體質量比較，差異有統計學意義(F=85．302，P＜0．05);3月齡造模組大鼠不同時間體質量比較，差異無統計學意義(F=1．371，P＞0．05)。3月齡造模組和12月齡對照組大鼠血清SOD水平較3月齡對照組降低，MDA水平較3月齡對照組升高(P＜0．05);3月齡造模組與12月齡對照組大鼠血清SOD、MDA水平比較，差異無統計學意義(P＞0．05)。3月齡造模組、12月齡造模組大鼠逃避潛伏期和航行距離較3月齡假手術組、3月齡對照組和12月齡對照組延長(P＜0．05)。組織病理學檢查示，各造模組海馬CA1區可見神經元受損，呈現退行性改變，細胞核形態不規則，細胞結構被破壞，線粒體、內質網腫脹，線粒體塉消失。3月齡造模組和12月齡造模組大鼠胸腺指數和脾臟指數較3月齡對照組降低(P＜0．05);3月齡造模組與12月齡造模組大鼠胸腺指數和脾臟指數比較，差異無統計學意義(P＞0．05)。結論以3月齡大鼠通過皮下注射D－半乳糖制作衰老模型的基礎上，在大鼠雙側海馬區注射Aβ1－42制備的AD模型，更能耐受后續抗AD藥物的干預實驗。

阿爾茨海默病;D－半乳糖;淀粉樣β肽類;模型，動物

張淑萍，劉璐，王秀梅，等．衰老模型聯合β－淀粉樣蛋白1－42建立大鼠阿爾茨海默病模型研究［J］．中國全科醫學，2015，18(36):4459－4463．［www．chinagp．net］

Zhang SP，Liu L，Wang XM，et al．Building rat Alzheimer disease model by combining aging model andβ－amyloid peptide 1－42［J］．Chinese General Practice，2015，18(36):4459－4463．

中國已步入老齡化社會，癡呆的發病率逐年遞增，阿爾茨海默病(AD)作為癡呆的主要類型，占癡呆總數的70%［1］。目前治療AD無特效藥物，不能治愈，僅能緩解病情［2］。AD發病機制尚不清楚，有多種學說試圖闡明其病因:膽堿能性假說、淀粉樣蛋白質假說、微管相關蛋白質假說及最新提出的軸突漏假說［3］等。學者們建立了多種制作AD模型的方法，靈長類存在記憶、認知功能障礙的老年動物過于昂貴，數量太少［4］。慢性缺血癡呆模型制作比較簡單，但病理改變廣泛，不適于做AD模型，以自然衰老為基礎的AD動物模型存在記憶、認知功能障礙，但老年大鼠較難得到，實驗耐受能力差，因此在幼鼠致衰老基礎上制作AD模型更為理想。制作衰老模型的研究中，有代謝學說、免疫系統退化學說和自由基學說［5］等。代謝學說是我國學者最早提出的致衰老學說［6］，認為在限定時間內給予動物注射大劑量D－半乳糖使其達到較高水平進而出現代謝紊亂、細胞腫脹和功能障礙，達到衰老模型標準［7］。海馬和皮質出現大量的細胞外老年斑(SP)和細胞內神經纖維纏結(NFT)是AD的主要病理學特征。β－淀粉樣蛋白(Aβ)為SP的主要成分，Aβ的生成和蓄積是AD發病的關鍵環節［8］。鑒于此，本實驗以皮下注射D－半乳糖制作大鼠衰老模型為基礎聯合Aβ1－42，獲得模擬程度高、更耐受實驗的AD大鼠模型。

1材料與方法

1．1主要試劑Aβ1－42的配制:稱取Aβ1－42 10 g溶于無菌0．9%氯化鈉溶液，稀釋并定容至1 000 ml。恒溫水浴箱中37℃孵育5 d，使其聚合成凝集狀態。Aβ在可溶狀態下是相對無毒的，但Aβ轉變為不溶狀態是AD發病中的一個關鍵環節［9］。

1．2模型制作2013年3月—2014年3月選取Sprague Dawley(SD)清潔級雄性3月齡大鼠60只，體質量320～380 g，12月齡大鼠40只，體質量350～420 g，由長春億斯實驗動物技術有限公司提供，合格證號scxk (吉)－2013－0006，均在佳木斯大學動物實驗中心飼養，自由飲食，明暗各12 h。而后進行Morris水迷宮實驗，將大鼠面向池壁從東南西北4個方向放入水中，計算大鼠在120 s內找到平臺的時間，若大鼠超過120 s仍未找到平臺，則由實驗操作者引導大鼠至平臺后重新實驗，若仍不能找到則剔除。每天訓練3次，共訓練2 d。將通過篩選的大鼠采用隨機數字表法分為5組:3月齡假手術組20只、3月齡對照組20只、3月齡造模組20只、12月齡對照組20只、12月齡造模組20只。3月齡造模組大鼠頸背部皮下注射D－半乳糖0．125 g·kg－1·d－1，連續40 d，建立衰老模型［10］。3月齡假手術組大鼠頸背部皮下注射等量0．9%氯化鈉溶液，3月齡對照組大鼠不做處理。監測注射期間3月齡對照組及3月齡造模組大鼠的一般狀態及體質量變化，40 d后選取3月齡對照組、3月齡造模組及12月齡對照組大鼠各10只，10%水合氯醛麻醉，心腔穿刺取血，測血清中超氧化物歧化酶(SOD)及脂質過氧化物(MDA)表達水平。將3月齡造模組和12月齡造模組大鼠固定于大鼠立體定位儀上，頭頂正中做縱向切口，以前囟為基準，從正中旁2．2 mm前囟后3．0 mm，以牙科鉆鉆開顱骨［11］，用微量注射器吸取孵育好的Aβ1－42，雙側海馬緩慢注射10 min，留針5 min。在縫合切口處撒少許青霉素粉劑，連續3 d腹腔注射青霉素4萬U;3月齡假手術組大鼠注射等量0．9%氯化鈉溶液，3月齡對照組和12月齡對照組大鼠不做處理。

1．3 Morris水迷宮實驗［12］14 d后進行Morris水迷宮實驗，水迷宮為一不銹鋼圓形水池，直徑120 cm、高50 cm、水深30 cm。池壁標明W、S、E、N作為個4入水點，由此以通過水池中心的2條垂直交叉線將水池等分為東北、西北、西南、東南4個象限。任選其中1個象限，正中放立1個直徑10 cm、高28 cm的平臺。各組取10只大鼠頭背部用苦味酸標記顏色，便于攝像跟蹤記錄。池壁上方懸掛一標志物作為近距離視覺暗示，水池周圍有一些位置不變的參照物，作為遠距離視覺暗示，大鼠可憑此來定位平臺。自動記錄系統包括監視器、攝像機和計算機，攝像機安放在水池上方，與監視器和計算機系統相連接。水溫控制在25℃左右，將大鼠面向池壁分別從4個入水點放入水中，記錄其在120 s內尋找到平臺的時間(逃避潛伏期)。如果大鼠未找到平臺，潛伏期算作120 s。而后撤除平臺，將大鼠從任選的非平臺象限入水點面向池壁放入水中，記錄大鼠120 s內在平臺象限的游泳距離(航行距離)。

1．4組織病理學觀察Morris水迷宮實驗后，每組采用隨機數字表法選取5只大鼠，10%水合氯醛麻醉后，開胸暴露心臟，找到升主動脈并插管至根部，再以4℃的4%多聚甲醛磷酸鹽緩沖液(PBS)灌注固定，剝離腦組織，置入4℃冰箱。次日切取視交叉后4 mm小腦之間的部分，即海馬部位的組織塊1 cm3作為電鏡標本，浸入2%戍二醛溶液中。固定后超薄切片機切片，使用枸櫞酸鉛和醋酸鈾染色，透射電鏡拍照。

1．5胸腺指數及脾臟指數將3月齡對照組、3月齡造模組和12月齡造模組大鼠各10只腹腔注射麻醉后，稱量每只大鼠的體質量，通過心腔穿刺取血液后解剖大鼠，取出大鼠的胸腺和脾臟，并用電子天平稱量胸腺和脾臟的重量，通過如下公式算出大鼠的胸腺指數和脾臟指數。胸腺(脾臟)指數=胸腺(脾臟)濕重(g) /體質量(g)×100%。

1．6統計學方法采用SPSS 13．0統計學軟件進行數據處理，計量資料以(x±s)表示，3月齡對照組與3月齡造模組大鼠不同時間體質量比較采用重復測量方差分析，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用q檢驗。以P＜0．05為差異有統計學意義。

2結果

2．1 3月齡對照組與3月齡造模組大鼠一般狀態及體質量比較3月齡造模組大鼠造模后精神狀態逐漸變差，活動及進食逐漸減少，毛色發暗發黃且體質量增加緩慢，第4、5周時體質量增加接近停止。大鼠體質量比較，造模與時間有交互作用，差異有統計學意義(P＜0．05);3月齡對照組與3月齡造模組大鼠組間體質量比較，差異有統計學意義(P＜0．05);時間間比較，差異有統計學意義(P＜0．05)。3月齡對照組與3月齡造模組大鼠第4、5周體質量比較，差異有統計學意義(P＜0．05);3月齡對照組大鼠不同時間體質量比較，差異有統計學意義(F=85．302，P＜0．05);3月齡造模組大鼠不同時間體質量比較，差異無統計學意義(F =1．371，P＞0．05，見表1)。

2．2 3月齡對照組、3月齡造模組與12月齡對照組大鼠血清SOD、MDA水平比較3月齡對照組、3月齡造模組與12月齡對照組大鼠血清SOD、MDA水平比較，差異有統計學意義(P＜0．05);其中3月齡造模組和12月齡對照組大鼠血清SOD水平較3月齡對照組降低，MDA水平較3月齡對照組升高，差異有統計學意義(P＜0．05);3月齡造模組與12月齡對照組大鼠血清SOD、MDA水平比較，差異無統計學意義(P＞0．05，見表2)。提示衰老模型建造成功。

2．3 5組大鼠逃避潛伏期和航行距離比較5組大鼠逃避潛伏期和航行距離比較，差異均有統計學意義(P＜0．05);其中3月齡造模組和12月齡造模組大鼠逃避潛伏期和航行距離較3月齡假手術組、3月齡對照組和12月齡對照組延長，差異有統計學意義(P＜0．05，見表3)。

2．4各組大鼠海馬CA1區神經元結構3月齡假手術組、3月齡對照組和12月齡對照組大鼠海馬CA1區神經元細胞膜完整光滑，線粒體結構清楚，內質網整齊排列。3月齡造模組、12月齡造模組海馬CA1區可看到神經元受損，呈現退行性改變，細胞核形態不規則，細胞結構被破壞，線粒體、內質網腫脹，線粒體塉消失(見圖1)。

圖1各組大鼠海馬CA1區神經元超微結構(枸櫞酸鉛和醋酸鈾染色，×12 000)Figure 1 Ultrastructure of nerve cells in hippocampus CA1 area of each group

表1 3月齡對照組與3月齡造模組大鼠不同時間體質量比較(±s，g)Table1 Comparison of bodymassbetween 3－month controlgroup and 3－month model－building group at different time points

表1 3月齡對照組與3月齡造模組大鼠不同時間體質量比較(±s，g)Table1 Comparison of bodymassbetween 3－month controlgroup and 3－month model－building group at different time points

注:與3月齡對照組比較，aP＜0．05

組別只數第1周第2周第3周第4周第5周3月齡對照組20 325±12 346±16 382±15 417±11 436±18 3月齡造模組20 323±13 336±11 339±12 332±13a327±16aF 值＜0．001 F交互=44．226，F組間=245．633，F時間=37．337 P值P交互＜0．001，P組間＜0．001，P時間

表2 3月齡對照組、3月齡造模組與12月齡對照組大鼠血清SOD、MDA水平比較(x±s)Table2 Comparison of serum SOD and MDA levelamong3－month control group，3－month model－building group and 12－month control group

表3 5組大鼠逃避潛伏期和航行距離比較(x±s)Table 3 Comparison of escape latency and sailing distance among the five groups

2．5 3月齡對照組、3月齡造模組與12月齡造模組大鼠胸腺指數和脾臟指數比較3月齡對照組、3月齡造模組與12月齡造模組大鼠胸腺指數和脾臟指數比較，差異均有統計學意義(P＜0．05);其中3月齡造模組和12月齡造模組大鼠胸腺指數和脾臟指數較3月齡對照組降低，差異均有統計學意義(P＜0．05);3月齡造模組與12月齡造模組大鼠胸腺指數和脾臟指數比較，差異無統計學意義(P＞0．05，見表4)。

表4 3月齡對照組、3月齡造模組與12月齡對照組大鼠胸腺指數及脾臟指數比較(x±s，g/100 g)Table 4 Comparison of thymus and spleen index among 3－month control group，3－month model－building group and 12－month control group

3討論

如今AD發病率上升極快，嚴重危害人類健康。在科研中制造理想的衰老后的AD模型勢在必行。有文獻表明，SD大鼠連續注射大劑量D－半乳糖可使其行動緩慢和學習記憶能力下降［13］，腦內超氧陰離子自由基水平增高，MDA、脂褐素水平升高，SOD活性降低，加速細胞凋亡，使機體出現衰老現象。本實驗結果顯示，3月齡造模組大鼠與3月齡對照組比較，血清中SOD水平降低、MDA水平升高，與12月齡對照組大鼠無差異，提示3月齡大鼠衰老模型建立成功。

“Aβ級聯學說”［14］認為，Aβ有極其復雜的神經毒性作用，其生成與清除失衡是細胞內神經元纖維纏結的最主要原因［15］。Hardy等［16］在大鼠腦室內灌入Aβ，經Morris水迷宮實驗證實，大鼠出現認知功能障礙，結果顯示，Aβ灌注導致了中樞神經系統功能障礙。Aβ主要包括Aβ1－40、Aβ1－42和Aβ25－35等。通常所認為的Aβ多是指Aβ1－40或Aβ1－42［17］，黃濤波等［18］研究發現，Aβ1－40占90%，Aβ1－42占10%，Aβ1－42容易集聚而不易降解，毒性極大，是構成AD SP的最主要成分。在AD患者SP形成過程中，Aβ1－42是啟動因素，在模型動物腦室、海馬區注射孵育好的Aβ溶液，可使模型動物產生與AD相同的學習和記憶能力減低癥狀。所以本實驗在大鼠衰老模型基礎上腦內注射Aβ1－42旨在復制出最接近AD的癡呆模型。

本實驗結果顯示，3月齡造模組及12月齡造模組與12月齡對照組比較，大鼠平均逃避潛伏期和航行距離明顯延長，大鼠海馬CA1區神經元受損，呈退行性改變，提示造模成功。3月齡造模組和12月齡造模組大鼠胸腺指數和脾臟指數較3月齡對照組降低，由于12月齡大鼠活動及適應能力下降，抗應激能力較低，在實驗耐受方面明顯不如3月齡造模組，不能耐受后續的抗AD的藥物干預實驗。其次，3月齡大鼠較12月齡大鼠更容易獲得，節省實驗時間。

綜上所述，以3月齡大鼠注射D－半乳糖制作衰老模型后聯合Aβ1－42建立的AD模型是一種容易獲得且較為理想的動物模型，為進一步深入研究AD的發病機制及治療提供了更好的實驗平臺。腦內Aβ的沉積是引起AD退行性病變的重要因素，使學習記憶能力下降，但其確切作用機制還沒有很明確，有待于以后更深一步的實驗研究。

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Building Rat A lzheimer Disease M odel by Combining Aging M odel andβ－am yloid Peptide 1－42

ZHANG Shu－ping，LIU Lu，WANG Xiu－mei，et al．Department of Neurology，the First Affiliated Hospital of Jiamusi University，Jiamusi 154002，China

ObjectiveTo build ideal rat Alzheimer disease(AD)modelwith superior simulation on three－month rats using agingmodel built by D－galactose combiningβ－amyloid peptide 1－42(Aβ1－42)．M ethods We enrolled 60 threemonth cleaningmale SD rats and 40 twelve－month rats from March 2013 to March 2014．After the selection by Morris water maze，random number tablemethod was used to divide the subjects into 5 groups:3－month sham－operation group(n=20)，3－month control group(n=20)，3－month model－building group(n=20)，12－month control group(n=20)and 12－monthmodel－building group(n=20)．For 3－month rats，aging model was built using the subcutaneous infection of D－galactose，general state and changes in body mass were observed，and the expression of SOD and MDA in the blood were detected．For 3－month model－building group and 12－month model－building group，AD model was made in brain hippocampus by the injection of Aβ1－42;morris water maze was employed to measure mean escape latency and total sailing distance，morphological changes in neurons of hippocampus in rats of each group were observed．Comparison wasmade in thymus index and spleen index among 3－month control group，3－month model－building group and 12－month model－building group．Results In the comparison of body mass，there was interaction between model building and time with significant differences(P＜0．05);3－month control group and 3－month model building group were significantly different in body mass (P＜0．05);significant differences existed in bodymass at different time points(P＜0．05);3－month control group and 3－month model－building group were significantly different in the bodymass at4 weeks and 5 weeks(P＜0．05);3－month control group had significantly different bodymass at different time points(F=85．302，P＜0．05);3－month model－building group had not significantly different body mass at different time points(F=1．371，P＞0．05)．Compared with 3－month control group，3－month model－building group and 12－month control group were lower in serum SOD level and higher in MDA level (P＜0．05);3－month model－building group and 12－month control group were not significantly different in serum SOD level and MDA level(P＞0．05)．Three－month model－building group and 12－month model－building group had longer escape latency or sailing distance，compared with 3－month sham－operation group，3－month control group and 12－month control group(P＜0．05)．By histopathological examination，neuron damage could be observed in the hippocampus CA1 area of each model－building group with degenerative changes，irregular nucleus morphology，damaged cellular structure，swollen mitochondria and endoplasmic reticulum and disappeared mitochondria ridges．Compared with 3－month control group，3－month model－building group and 12－month model－building group were lower in thymus and spleen index(P＜0．05);3－month model－building group and 12－month model－building group were not significantly different in thymus and spleen index(P＞0．05)．Conclusion After agingmodel was built in 3－month rats by the subcutaneous injection of D－galactose，AD model was builtusing Aβ1－42 in bilateralhippocampus areas，which wasmore tolerant to the following intervention experiments ofanti－AD drug．

Alzheimer disease;D－galactose;Amyloid beta－peptides;Models，animal

R 741

A

10．3969/j．issn．1007－9572．2015．36．012

2015－02－24;

2015－09－01)

(本文編輯:陳素芳)

黑龍江省自然科學基金資助項目(C201242)

154002黑龍江省佳木斯市，佳木斯大學附屬第一醫院神經內科(張淑萍，王秀梅，黃作義，宣兆博，吳成吉，劉文娟);佳木斯大學(劉璐，楊麗敏)

黃作義，154002黑龍江省佳木斯市，佳木斯大學附屬第一醫院神經內科;E－mail:blcldxn@163．com