近紅外發光葡聚糖納米膠活體成像小鼠淋巴結

李潔靜 蔣蓓綺 宋焱艷 林 超 莊志剛△

(1同濟大學附屬第一婦嬰保健院乳腺外科 上海 200092;2同濟大學納米研究院 上海 200082)

近紅外發光葡聚糖納米膠活體成像小鼠淋巴結

李潔靜1蔣蓓綺1宋焱艷2林 超2莊志剛1△

(1同濟大學附屬第一婦嬰保健院乳腺外科 上海 200092;2同濟大學納米研究院 上海 200082)

目的 制備和研究熒光染料標記的葡聚糖納米膠,用于活體熒光成像小鼠腋窩淋巴結。方法 使用脫氧膽酸和熒光染料Cy7化學標記葡聚糖,通過透析法制備納米膠Dextran-Cy7;使用透射電子顯微鏡、動態光散射儀分別表征納米膠的形貌及大小;分光光度法標定Cy7的含量;用C57小鼠和DC2.4細胞分別評價Dextran-Cy7的體內、體外毒性;對10只正常昆明小白鼠經前掌注射Dextran-Cy7生理鹽溶液,使用活體熒光掃描成像系統觀察小鼠腋窩淋巴結的成像效果;淋巴結免疫熒光組化法觀察Dextran-Cy7在淋巴結內的分布。結果 Dextran-Cy7納米膠是直徑30～50 nm的球形納米顆粒,其在體內和體外都具有較低的細胞毒性,可作為近紅外發光探針活體熒光成像小鼠腋窩淋巴結;納米膠主要分布在淋巴結的巨噬細胞細胞內。結論 Dextran-Cy7納米膠細胞毒性低、生物相容性好,可作為納米熒光探針成像活體小鼠淋巴結。

淋巴結; 近紅外熒光成像; 熒光染料Cy7; 葡聚糖; 納米膠

惡性腫瘤已成為影響我國人民健康的重要疾病之一。淋巴結轉移的臨床診斷是目前腫瘤治療及術后化療方案的重要依據。前哨淋巴結活檢術是臨床診斷腫瘤細胞是否轉移淋巴結的常用方法。但臨床使用的淋巴結顯影劑亞甲藍有賴于手術醫師術中尋找藍染淋巴管并追蹤到藍染淋巴結,切除藍染淋巴結后,經病理檢查判斷是否有腫瘤細胞轉移。雖然染料法過程簡單、操作方便、安全性高,但由于染料分子尺寸小,易擴散到周圍組織和下級淋巴結,且易受脂肪組織干擾,臨床結果假陰性率較高。放射性核素膠體法,術前需用淋巴閃爍顯像來確定前哨淋巴結數目和位置,術中應用γ計數器探測儀尋找“熱”結節(即10 s計數值是普通淋巴結的十幾倍或幾十倍,蜂鳴度明顯高于周圍組織,為前哨淋巴結位置)并標記,取出標記處的淋巴結,經病理檢查判斷是否有腫瘤細胞轉移。放射性核素膠體法能準確定位深埋在脂肪組織下的前哨淋巴結,但是同位素標記物會對患者及施術者造成不可避免的放射性損傷,并且該項檢查操作復雜,還需要在手術室配備昂貴的醫療設備。本研究制備了近紅外熒光染料Cy7標記的葡聚糖納米膠(Dextran-Cy7),研究其作為熒光示蹤劑對淋巴結的熒光成像效果,并評價了該納米膠的毒性及其在淋巴結內的分布情況。

材 料 和 方 法

動物和試劑 葡聚糖膠(MW=10 000)由本課題組人員自行合成[1-2],熒光染料Cy7(北京泛博生物化學有限公司),Alarm blue檢測液(美國Invitrogen公司),正常羊血清封閉劑、FITC標記羊抗大鼠IgG、封片劑(上海威奧公司),大鼠抗小鼠抗體CD68(美國Bio-Rad公司),紫外分光光度計(美國Varian公司),納米粒度及電位分析儀(英國Malvern公司),透射電子顯微鏡(S-4800,日本Hitachi公司),熒光酶標儀(美國Thermo公司),活體熒光斷層成像儀(美國VisEn公司),倒置激光共聚焦顯微鏡(日本Nikon公司)。小鼠樹突狀細胞(DC2.4細胞,上海維奧生物科技有限公司)培養基類型:RPMI-1640培養基,10%胚胎牛血清,1%雙抗;培養條件:37 ℃,5% CO2。10只正常昆明小鼠,體質量20～25 g;10只C57小鼠,體質量20～25 g。每種雌雄各5只,均由同濟大學動物實驗中心提供。

Dextran-Cy7的制備 參考文獻[1]制備巰基化葡聚糖(Dextran-SH,取代度20)。Dextran-SH與2-吡啶半胱氨鹽酸鹽反應過夜后得到Dex-SS-NH2[2];運用EDC法活化激活脫氧膽酸(deoxycholic acid,DCA)的羥基;在室溫條件下與Dex-SS-NH2反應48 h后,得到Dex-SS-DCA,其結構可通過核磁共振譜圖進行分析。取Dex-SS-DCA(15 mg)和熒光染料Cy7(0.37 mg)溶于二甲基亞砜,室溫避光置于搖床反應48 h后,使用截流相對分子質量3 500的透析袋避光透析、凍干后得到Dextran-Cy7粉末。

Dextran-Cy7的基本特性檢測 取適量Dextran-Cy7粉末溶于磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered solution,PBS)中,用透射電子顯微鏡觀察其形態,用激光粒度儀檢測其粒徑和分布。

Dextran-Cy7載熒光染料Cy7量測定 用紫外分光光度計測定Dextran-Cy7溶液中Cy7的含量。分別配置濃度為0.375、0.75、1.5、3、6 μmol/L的Cy7溶液,以PBS為空白對照,繪制在750 nm波長下的吸光度-濃度標定曲線(Cy7在750 nm波長處有特征性吸收峰)。配置一定濃度的Dextran-Cy7在750 nm處用紫外光分光光度計檢測吸光度(D)值,根據標定曲線計算Cy7的含量。

Dextran-Cy7的細胞毒性檢測 使用Alarm blue 檢測液測試Dextran-Cy7對樹突細胞DC2.4的細胞毒性,將DC2.4細胞以10 000個/孔接種在96孔板內。37 ℃培養箱內培養24 h后,棄原液后加入濃度梯度為50、100、200、400、600、800、1 000 μg/mL的Dextran-Cy7溶液,37 ℃培養箱培養48 h后,棄原液加入200 μL/孔工作濃度的Alarm blue檢測液,37 ℃培養箱培養4 h后,每孔取出180 μL轉移到新的96孔板,用酶標儀檢測其在570、630 nm處的D值。

Dextran-Cy7的肝腎功能毒性檢測 配制濃度為5 μg/L的Dextran-Cy7溶液,按照12.5、25 mg/kg的劑量尾靜脈注射入兩組小鼠體內,分別喂養3和14天后處死,取肝臟和腎臟用4%甲醛溶液固定后,石蠟包埋,切片,HE染色。

小鼠淋巴結近紅外熒光成像 按1 mL/kg體質量腹腔注射4%水合氯醛麻醉實驗小鼠,用8%硫化鈉對檢查部位進行脫毛。制備2 pmol/L的 Dextran-Cy7納米膠的生理鹽溶液,小鼠左前掌墊皮下注射0.05 mL(5 mg/kg),并按摩注射部位,之后側臥位固定于成像臺,觀察近紅外熒光成像效果。取小鼠左側腋窩淋巴結、腹部脂肪和右側腋窩淋巴結,體外行近紅外熒光成像。

腋窩淋巴結免疫熒光組織化學染色 小鼠前掌墊皮下注射0.05 mL的Dextran-Cy7 (2 pmol/L) 1 h后,處死小鼠,取腋窩淋巴結行OCT包埋,-80 ℃冷凍。用恒溫組織切片機切片(厚度5 μm)并轉移到玻片上,用4 ℃丙酮固定5 min;PBS洗滌3次,再用1%羊血清室溫封閉1 h;PBS洗滌3次,滴加大鼠抗小鼠CD68抗體(標記小鼠淋巴結內巨噬細胞),放入濕盒,4 ℃過夜。第2天早上取出,室溫復溫30 min;PBS洗滌3次,滴加生物素化二抗,室溫孵育30 min;PBS洗滌3次,DAPI染色,室溫孵育5 min;PBS洗滌3次,滴加封片劑,蓋玻片覆蓋后干燥1 h,激光共聚焦顯微鏡下觀察切片熒光并拍照。

結 果

Dex-SS-NH2和Dex-SS-DCA的結構解析 Dex-SS-NH2和Dex-SS-DCA的核磁共振譜圖如圖1所示,經譜圖分析由出峰位置可知,其結構與核磁共振譜圖吻合。

Dextran-Cy7納米膠的特性 Dextran-Cy7近紅外造影劑外觀呈蓬松的粉末狀,水溶液呈均勻淡藍色乳液,分散度好。透射電鏡顯示:形態呈規則球形,表面光滑,大小較均一(圖2)。經激光粒度儀檢測,Dextran-Cy7的平均粒徑為30～50 nm,PDI為0.12。

圖1 Dex-SS-NH2和Dex-SS-DCA的核磁共振譜圖Fig 1 1H NMR spectrum of Dex-SS-NH2 and Dex-SS-DCA

圖2 Dextran-Cy7納米膠的透射電鏡照片Fig 2 TEM image of Dextran-Cy7 nanogel

Dextran-Cy7納米膠的Cy7含量 Cy7在0.375～6 μmol/L范圍內與D值呈良好的線性關系,得線性關系回歸方程:D=186 997×Cy7 (μmol/L)+0.0007 (R2=0.999)。從而計算得到Dextran-Cy7中Cy7的含量為14.7 nmol/mg。

Dextran-CY7納米膠的毒性 Alarm blue 檢測液測試Dextran-Cy7對DC2.4細胞的毒性,發現Dextran-Cy7 (50、100、200、400、600、800、1 000 μg/mL)對細胞幾乎無毒性,對細胞生存率無影響(圖3)。從病理切片看,短期(3天)內Dextran-Cy7(12.5 mg/kg)并未引起小鼠肝、腎細胞形態變化,長期(14天)Dextran-Cy7(25 mg/kg)也未引起腎組織結構及細胞的變化,但是會引起肝細胞水腫變性,肝小葉結構未破壞,無溶解壞死等病理改變(圖4)。

圖3 Dextran-Cy7納米膠的細胞毒性Fig 3 Cytotoxicity of Dextran-Cy7 nanogel

圖4 小鼠肝臟石蠟切片照片Fig 4 Photos of paraffin sections of mouse liver

小鼠腋窩淋巴結近紅外熒光成像 小鼠左前掌注射Dextran-Cy7造影劑后約30 min,運用近紅外活體熒光斷層成像系統觀察到注射側小鼠腋窩淋巴結顯像(圖5A),在熒光引導下進行定位并行淋巴結活檢,進一步證實熒光顯像的是小鼠腋窩淋巴結,而不是脂肪(圖5B)。

圖5 小鼠的活體熒光斷層成像照片Fig 5 Fluorescence tomography system Image of mouse in vivo

Dextran-Cy7在淋巴結內的分布 小鼠左前掌墊皮下注射Dextran-Cy7納米膠 1 h后,對淋巴結冰凍切片行免疫熒光染色,置于激光共聚焦顯微鏡下觀察,可以看出 Dextran-Cy7納米膠的熒光信號定位于巨噬細胞內(圖6)。這說明Dextran-Cy7納米膠是通過巨噬細胞吞噬富集在淋巴結內的。

討 論

前哨淋巴結具有引流原發腫瘤細胞的特性,是原發腫瘤細胞經淋巴結轉的第一站淋巴結[3-4]。目前臨床將前哨淋巴結活檢結果作為惡性腫瘤分期的標準之一[5]。染料法、放射性核素法以及二者聯合是目前國內外外科手術中常用的前哨淋巴結顯影方法[6]。雖然染料法過程簡單、操作方便、安全性高,但由于染料分子尺寸小易擴散到周圍組織和下級淋巴結,易受脂肪組織干擾,故臨床結果假陰性率較高[7]。放射性核素法能準確定位深埋在脂肪組織內的前哨淋巴結,然而同位素標記物會對患者及施術者造成不可避免的放射性損傷,且該項檢查操作復雜,還需要在手術室配備昂貴的醫療設備[5]。

圖6 小鼠腋窩淋巴結熒光免疫組化的共聚焦顯微照片(×60)Fig 6 Confocal micrographs of immunohistofluorescence analysis of mouse′s axillary lymph node (×60)

近年來,使用近紅外熒光探針定位前哨淋巴結是熱門研究[8]。近紅外光譜為700～1 000 nm,在該范圍人體背景熒光較弱且光散射低,能夠顯像深層組織,很適合活體成像[9],近紅外掃描對乳腺腫塊的診斷也有一定價值[10]。近紅外熒光探針,如量子點(quantum dot)[10]、吲哚花菁綠(indocyanine green)[12]、七甲川花青染料(heptamethine cyanine dye)[13]等,已經被用于動物體內淋巴結成像及臨床試驗。但由于這些熒光染料分子粒徑小,很快就流入下級淋巴結及彌散到周圍組織,干擾了成像效果。此外,量子點內包含金屬離子,對機體有一定的毒害作用,限制了其在臨床的進一步應用。有學者將熒光探針接在生物可降解的納米顆粒上,以此來解決熒光探針粒徑小而引起的彌散問題。然而多數聚合物納米粒徑大于淋巴結成像所需粒徑的最佳范圍(10～50 nm),引起注射部位的長時間駐留[5]。

葡聚糖是由數個葡萄糖組成的多糖分子,具有較好的生物兼容性,在臨床輸血過程中可替代一部分全血,作為血漿體積的擴充劑。由于人體有較高的自發背景熒光,使用較高波長的熒光染料可減少自身熒光的干擾。Cy7是一種近紅外熒光染料,激發波長為743 nm,發射波長為767 nm。本試驗在自制的巰基化葡聚糖上引入疏水基脫氧膽酸,這就具備了形成納米膠的條件,在親水基團和疏水基團的雙重作用力下自組裝成納米膠,再在葡聚糖納米膠表面標記了能實時熒光成像的熒光探針Cy7,制備出能夠用于近紅外熒光成像的示蹤劑。其粒徑為30～50 nm,能夠快速到達并較長時間駐留于前哨淋巴結處,在近紅外熒光成像系統下能準確定位深層淋巴結,不受自身脂肪組織干擾,這為術前前哨淋巴結活檢提供新的示蹤方法。

在先前的動物毒性試驗中,結果顯示大劑量Dextran-Cy7對小鼠肝臟有一定的毒性,造成肝臟毒性的用藥劑量(25 mg/kg)是平時成像劑量(5 mg/kg)的5倍,且由小鼠尾靜脈注射,直接進入血液循環系統,更易進入肝臟血液循環,造成肝臟毒性。小鼠淋巴結的熒光免疫組化結果也顯示,Dextran-Cy7主要是由巨噬細胞吞噬,肝臟內富含枯否氏細胞,可吞噬Dextran-Cy7進入包體,長期駐留在肝臟內,造成肝臟毒性。小鼠腋窩淋巴結成像時采用前掌局部注射,Dexrean-Cy7通過淋巴管的引流進入腋窩淋巴結,成像成功后處死小鼠,取出肝腎組織,近紅外熒光成像離體器官,并未發現熒光信號,這可能是由于經淋巴管引流時,Dextran-Cy7進入淋巴結就會被淋巴結內的巨噬細胞所吞噬,駐留在淋巴結內,進入血液循環的較少,也就難以進入肝臟組織,故采取局部注射時其對肝臟的毒性作用有待后續進一步探討研究。

對Dextran-Cy7活體近紅外熒光成像的研究可以更早、更準確地檢出前哨淋巴結是否有惡性腫瘤細胞的轉移,有助于制訂更合理的個體化治療方案。今后的研究將主要圍繞Dextran-Cy7的細胞吸收機制、機體內的藥物動力學效應及對機體的毒性作用等方面展開;也可以為其接上新的官能團,如攜帶淋巴管內皮細胞的靶向分子標記物、具有治療作用的化療藥物,從而使Dextran-Cy7成為多功能化的示蹤劑。

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Mapping of mouse lymph node with near-infrared emitting dextran nanogelinvivo

LI Jie-jing1, JIANG Bei-qi1, SONG Yan-yan2, LIN Chao2, ZHUANG Zhi-gang1△

(1DepartmentofBreastSurgery,ShanghaiFirstMaternityandInfantHospital,TongjiUniversity,Shanghai200092,China;2NanoResearchInstitute,TongjiUniversity,Shanghai200082,China)

Objective To prepare and investigate a near infrared-emitting nanogel for fluorescence mapping of mouse lymph node. Methods Dextran-Cy7 nanogel was prepared by the dialysis of deoxycholic acid and Cy7-conjugated dextran in water.The morphology and particle size of the nanogel were characterized by transmit electron microscope and dynamic light scattering meter,respectively.The Cy7 content in the nanogel was determined by UV-spectrophotometer analysis.In vitro andinvivotoxicity of Dextran-Cy7 was assessed using DC2.4 cell line and C57 mouse mode,respectively.Ten Kunming mice were subcutaneously injected by the forepaw with Dextran-Cy7 and near-infrared fluorescence imaging of axillary lymph node was observed.The distribution of Dextran-Cy7 in the lymph node was detected by immunofluorescence staining. Results Dextran-CY7 nanogel showed spherical morphology with average particle size of about 30-50 nm.The nanogel has good cell compatibilityinvivoandinvitro.Dextran-CY7 nanogel may be applied as a probe for near-infrared fluorescence mapping of mouse axillary lymph node.The nanogel was found mainly in the macrophages of the lymph node. Conclusions Dextran-Cy7 nanogel is low-toxic,biocompatible and may serve as a fluorescence tracer forinvivofluorescence imaging of lymph node.

lymph node mapping; near-infrared imaging; fluorescence dye Cy7; dextran; nanogel

上海市科委醫學引導類項目(124119a4700); 上海市衛生局資助項目(20124164)

R 445

A

10.3969/j.issn.1672-8467.2015.02.015

2014-06-10;編輯:段佳)

△Corresponding author E-mail:137LJJ_ZZG@tongji.edu.cn

*This work was supported by the Shanghai Science and Technology Medical Bootstrap Class Project (124119a4700),and the Shanghai Municipal Health Bureau Project (20124164).