EPAS1基因SNPrs13419896多態(tài)性與HiHiLo低氧訓練適應效果關聯(lián)性研究

汪洪波　劉海平　毛穎穎

摘要：目的：選取EPAS1基因序列第1內含子序列上rs13419896 G/A單核苷酸多態(tài)（single nucleotide polymorphism， SNP）位點，研究其與HiHiLo低氧訓練后生理表型指標關聯(lián)性，探尋預測低氧訓練效果的遺傳學標記。方法：選取35名北方漢族健康受試者（平均年齡19.54±2.55歲，平均身高177.94±4.27 cm，平均體重68.07±5.579 kg）在模擬海拔2 500 m高度（低氧環(huán)境O2濃度為15.4%）進行4 周高住-高練-低訓（living high-exercise high-training low， HiHiLo）。采用關聯(lián)研究方法（Association-Study），運用聚合酶鏈反應和基因測序實驗技術分析EPAS1基因SNP rs13419896位點，研究該位點 與4周HiHiLo低氧訓練后最大攝氧量（maximal oxygen uptake，VO2max）、血紅蛋白（hemoglobin， Hb）、紅細胞數（red blood cell， RBC）等生理表型指標變化的關聯(lián)性。結果：1）EPAS1基因SNP rs13419896位點中GG、GA、AA基因型頻率分別為40%、51.43%和8.57%，符合Hardy-weinberg遺傳平衡定律（x2=0.70，P=0.40）。2）4周低氧訓練后，EPAS1基因SNPrs13419896基因型組間ΔVO2max、ΔrVO2max、ΔRBC及ΔHb均無顯著性差異。合并AA（AA基因型只有3例）與GA基因型統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)，GA基因型受試者經4周低氧訓練后，VO2max絕對值、相對值增長幅度有好于GG基因型趨勢（76.17±245.31 ml/min vs -5.29±276.42 ml/min，P=0.09；1.22±3.37 ml/min·kg vs 0.13±4.18 ml/min·kg，P=0.09）。結論：平原人群4周 HiHiLo低氧訓練后，EPAS1基因第1內含子序列上SNP rs13419896多態(tài)位點與VO2max指標變化可能存在著一定關聯(lián)性。

關鍵詞：內皮PAS結構；域蛋白1；高住-高練-低訓；單核苷酸多態(tài)性

中圖分類號：G804.7 文獻標識碼：A 文章編號：1006-2076（2015）01-0075-05

Abstract：Objective： This paper researched association between a single nucleotide polymorphisms rs13419896 （SNP rs13419896） in EPAS1 gene and physiological phenotype parameters response to hypoxia training. Methods： 35 healthy subjects completed 4 weeks living high-exercise high

低氧訓練作為提高耐力項目運動員運動能力的手段一直是體育界的研究熱點。近十幾年來，低氧訓練的有效性已被國內外學者所認同。但由于個體對低氧環(huán)境適應的生理反應差異性，會產生不同的低氧訓練適應效果[1]。Friedmann B等的研究證實，低氧訓練后運動員紅細胞生成增多存在顯著的個體間差異[2]。大量研究表明，由于低氧訓練適應的生理反應差異性，會導致個體低氧訓練效果的差異性，且產生不同低氧訓練效果差異性與遺傳學因素有著密切關聯(lián)[3-5]。SCIENCE雜志2010年報道，人類對低氧環(huán)境適應與遺傳因素有著高度緊密關聯(lián)[6]。

內皮PAS結構域蛋白1（endothelial PAS domain protein 1， EPAS1） 又稱低氧誘導因子-2α（hypoxia inducible factor-2α， HIF2α）。EPAS1在哺乳動物各種組織的內皮細胞中廣泛表達，是慢性缺氧過程中的關鍵調節(jié)因子[7-8]。低氧環(huán)境下，機體內EPAS1蛋白的穩(wěn)定性、表達量明顯增加[9]，并通過識別靶基因，如促紅細胞生成素基因（erythropoietin， EPO）、血管內皮生長因子基因（vascular endothelial growth factor， VEGF）、血管內皮生長因子受體基因（vascular endothelial growth factor receptor， VEGFR）、乳酸脫氫酶基因-A（lactate dehydrogenase-A， LDHA）的核心序列5`-TACGTGCT-3`與低氧反應元件（hypoxia reaction element， HRE）結合，誘導靶基因的轉錄，介導細胞對缺氧應答，在蛋白水平發(fā)揮其低氧適應的調節(jié)作用[10]。Yi 等在研究影響藏族與漢族人群低氧適應遺傳因素差異中發(fā)現(xiàn)，眾多低氧反應基因頻率都有差異，其中EPAS1 差別最大，并提示EPAS1 參與了藏族的高原低氧適應過程[11]。同時，Beall 等采用Illumina Veracode 平臺以及610-Quad SNP 分型芯片分析藏族基因組SNP 變化情況發(fā)現(xiàn)，與藏族低氧適應相關聯(lián)的EPAS1基因多態(tài)位點大多位于該基因的內含子序列上，最遠的SNP 位點位于基因下游235kb 處[12]。

鑒于此，本研究選取EPAS1基因第1內含子序列上一重要單核苷酸多態(tài)位點（single nucleotide polymorphism， SNP）rs13419896[13]，研究其與4周高住-高訓-低氧（Living high-exercise high-training low， HiHiLo）低氧訓練后生理表型指標變化的關聯(lián)性，探究影響低氧訓練期間生理表型指標敏感變化的遺傳學標記。

1 研究方法

1.1 受試對象

本研究選取35名健康受試者（男性23名，女性12名），平均年齡19.54±2.55歲，平均身高177.94±4.27 cm，平均體重68.07±5.579 kg，均系中國北方漢族健康人群，無低氧暴露經歷。

1.2 研究方案

所有受試者進行4周高住-高訓-低氧（Living high-exercise high-training low， HiHiLo）方案。具體包括：每天在氧濃度為15.4%常壓低氧環(huán)境（相當于海拔2 500 m高度，低氧制造設備：Hypoxic Tent System TM”和“CAT Hatch TM”，美國）休息和睡眠，低氧暴露時間≥10 h/天（pm 8：00-am 6：00），白天在海拔50 m的常氧環(huán)境下生活、訓練，并且在低氧實驗期間，每周進行3次、每次30分鐘的低氧環(huán)境下蹬功率自行車定量負荷運動（以基礎70%VO.2max強度為運動負荷，功率自行車轉速為60轉/分）。

生理表型指標測試：低氧實驗前后分別進行1次最大攝氧量（maximal oxygen uptake，VO.2max）、血象指標（hematological parameters）、低氧定量負荷實驗下血氧飽和度（oxygen saturation， SpO.2）的測試。VO.2max測試采用遞增負荷實驗進行（MedGraphicsVO.2000便攜式氣體代謝分析儀，美國），起始負荷60 W，功率車轉速為60 RPM，每3分鐘遞增30 W，直至力竭，VO.2max判定標準以心率超過180 b/min，呼吸商超過1.1，VO.2不再增加，受試者不能保持蹬車頻率等因素綜合確定；血象指標測試要求受試者晨起后，空腹取靜脈血0.5 ml，采用BECKMAN STKS型全自動血細胞分析儀（日本）進行測試分析，主要包括紅細胞（RBC）、血紅蛋白（Hb）等。

基因多態(tài)性分析：取靜脈血2 ml，2% EDTA抗凝，用promega公司全血總DNA提取專用試劑盒提取受試者DNA。EPAS1基因內含子序列上SNP rs13419896多態(tài)性分析，依據人類EPAS1基因序列，用Primer 5. 0設計引物，引物由上海生工生物工程有限公司合成，上引物：5CTTCAGAGCAAATCAGAGGT 3，下引物：5CTCGCACCCAGATGACA 3。該位點應用LifePro Thermal Cycler PCR儀（中國）進行擴增（20μLPCR反應體系擴增，包括：10×PCR 2μL， 25 mM MgCl2 1.2 μL，dNTP各10 mM 1μL，上、下引物各10 pmol 0.5 μL，Taq酶2U，模板100 ng。各種藥品均為上海生工產品。擴增方案是：（1）94℃預變性5 min；（2）94 °C變性40 s，50°C退火40 s，72°C延伸40 s，35個循環(huán)；（3）72°C延伸10 min。擴增產物為460 bp 片段。擴增PCR產物由上海生工公司測序，進行基因分型。

1.3 數據處理

數據統(tǒng)計學處理采用SPSS 11.5軟件統(tǒng)計包（SPSS software for Windows 11.5 package）完成，所有數據以[AKX-]±SD表示。采用卡方檢驗（chi-square test）驗證受試者人群的基因型頻率是否符合Hardy-weinberg遺傳平衡定律；低氧訓練前后生理指標數據先用K-S檢驗是否符合正態(tài)分布，如符合進行下面統(tǒng)計學處理：低氧訓練前基因型之間的生理指標差異，采用單因素方差分析處理，基因型之間生理指標的變化量采用協(xié)方差處理，以低氧訓練前的初始值作為協(xié)變量進行分析。顯著水平設為P<0.05。

2 結果

2.1 EPAS1基因SNPrs13419896分析

EPAS1基因內含子序列上SNPrs13419896位點分析結果見表1、圖1。SNPrs13419896位點中GG、GA、AA基因型頻率分別為40%、51.43%和8.57%，其中G、A等位基因頻率分別為65.71%、34.29%； SNPrs13419896經卡方檢驗（x2=0.70，P=0.40），符合Hardy-weinberg遺傳平衡定律，表明所選人群具有群體代表性。

2.2 EPAS1基因SNPrs13419896與VO2max和血象指標關聯(lián)結果

低氧訓練前，EPAS1基因SNPrs13419896多態(tài)位點各基因型組間的生理表型指標VO.2max、rVO.2max、RBC及Hb 經單因素方差分析顯示無統(tǒng)計學顯著性差異（表2）。

4周低氧訓練后，EPAS1基因SNPrs13419896的各基因型組間與生理表型指標變化量分析結果見表2。結果顯示，SNPrs13419896基因型組間ΔVO.2max、ΔrVO.2max、ΔRBC及ΔHb均無顯著性差異。鑒于AA基因型只有3例，故將此基因型與其性質相近GA基因型合并后統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)（見圖2），GA基因型受試者經4周低氧訓練后，VO2max絕對值、相對值增長幅度有好于GG基因型趨勢（76.17±245.31 ml/min vs -5.29±276.42 ml/min，P=0.09；1.22±3.37 ml/min·kg vs 0.13±4.18 ml/min·kg，P=0.09）。

3 討論

EPAS1是HIF家族一重要成員，對哺乳動物低氧適應過程中發(fā)揮著重要調節(jié)作用。人類EPAS1基因全長約120 kb，位于第2號染色體（2p16-21），包含15 個外顯子和14 個內含子，cDNA 開放閱讀框2607 bp，編碼869個氨基酸，約為96.5 kD。本研究選取該基因序列第1內含子上SNPrs13419896位點研究其與低氧訓練過程中生理適應效果關聯(lián)性。

從本研究對SNPrs13419896位點分析發(fā)現(xiàn)，GG、GA、AA基因型頻率分別為40%、51.43%和8.57%，即AA基因型較少（僅為3例），這與NCBI的SNP數據庫中漢族人群基因型分布頻率基本一致。EPAS1基因SNPrs13419896的研究對于揭示人類適應低氧環(huán)境的遺傳因素是非常重要的。已有研究證實，低氧適應良好的夏爾巴和中國藏族人群，通過長期進化，其EPAS1基因SNPrs13419896中A等位基因頻率分別為77.2%和79%，明顯高于歐洲人群（0.009%）、日本人（33.6%）和中國北方漢族人群（30.3%）[13]，柯金坤等研究顯示，對低氧環(huán)境適應能力越好的藏族人群，SNPrs13419896位點中AA基因型、A等位基因頻率越高[14]。提示我們，是否具有SNPrs13419896位點A等位基因的平原人群進行低氧訓練后會產生較好的生理適應效果呢，值得研究。

本研究通過平原人群4周低氧訓練后生理表型指標變化與EPAS1基因SNPrs13419896關聯(lián)研究并未發(fā)現(xiàn)SNPrs13419896各基因型試者低氧訓練后VO.2max、RBC及Hb變化差異性，但通過合并性質相近的AA基因型（AA基因型例數僅為3例）和GA基因型進一步分析低氧訓練后基因型組間生理表型指標變化發(fā)現(xiàn)，GA基因型受試者低氧訓練后，VO.2max絕對值、相對值與訓練前相比分別提高2.2%和2.4%，而GG基因型受試者低氧訓練后，VO.2max絕對值降低0.2%，相對值僅提高0.3%，GA基因型受試者低氧訓練后，在VO.2max改善程度表現(xiàn)出優(yōu)于GG基因型的趨勢，但在Hb和RBC指標變化上未發(fā)現(xiàn)基因型組間差異性。從EPAS1生物學功能分析，低氧環(huán)境下，EPAS1蛋白結構上的氧依賴降解區(qū)（oxygen dependent degradation， ODD）不能被脯氨酸羥化酶識別并羥化，使其不能與VHL泛素2蛋白酶復合體結合，導致EPAS1經蛋白水解酶而降解的途徑被抑制，從而使EPAS1蛋白穩(wěn)定增強、含量增加，充分發(fā)揮其誘導靶基因轉錄表達及其生物學功能[15]。EPAS1通過識別靶基因核心序列5-TACGTGCT-3與其HRE結合，誘導靶基因的轉錄。在EPAS1眾多靶基因中，其對VEGF及血管內皮生長因子受體的轉錄調節(jié)尤為明顯。研究發(fā)現(xiàn)，與HIF-1α相比，EPAS1（HIF-2α）與VEGF的結合更容易，同時在表達豐富的血管內皮中，與VEGF 的表達非常一致[16]，同時，通過誘導表達其他一系列與血管生成相關的基因，如VEGF受體（Flk-1 ）以及Dll4 和Notch 信號途徑，誘導血管生成，并發(fā)揮著對血管的穩(wěn)定和正常功能的作用[17]。當平原人群進入低氧環(huán)境中，EPAS1在骨骼肌中的表達量同樣明顯提高[18]。由此推測平原人進行低氧訓練過程中，SNPrs13419896位點的GA基因型或攜帶A等位基因受試者骨骼肌中EPAS1表達量較多，從而促進骨骼肌毛細血管增生，增加了骨骼肌細胞氧的運輸量，導致VO2max明顯改善。

此外，從EPAS1基因SNPrs13419896位點與紅細胞生成關聯(lián)研究發(fā)現(xiàn)[19]，高原紅細胞增多癥人群和高原健康人群間SNPrs13419896位點基因型、等位基因頻率無顯著性差異，提示，該位點可能與低氧環(huán)境適應過程中血象指標改善無明顯關聯(lián)，這與本研究結果是一致的。

4 結論

平原人群4周 HiHiLo低氧訓練后，EPAS1基因第1內含子序列上SNPrs13419896多態(tài)位點與VO.2max指標變化可能存在著一定關聯(lián)性，表現(xiàn)為A等位基因攜帶者具有一定優(yōu)勢；該位點與血象指標變化無關聯(lián)。

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