野生黃花蒿植株和土壤中的青蒿素、黃酮含量變化及其對(duì)土壤微生物的影響

李 倩，袁 玲，羅世瓊，黃建國(guó)

（西南大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院，重慶400716）

野生黃花蒿植株和土壤中的青蒿素、黃酮含量變化及其對(duì)土壤微生物的影響

李 倩，袁 玲，羅世瓊，黃建國(guó)*

（西南大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院，重慶400716）

黃花蒿在生長(zhǎng)過程中，主要通過植株殘?bào)w腐解、淋溶、根系分泌等途徑向土壤中釋放多種化感物質(zhì)，影響鄰近和后續(xù)植物的生長(zhǎng)發(fā)育。本試驗(yàn)研究了野生黃花蒿植株及土壤中的青蒿素類物質(zhì)和黃酮含量，以及土壤可培養(yǎng)微生物數(shù)量。結(jié)果表明，各生育期野生黃花蒿葉片和根區(qū)土壤中青蒿素含量的變化趨勢(shì)為：現(xiàn)蕾期＞始花期＞盛花期＞營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)期；根區(qū)土壤中的去氧青蒿素平均含量最高，青蒿酸次之，青蒿素最低，三者合計(jì)516．93μg／kg干土，且3種化合物的總量根際和根表顯著高于非根際。野生黃花蒿植株黃酮含量呈現(xiàn)出莖＞葉＞根系＞花，根區(qū)土壤黃酮含量表現(xiàn)為根表＞根際＞非根際，且盛花期增至最大均值434．77μg／kg干土。說明根系分泌也是黃酮類化合物進(jìn)入土壤的主要途徑。土壤青蒿素含量與細(xì)菌和放線菌數(shù)量呈顯著負(fù)相關(guān)（r＝－0．508*和r＝－0．478*，n＝24），去氧青蒿素含量與放線菌數(shù)量呈極顯著負(fù)相關(guān)（r＝－0．528**，n＝24）。因此，土壤中的青蒿素類物質(zhì)可能抑制微生物的生長(zhǎng)繁殖，影響土壤生物化學(xué)過程。

黃花蒿；青蒿素；黃酮；土壤微生物

黃花蒿（Artemisia annua）屬菊科一年生草本植物，是提取青蒿素的唯一原料藥材［1］。而黃花蒿在生長(zhǎng)過程中，主要通過枯枝落葉、雨水淋溶和根系分泌3種途徑向土壤生態(tài)系統(tǒng)中釋放萜類、酚酸類和香豆素類等化感物質(zhì)［2］，嚴(yán)重影響土地生產(chǎn)力。重慶市三峽庫(kù)區(qū)是我國(guó)黃花蒿的主栽區(qū)，小麥（Triticum aestivum）、油菜（Brassica campestris）和青菜（Brassica chinensis var．chinensis）等鄰近和后茬作物的產(chǎn)量可降低20%以上［3］。

黃花蒿體內(nèi)的化感物質(zhì)進(jìn)入土壤之后，對(duì)植物、土壤動(dòng)物和水藻產(chǎn)生選擇性毒性效應(yīng)［4-9］。黃花蒿的水浸提液顯著抑制小麥、燕麥（Avena sativa）、蘿卜（Raphanus sativus）、油菜等多種作物種子萌發(fā)及幼苗生長(zhǎng)［10］；Maggi等［11］和Cala等［12］發(fā)現(xiàn)，黃花蒿葉片的醇提取物主要為青蒿素和多甲氧基黃酮類化合物，可以顯著降低瓢蟲（Epilachna paenulata）和南部灰翅夜蛾（Spodoptera eridania）幼蟲存活率；低濃度的青蒿素對(duì)蚯蚓具有驅(qū)趕作用，高濃度則產(chǎn)生致死效應(yīng)［13］。青蒿素抑制牛肝菌（Suillus luteus）和松乳菇（Lactarius delicious）等外生菌根真菌的生長(zhǎng)、養(yǎng)分吸收及有機(jī)酸的分泌，干擾菌根的形成，進(jìn)而影響森林樹木生長(zhǎng)發(fā)育和生態(tài)系統(tǒng)的功能［14-15］。目前，關(guān)于黃花蒿化感作用的研究多在室內(nèi)開展，如用培養(yǎng)法檢測(cè)青蒿素溶液對(duì)種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)的影響［13，16-18］，葉片法了解昆蟲對(duì)黃花蒿葉片及其醇提取物的拒食性［19-21］；固（液）體培養(yǎng)法研究青蒿素和黃花蒿提取物對(duì)土壤微生物生長(zhǎng)繁殖的抑制作用等［22-23］。由于自然生態(tài)系統(tǒng)的復(fù)雜性，以上研究結(jié)果與自然生境條件下的結(jié)果必然存在顯著差異。

微生物是土壤的重要成分，驅(qū)動(dòng)土壤的生物化學(xué)反應(yīng)，如有機(jī)質(zhì)礦化，毒物降解和養(yǎng)分轉(zhuǎn)化與供應(yīng)等。大量的研究表明，化感物質(zhì)可直接抑制周圍和后茬植物生長(zhǎng)發(fā)育，亦可通過干擾土壤微生物的生長(zhǎng)和代謝活動(dòng)，對(duì)植物產(chǎn)生直接和間接影響。因此，探討黃花蒿對(duì)土壤微生物的影響，對(duì)于科學(xué)評(píng)估黃花蒿種植造成的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)，減輕其對(duì)周圍和后茬作物的危害，保持土地生產(chǎn)力有重要意義。在重慶市三峽庫(kù)區(qū)，野生黃花蒿在局部地區(qū)形成大量的優(yōu)勢(shì)群落而聚集生長(zhǎng)，為研究自然狀態(tài)下黃花蒿對(duì)土壤微生物的影響提供了理想的研究材料。

1 材料與方法

1．1 樣地概述

本試驗(yàn)樣地位于重慶市北碚區(qū)西南大學(xué)后山，年平均氣溫18．2℃，1月平均氣溫7．4℃，7月平均氣溫28．7℃，≥5℃的年均日數(shù)為356．6 d，≥10℃的年活動(dòng)積溫高達(dá)5979．5℃，年降水量1105．4 mm，蒸發(fā)量1181．1 mm，全年平均日照1276．7 h，無霜期335 d。1號(hào)樣地海拔230．6 m，壤土（＜0．01 mm土粒含量為21．95%），2號(hào)樣地海拔356．1 m，沙土（＜0．01 mm土粒含量為32．95%），均為多年生黃花蒿群落，簇生。土壤基本理化性狀見表1。

表1 土壤基本理化性狀Table 1 The physical and chemical properties of soils

1．2 樣品采集

2014年6－10月，分別于黃花蒿營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)期（vegetative growth period，VGP）、現(xiàn)蕾期（squaring period，SP）、始花期（first flowering period，F(xiàn)FP）、盛花期（full-bloom period，F(xiàn)BP），用抖根法和洗滌法采集土壤樣品［24］。在采樣時(shí)，先小心抖落根系周圍的土壤，收集非根際土壤；再用小毛刷將附著在根系上的根際土壤輕輕刷下，獲得根際土壤。每個(gè)樣地選取15個(gè)采樣點(diǎn)，每5個(gè)混勻，得到3個(gè)樣品。然后將仍粘附少量根表土壤的黃花蒿根系裝入無菌塑料袋，同步采集黃花蒿植株樣品，備測(cè)有關(guān)指標(biāo)。

1．3 測(cè)定項(xiàng)目與方法

稱取5．00 g新鮮的根際和非根際土，分別置于裝有少量石英砂和45 m L無菌水的三角瓶中，121 r／min振蕩30 min備用。將粘附根表土壤的根系剪下，稱重（W1）后置于裝有石英砂和45 m L無菌水的三角瓶中，振蕩10 s，取出根系，121 r／min振蕩30 min，得到根表土壤的菌懸液。采用稀釋平板涂布法測(cè)定土壤可培養(yǎng)細(xì)菌（牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基）、真菌（馬丁氏培養(yǎng)基）、放線菌（高氏一號(hào)培養(yǎng)基）、自生固氮菌（Ashby無氮培養(yǎng)基）、磷細(xì)菌（磷酸鈣＋植酸培養(yǎng)基）和鉀細(xì)菌（鋁土礦培養(yǎng)基）數(shù)目［25］。用吸水紙吸干根表水分，稱重根系（W2），W1－W2即為根表土質(zhì)量。烘干測(cè)定土壤含水量，用于計(jì)算微生物數(shù)量（CFU／g干土）。

40℃烘干黃花蒿根、莖、葉，分別磨碎過1 mm篩，參照J(rèn)essing等［26］的方法測(cè)定青蒿素含量。植株青蒿素的提取：精密稱取250 mg植株樣品粉末，置于100 m L磨口帶塞三角瓶中，加入25 m L 95%乙醇，密封后，121 r／min振蕩20 h，過濾獲得待測(cè)液。土壤青蒿素類物質(zhì)的提取：將仍粘附少量根表土壤的黃花蒿根系置于15 m L 95%乙醇溶液中輕晃5 s，提取方法同植株，抽濾濃縮至2 m L待測(cè)液，以濾紙上的土壤量為基準(zhǔn)，計(jì)算根表土壤中青蒿素類物質(zhì)含量，精確稱取5．00 g新鮮根際和非根際土于25 m L離心管中，參照上述方法提取和濃縮青蒿素類物質(zhì)。采用GC－MS測(cè)定植株和土壤待測(cè)液中的青蒿酸、去氧青蒿素及青蒿素含量［27］。色譜分析條件為：DB-5 MS（30 m×0．25 mm×0．25μm）色譜柱；升溫程序：50～220℃（15℃／min，保持5 min），220～230℃（15℃／min，保持10 min）；載氣：氦氣（恒流，31．4 cm／s）；分流比：10∶1；檢測(cè)器溫度：250℃；離子源溫度：250℃。

另稱取10．00 g新鮮的根際和非根際土，分別置于100 m L離心管中，加入70%乙醇（土壤∶乙醇＝1∶5），超聲提取黃酮（80℃，3 h），抽濾濃縮至5 m L。將粘附少量根表土壤的黃花蒿根系置于70%乙醇溶液中輕晃5 s，參照根際和非根際土的方法提取和濃縮，獲得根表土壤的黃酮待測(cè)液。以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品，硝酸鋁顯色后，270 nm比色測(cè)定土壤黃酮含量。參照土壤黃酮測(cè)定方法，測(cè)定黃花蒿植株黃酮含量［28-29］。

1．4 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2003對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行基本計(jì)算，SPSS 18．0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，Origin 8．5作圖，Duncan法進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)（P＜0．05），Pearson相關(guān)分析法分析黃花蒿根區(qū)土壤青蒿素類物質(zhì)、黃酮含量與可培養(yǎng)微生物數(shù)量之間的關(guān)系。

2 結(jié)果與分析

2．1 野生黃花蒿的生長(zhǎng)狀況

由表2可見，隨生育期的推移，野生黃花蒿植株的株高和總生物量持續(xù)增加，盛花期增至最大值，與營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)期相比，平均值分別增加了0．83倍和1．10倍。葉片生物量從營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)期到現(xiàn)蕾期增至最高，然后大幅度降低，盛花期比現(xiàn)蕾期的平均值降低55．13%。壤土生長(zhǎng)的黃花蒿長(zhǎng)勢(shì)優(yōu)于沙土。

表2 不同生育期野生黃花蒿植株的株高和生物量變化Table 2 The biomass and plant height of wild A．a(chǎn)nnua in different growth periods

2．2 野生黃花蒿植株青蒿素和黃酮含量

2．2．1 葉片青蒿素含量 野生黃花蒿葉片青蒿素含量表現(xiàn)為現(xiàn)蕾期＞始花期＞盛花期＞營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)期，平均值高低相差1．64倍。此外，葉片青蒿素含量沙土高于壤土，平均值分別為5．35和4．61 mg／g DW（圖1）。

2．2．2 植株黃酮含量 與葉片青蒿素含量的變化類似，黃花蒿植株黃酮含量呈單峰曲線變化，從營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)期到現(xiàn)蕾期增至最大值，然后逐漸降低（圖2）。此外，黃花蒿植株黃酮含量呈現(xiàn)出莖＞葉＞根系＞花，壤土生長(zhǎng)植株黃酮含量顯著的高于沙土生長(zhǎng)植株，平均值分別為101．64和78．43 mg／100 g DW。

圖1 黃花蒿葉片中的青蒿素含量Fig．1 Artemisinin content in the leaves of A．a(chǎn)nnua

圖2 野生黃花蒿植株總黃酮含量變化Fig．2 The changes of total flavonoids content in A．a(chǎn)nnua

2．3 根區(qū)土壤青蒿素類物質(zhì)和黃酮含量

2．3．1 土壤青蒿素類物質(zhì) 由表3可見，在黃花蒿生長(zhǎng)的根區(qū)土壤中，去氧青蒿素的平均含量最高，青蒿酸次之，青蒿素最低，平均值依次為347．81，139．66和74．46μg／kg。在黃花蒿根表和根際土壤中，3種化合物的總量顯著高于非根際。從黃花蒿生育期看，現(xiàn)蕾期根區(qū)土壤中這3種化合物的總量最高，盛花期降至最低。此外，在兩種類型的黃花蒿根區(qū)土壤中，3種化合物的總量差異顯著，沙土比壤土高了41．79%。

2．3．2 土壤黃酮 在黃花蒿根表土壤中，黃酮含量最高，根際土壤次之，非根際最低，高低相差35．1倍。此外，隨黃花蒿生育進(jìn)程的遞進(jìn)，根區(qū)土壤黃酮含量呈增加趨勢(shì)，盛花期增至最大值（平均值＝434．77μg／kg干土），且沙土中的黃酮平均含量顯著高于壤土，前者是后者的2．33倍（圖3）。

2．4 黃花蒿根區(qū)土壤可培養(yǎng)微生物數(shù)量

由表4可見，黃花蒿非根際土壤可培養(yǎng)細(xì)菌、放線菌和自生固氮菌數(shù)量最高，根際次之，根表最低，但真菌、無機(jī)磷細(xì)菌和鉀細(xì)菌數(shù)量變化呈多態(tài)性。隨黃花蒿生育期的推移，根區(qū)土壤中可培養(yǎng)細(xì)菌和放線菌數(shù)量持續(xù)增加，自生固氮菌數(shù)量先增加后減少，無機(jī)磷細(xì)菌和鉀細(xì)菌數(shù)量先增加后減少再增加。

2．5 黃花蒿根區(qū)土壤青蒿素類物質(zhì)、黃酮含量與可培養(yǎng)微生物數(shù)量的相關(guān)關(guān)系

由表5可見，在野生黃花蒿生長(zhǎng)的土壤中，青蒿酸含量與可培養(yǎng)微生物數(shù)量無顯著相關(guān)性；去氧青蒿素含量與放線菌數(shù)量呈極顯著負(fù)相關(guān)（r＝－0．528**，n＝24）；青蒿素含量與細(xì)菌和放線菌數(shù)量呈顯著負(fù)相關(guān)（r＝－0．508*和r＝－0．478*，n＝24）；土壤黃酮含量與細(xì)菌、真菌、放線菌數(shù)量之間均無顯著相關(guān)性。

表3 野生黃花蒿根區(qū)土壤青蒿素類物質(zhì)含量Table 3 The changes of artemisinin compounds content of A．a(chǎn)nnua in root region soils μg／kg dry soil

圖3 野生黃花蒿根區(qū)土壤中的黃酮含量Fig．3 The changes of total flavonoids in root region soils of A．a(chǎn)nnua

表4 黃花蒿根區(qū)土壤可培養(yǎng)微生物數(shù)量Table 4 The number of culturable microorganisms changes in root region soils of A．a(chǎn)nnua CFU／g dry soil

3 討論

在黃花蒿生長(zhǎng)過程中，葉、花、種子和果實(shí)極易脫落，向土壤釋放多種化感物質(zhì)，嚴(yán)重影響植物和土壤動(dòng)物的生長(zhǎng)代謝［30］。在本項(xiàng)研究中，現(xiàn)蕾期葉片生物量開始顯著下降，降幅最高達(dá)到55．13%。在重慶市三峽庫(kù)區(qū)，黃花蒿現(xiàn)蕾后進(jìn)入當(dāng)?shù)氐母邷胤灯冢~片容易凋落腐解，進(jìn)入土壤的化感物質(zhì)尤其是青蒿素類物質(zhì)大幅增加，可能抑制黃花蒿周圍及后茬作物的生長(zhǎng)發(fā)育，造成減產(chǎn)。

在野生黃花蒿現(xiàn)蕾期，植株葉片青蒿素含量最高，根區(qū)土壤青蒿素類物質(zhì)表現(xiàn)為去氧青蒿素＞青蒿酸＞青蒿素，合計(jì)高達(dá)516．93μg／kg干土。這與Jessing等［2，31］利用原位硅膠管微萃取法，證實(shí)黃花蒿根毛能分泌青蒿素的結(jié)果一致，由此也可解釋青蒿素類物質(zhì)含量在根表、根際＞非根際土壤的現(xiàn)象。Duke等［16］發(fā)現(xiàn)，33μmol／L青蒿素即可抑制雜草生長(zhǎng)；1μmol／L的青蒿素能干擾水葫蘆（Eichhornia crassipes）的光合作用，月牙藻（Pseudokirchneriella subcapitata）和小葉浮萍（Lemna minor）的半最大效應(yīng)濃度（Concentration for 50% of maximal effect，EC50）僅0．24和0．19 mg／kg［13］。因此，在野生黃花蒿群落的根際土壤中，高濃度的青蒿素類物質(zhì)可能抑制其他植物生長(zhǎng)，這對(duì)于黃花蒿形成單優(yōu)種群和保持生態(tài)優(yōu)勢(shì)具有重要作用。此外，土壤青蒿素濃度與葉片青蒿素含量呈極顯著正相關(guān)［32］，在三峽庫(kù)區(qū)普遍栽培的黃花蒿品種中，青蒿素含量一般為10．00～15．00 mg／g DW，是野生黃花蒿的2～3倍［33-34］，由此推測(cè)，在人工栽培黃花蒿的土壤中，青蒿素類物質(zhì)的含量可能更高，對(duì)周圍和后續(xù)作物生長(zhǎng)發(fā)育抑制作用更強(qiáng)。相關(guān)分析結(jié)果顯示，土壤青蒿素含量與細(xì)菌和放線菌數(shù)量呈顯著負(fù)相關(guān)（r＝－0．508*和r＝－0．478*，n＝24），去氧青蒿素含量與放線菌數(shù)量呈極顯著負(fù)相關(guān)（r＝－0．528**，n＝24）。培養(yǎng)試驗(yàn)也表明，在根瘤菌、無機(jī)磷細(xì)菌和外生菌根真菌等土壤微生物的培養(yǎng)液中，添加青蒿素后，它們的繁殖速率、固氮酶活性和溶磷能力下降，菌根真菌菌絲生物量、有機(jī)酸分泌速率和養(yǎng)分吸收量均顯著減少［14-15，22，35］。

表5 黃花蒿根區(qū)土壤青蒿素類物質(zhì)、黃酮含量與可培養(yǎng)微生物數(shù)量的相關(guān)關(guān)系Table 5 Correlation coefficients between the content of artemisinin derivatives，flavonoids and the number of soil microorganism in root region soils of A．a(chǎn)nnua

隨野生黃花蒿生育期的推移，植株黃酮含量下降，根表和根際土壤的黃酮總量則大幅度增加，表明黃酮類物質(zhì)也可通過植株根系分泌進(jìn)入土壤。據(jù)報(bào)道，黃酮類物質(zhì)對(duì)土壤微生物具有廣譜殺抑作用，包括常見的細(xì)菌如枯草桿菌（Bacillus subtilis）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、蠟樣芽胞桿菌（Bacillus cereus）和變形桿菌（Staphylococcus epidermidis）等［36］。但是，在本試驗(yàn)中，土壤黃酮含量與細(xì)菌、真菌、放線菌數(shù)量之間均無顯著相關(guān)性，不同于前人的研究結(jié)果［37-38］。在野外復(fù)雜的自然條件下，多種土壤因素影響土壤微生物的繁殖生長(zhǎng)，各因素的作用大小也不一樣［39］，這可能是土壤黃酮與土壤微生物之間無顯著相關(guān)性的原因之一。此外，青蒿素類物質(zhì)能抑制原生動(dòng)物和微生物繁殖生長(zhǎng)，而甲氧基黃酮類物質(zhì)與青蒿素具有協(xié)同效應(yīng)，可促進(jìn)青蒿素與血晶素的反應(yīng)，增強(qiáng)青蒿素的抗瘧活性，提高殺滅瘧原蟲的效果；在黃酮存在的條件下，青蒿素破壞細(xì)菌原生質(zhì)膜的作用增強(qiáng)，使胞內(nèi)物質(zhì)大量外滲［40］。因此，土壤中的黃酮也可能與青蒿素協(xié)同，對(duì)微生物繁殖生長(zhǎng)產(chǎn)生抑制作用。

綜上所述，野生黃花蒿植株通過葉片凋落和根系分泌向土壤釋放大量的青蒿素類和黃酮類物質(zhì)，對(duì)微生物產(chǎn)生化感作用，選擇性的干擾土壤微生物的生長(zhǎng)繁殖，影響土壤質(zhì)量和生產(chǎn)力。

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Artemisinin and flavonoids in wild Artemisia annua and surrounding soil and the influence on soil microbes

LI Qian，YUAN Ling，LUO Shi-Qiong，HUANG Jian-Guo*
College of Resources and Environment，Southwest University，Chongqing 400716，China

Artemisia annua releases various kinds of allelochemicals into soils via rain leaching，root exudation and dead tissue decomposition during the growing season，with resulting inhibition of the growth and development of adjacent plants and succeeding crops．The present experiments were thus conducted to detect artemisinin derivatives，flavonoids and effects on soil microbes in wild A.annua and surrounding soil．The allelochemical concentrations ranked：bud break period＞early flowering period＞full bloom period＞vegetative growth period（artemisinin in leaves and root zone soil）and stem＞leaf＞root＞flower（flavonoids in plants）．In sampled soils，the mean concentration of deoxyartemisinin was highest，followed by artemisic acid and artemisinin in soil and the sum of these artemisinin derivatives was 516．93μg／kg dry soil．Concentrations of all three compounds tested were highest in root surface soil and much higher in the root surface soil and rhizosphere soil than in non-rhizosphere soil．Soil flavonoid concentrations increased steadily during the growing season of A.annua and reached their highest levels at full-bloom stage（434．77μg／kg dry soil）．Hence it is concluded that fla-vonoids are released into soils through root exudation．The numbers of bacteria and actinomycetes showed significant negative correlations with artemisinin concentration（r＝－0．508*and－0．478*，n＝24）．There was also a negative correlation between deoxyartemsinin contents and actinomycete numbers（r＝－0．528**，n＝24）．In summary，artemisinin and its derivatives released from A.annua appear to inhibit microbial growth and reproduction，and are therefore likely to influence biochemical reactions in soils．

Artemisia annua；artemisinin；flavonoids；soil microorganism

10．11686／cyxb2014510 http：／／cyxb．lzu．edu．cn

李倩，袁玲，羅世瓊，黃建國(guó)．野生黃花蒿植株和土壤中的青蒿素、黃酮含量變化及其對(duì)土壤微生物的影響．草業(yè)學(xué)報(bào)，2015，24（11）：29-37．

LI Qian，YUAN Ling，LUO Shi-Qiong，HUANG Jian-Guo．Artemisinin and flavonoids in wild Artemisia annua and surrounding soil and the influence on soil microbes．Acta Prataculturae Sinica，2015，24（11）：29-37．

2014-12-08；改回日期：2015-02-11

國(guó)家973計(jì)劃項(xiàng)目（2013CB127405）和國(guó)家自然科學(xué)基金（41461053）資助。

李倩（1987-），女，河南鄭州人，在讀博士。E-mail：qianqingzi＠qq．com

*通訊作者Corresponding author．E-mail：huang99＠swu．edu．cn