紫花苜蓿MsWRKY33轉錄因子的分離及遺傳轉化研究

馮光燕，王學敏，付媛媛，方志紅，高洪文，張新全*

（1．四川農業大學草業科學系，四川溫江611130；2．中國農業科學院北京畜牧獸醫研究所，北京100193）

紫花苜蓿MsWRKY33轉錄因子的分離及遺傳轉化研究

馮光燕1，王學敏2*，付媛媛2，方志紅2，高洪文2，張新全1*

（1．四川農業大學草業科學系，四川溫江611130；2．中國農業科學院北京畜牧獸醫研究所，北京100193）

WRKY轉錄因子是植物特有的轉錄因子，廣泛參與植物對多種逆境脅迫的反應。但是對紫花苜蓿中WRKY轉錄因子的研究還較少。本研究從紫花苜蓿中克隆了一個WRKY I類轉錄因子MsWRKY33。該基因CDS全長1536 bp，編碼512個氨基酸，結構分析顯示MsWRKY33包括兩個WRKY結構域和一個C2H2鋅指結構（C-X4-CX23-H-X-H），表明其屬于WRKY I族WRKY轉錄因子。亞細胞定位預測MsWRKY33蛋白定位在細胞核。MsWRKY33基因受鹽、干旱和冷脅迫誘導，暗示基因可能參與了這些逆境脅迫的調控。構建原核表達載體p ETMsWRKY33，SDS－PAGE分析表明在大腸桿菌中表達了MsWRKY33蛋白。擴增MsWRKY33編碼區cDNA，以pBI121為基礎載體，構建植物超表達載體pBI121-MsWRKY33。采用農桿菌介導的愈傷組織培養法轉化紫花苜蓿。利用nptⅡ基因引物和載體特異引物檢測抗性苗呈陽性，表明目的基因已成功導入紫花苜蓿基因組中。qRT－PCR檢測發現，MsWRKY33基因在轉基因株系中得到增強表達。本研究為進一步探索WRKY轉錄因子基因在紫花苜蓿抗逆性調控中的作用奠定了基礎。

紫花苜蓿；MsWRKY33；轉錄因子；遺傳轉化

轉錄因子（transcription factor），又稱反式作用因子（trans acting factor），是指能夠與真核基因的順式作用元件（cis acting element）發生特異性相互作用，并對轉錄有激活或抑制作用的DNA結合蛋白。在植物中已發現了多種轉錄因子，如b ZIP類、ERF類、b HLH類、WRKY類和NAC類等。其中WRKY蛋白是植物所特有的一類轉錄因子家族，其結構域是一個60個氨基酸左右的保守結構，且所有結構域均含有高度保守的WRKYGQK氨基酸序列，并因此得名［1］。

WRKY轉錄因子在植物體中行使眾多功能，大量研究證實植物WRKY基因的主要生物學功能是調控植物抗病反應及其信號轉導途徑的建立［2-5］。此外，該類轉錄因子還與植物衰老以及胚胎發育等一系列生長發育過程相關基因的表達調控具有重要聯系［6-7］。近年來，研究者發現，WRKY轉錄因子也參與了植物的非生物逆境脅迫應答。AtWRKY33超表達增強轉基因材料的耐鹽性［8］，OsWRKY08基因受PEG、NaCl、ABA的誘導表達，可以增強轉基因擬南芥（Arabidopsis thaliana）抗滲透脅迫的能力［9］。大豆（Glycine max）的WRKY轉錄因子在擬南芥中過量表達可以增強轉基因植株的抗冷能力（WRKY 21）和抗旱耐鹽性（WRKY 54）［10］。長葉紅砂（Reaumuria trigyna）中的兩個WRKY基因受到干旱、高鹽和冷脅迫等多種非生物脅迫的誘導［11］。此外，WRKY轉錄因子還參與高溫［12-13］、傷害［14-15］、ABA［8］、雙氧水［9］、紫外線［16］等非生物脅迫的調控。然而，與在生物脅迫中取得的研究成果相比，WRKY轉錄因子在非生物脅迫中的研究還很少。

紫花苜蓿（Medicago sativa）是重要豆科牧草，不僅是家畜日糧中不可缺少的組分，而且是生態恢復、土壤改良的優選植物。近年來，苜蓿干草消費逐年增加，同時紫花苜蓿種植面積也迅猛擴大，但干旱、高鹽、冷害等非生物脅迫極大影響其產量和品質的提高。過去對WRKY轉錄因子家族的研究多集中于生物脅迫領域，且多以擬南芥或水稻（Oryza sativa）等模式植物為對象。紫花苜蓿屬于異花授粉四倍體豆科牧草，其遺傳轉化困難，生長周期長，基因功能的研究比較滯后，到目前為止，對紫花苜蓿WRKY轉錄因子功能深入研究幾乎是空白。對這一重要豆科植物WRKY轉錄因子的研究，不僅在理論上有助于我們了解WRKY轉錄因子在牧草抗性調控中的作用，而且有助于指導我們通過調控機制來增強牧草的抗逆能力。

1 材料與方法

1．1 實驗材料

紫花苜蓿“中苜1號”為中國農業科學院北京畜牧獸醫研究所育成品種。

DNA聚合酶Ex Taq、DNA Makers、p MD18-T vector、限制性內切酶、T4 DNA連接酶均購自Takara公司（Japan）；cDNA Synthesis Kit購自Fermentas（USA），Trizol試劑購自Invitrogen（USA），SMARTTM RACE c DNA Amplification Kit購自Clontech（USA），ABA購自Sigma（USA），大腸桿菌感受態細胞Escherichia coli DH5α和BL21（DE3）p LysS購自北京天根生化科技有限公司。氯仿、異丙醇、乙醇、NaCl、PEG 6000等均為國產分析純試劑。

1．2 實驗方法

1．2．1 材料的種植與處理 2014年4月，將來自紫花苜蓿‘中苜一號’同一母株的枝條在溫室內進行扦插，待扦插苗長出葉片和根后，選取長勢一致的幼苗移到1／2 MS營養液中，一周換兩次培養液，在溫室中繼續生長30 d。

選取長勢一致的苜蓿幼苗進行干旱、高鹽、低溫和脫落酸脅迫人工模擬環境處理，具體處理方法如下：ABA激素處理：在1／2 MS營養液中加入ABA，濃度為100μmol／L，室溫25℃條件下將植株分別處理0，2，4，8，12和24 h；干旱處理：將紫花苜蓿苗置于20%PEG 6000的1／2 MS營養液中，室溫25℃作用條件下將植株分別處理0，2，4，8，12和24 h；高鹽處理：將紫花苜蓿苗置于含有250 mmol／L NaCl的1／2 MS營養液中，室溫25℃作用條件下分別處理0，2，4，8，12和24 h；冷處理：將種植于1／2 MS液體培養基的紫花苜蓿放在4℃下處理0，2，4，8，12和24 h。以上處理分別取其葉，－80℃保存備用。

1．2．2 WRKY基因3′末端序列、5′末端序列和全長cDNA序列的克隆 用TRizol試劑分別提取250 mmol／L NaCl溶液處理2，4，8，12和24 h后的幼葉總RNA后，按照質量比為1∶1∶1∶1∶1混合。根據cDNA Amplification Kit說明書，用混合RNA為模板制備RACE-Ready cDNA。根據轉錄組測序得到的類WRKY基因的Unigene序列（未發表），分別設計5′RACE（GSP1）和3′RACE（GSP2）特異性引物GSP1和GSP2。利用這些引物分別PCR擴增出3′末端和5′末端序列，連接到PMD18-T載體后，送英淮杰基公司測序。將所得序列拼接出全長cDNA序列。

核酸及氨基酸序列分析、開放閱讀框ORF的查找和翻譯用DNAStar 6．13軟件進行分析，利用ScanProsite服務器（http：／／www．expasy．org／tools／scanprosite／）對WRKY蛋白進行功能預測。從GeneBank上下載其他植物中的同源蛋白，利用MEGA4軟件Neighbor-Joining法構建系統進化樹。

1．2．3 Real-Time PCR檢測WRKY基因的組織表達特異性 用TRizol試劑分別提取1．2．1中獲得的各處理RNA，根據cDNA Synthesis試劑盒說明書分別反轉錄為cDNA。參考Ta KaRa公司的SYBR Premix Ex Taq TM試劑盒說明書，使用ABI PRISM 7500 Real-time PCR System（ABI，USA）系統，采用兩步法進行Realtime PCR擴增，第1步：95℃預變性30 s；第2步：95℃5 s，60℃34 s，40個循環。每次實驗3個樣品，每個樣品做3次重復。基因特異引物為F1／R1，以紫花苜蓿ACT2基因為內參基因，引物為F2／R2。

根據得到的Ct值，將每種處理的0 h設為對照，2，4，8，12和24 h分別設為5個不同處理，利用2－△△Ct法［17］，分別計算MsWRKY33基因在不同處理下的表達量。

1．2．4 蛋白原核表達與鑒定 MsWRKY 33編碼蛋白全長512 AA，根據表位預測，決定以10-239 AA作為免疫原序列。以紫花苜蓿c DNA為模板，利用引物F3、R3進行PCR擴增。用Eco RⅤ和Eco RⅠ雙酶切表達載體p ET30a以及PCR產物。用1%瓊脂糖電泳，回收目的片段。在T4 DNA連接酶作用下，16℃反應2 h。轉化大腸桿菌BL21（DE3）p LysS，以F3、R3為引物進行菌液PCR，挑選陽性克隆測序，正確插入目的基因的重組子p ET-WRKY 33用于表達分析。陽性克隆菌液20μL接種至3 m L LB（含50μg／m L Kan）培養基中37℃過夜培養。取30μL過夜培養菌液加入到含3 m L LB培養基中，37℃震蕩培養至OD600約0．6；取部分液體作為未誘導的對照組，余下的加入IPTG誘導劑至終濃度0．5 mmol／L作為實驗組，兩組繼續37℃震蕩培養。在誘導1和3 h時取菌體1 m L，離心10000 r／min×30 s收獲沉淀，用100μL 1%SDS重懸，混勻，100℃10 min。10000 r／min離心10 min，取上清進行SDS－PAGE分析。

1．2．5 構建植物表達載體 設計5′端包含XbaⅠ酶切位點的上游引物和Bam HI酶切位點的下游引物：F4和R4，其中，下劃線部分為酶切位點；用該引物從紫花苜蓿cDNA模板中擴增MsWRKY33的全長閱讀框，PBI載體和目的基因全長片段經XbaⅠ和Bam HI雙酶切后回收產物，經T4DNA連接酶連接，得到插入有MsWRKY33基因的PBI121載體，轉化E.coli DH5α感受態細胞。測序驗證序列正確性后用于后續試驗。含有目的片段的質粒載體的結構如圖5A所示。

1．2．6 農桿菌轉化及轉基因植株篩選 提取PBI121-MsWRKY33質粒，使用凍融法轉入農桿菌菌株GV3101。挑選健康的葉片作為外植體，隨后經70%酒精2 min，0．1%的CoCl25 min，滅菌水洗3次后，置于滅菌的培養皿中。消毒好的葉片在農桿菌溶液，OD600為0．6～0．8的重懸液（滅菌的YEP）中侵染15～30 min，然后放到無菌濾紙上，吸去多余液體。在共培培養基上生長一周。把外植體取出，放入滅菌水中清洗，重復以上過程2～3次。隨后轉入篩選培養基上。2～3周后，愈傷組織轉入誘導培養基上。3周后，胚將會發育成小枝、部分胚長出幼根。小植株移入生根培養基上。

提取轉基因植株的基因組DNA，以nptⅡ基因引物F5／R5，以及轉化載體特異引物F6／R6（載體35S啟動子序列設計正向引物F6，MsWRKY33基因序列設計反向引物R6）進行PCR擴增檢測。

實驗中所用到的所有引物用Primer Premier 5．0軟件設計，引物序列見表1。

表1 實驗中的引物序列Table 1 Primer sequence used in the study

2 結果與分析

2．1 紫花苜蓿WRKY 33基因cDNA全長的克隆

根據高通量測序得到的335 bp類WRKY Unigene片段，利用RACE技術，分別擴增目的基因的3′和5′端，將特異性片段進行回收測序，獲得3′端長度為610 bp，5′端長度為1395 bp的序列。利用DNAMAN 6．0軟件進行序列拼接，獲得全長為1891 bp的cDNA序列。將該序列進行BLAST比對，發現該序列與蒺藜苜蓿（Medicago truncatula）、大豆等物種的WRKY轉錄因子基因高度同源，認為獲得的序列是一個WRKY轉錄因子基因序列。

2．2 紫花苜蓿WRKY 33基因的生物信息學分析

該基因含有一個1536 bp的讀碼框，編碼512個氨基酸。該基因編碼的蛋白質分子量為57．15 k Da，蛋白等電點為6．5，其中包含51個強堿性氨基酸（K、R），56個強酸性氨基酸（D、E），108個疏水氨基酸（A、I、L、F、W、V），203個極性氨基酸（N、C、Q、S、T、Y）。截型苜蓿（Accession number：XP-003599287）；擬南芥（BAE 98456）；大豆（XP-003538323）。

圖2 WRKY基因家族DNA序列的系統進化關系Fig．2 Phylogenetic relationships of DNA sequences within the AtWRKY family

利用GenBank上的BlastP搜索到來源于不同物種的幾個親緣關系近的蛋白序列，并進行了比對分析。圖1中可見，該基因編碼蛋白與其他物種同一亞族關系相近的蛋白同源性相對較高。與蒺藜苜蓿WRKY、大豆WRKY 33在氨基酸水平上的相似性分別為92%和71%。進一步對同源區進行序列分析，該蛋白含有2個包括60個氨基酸在內的WRKY保守結構域（WRKYGKK）和2個Cys2-His2鋅指結構。將該蛋白序列與擬南芥中的WRKY轉錄因子進行聚類分析，發現其與擬南芥的WRKY33和WRKY25聚為一類，屬于第I類WRKY蛋白（圖2）。說明該基因可能具有WRKY 33基因的相似功能。因此將該基因命名為MsWRKY 33。

用ProtComp 9．0軟件（http：／／linux1．softberry．com／all．htm）進行亞細胞定位預測分析，該蛋白定位在細胞核的可能性為7．66，細胞膜的可能性為1．53，定位于其他亞細胞結構的可能性都小于1（表2）。因此該蛋白最有可能定位于細胞核中。

2．3 MsWRKY 33基因的表達分析

利用quantitive Real-Time PCR對紫花苜蓿MsWRKY33基因在非生物逆境脅迫下的基因表達進行了檢測。結果顯示，鹽（NaCl），干旱（PEG模擬）和冷（4℃）脅迫均能誘導MsWRKY33基因表達上調（圖3）。其中冷脅迫對基因的誘導較強，到處理12 h表達豐度提高了15倍以上（圖3C）。干旱處理下，處理4 h基因表達開始明顯上調，并一直維持上升的趨勢到24 h（圖3B）。表明該基因可能直接或間接的參與了植物對這些非生物逆境的響應。同時，還進行了ABA處理誘導，發現當紫花苜蓿受到ABA脅迫時，表達呈一個相對緩慢的上升趨勢。隨著處理時間的延長，MsWRKY33基因的表達量逐漸上升，在12 h的表達量達到最大值。隨后表達量開始出現緩慢下降（圖3D）。

表2 MsWRKY33蛋白亞細胞定位分析Table 2 Prediction of protein subcellular localization of MsWRKY33

圖3 MsWRKY33的基因表達分析Fig．3 Gene expression analysis of MsWRKY33

2．4 MsWRKY 33的蛋白原核表達

將目的片段連接p ET30a構成重組子，轉化大腸桿菌BL21，測序檢測證明序列正確，沒有發生突變。表明蛋白表達載體已經構建成功。將含有陽性質粒大腸桿菌表達菌BL21（DE3）p LysS株系，用1 mmol／L IPTG誘導表達，并在誘導的0，1和3 h分別取樣。結果顯示，含有MsWRKY33片段的表達載體菌體蛋白在誘導后有特異性條帶出現。該表達蛋白在45 KDa附近，分子量與預期相同（圖4）。表明該蛋白可以在大腸桿菌中誘導表達。這為進一步的蛋白表達研究奠定了基礎。

2．5 MsWRKY 33基因的遺傳轉化

本研究將來自紫花苜蓿的MsWRKY 33 cDNA全長片段通過農桿菌介導的遺傳轉化的方法同源導入紫花苜蓿進行超量表達。首先將MsWRKY33 cDNA全長片段克隆到植物雙元表達載體PBI121中，如圖5A所示。通過限制性內切酶XbaⅠ／Bam HⅠ雙酶切檢測，獲得與預期大小相符1500 bp左右的條帶（圖5B）。再將酶切陽性的克隆測序檢測，插入序列完整，無缺失，無突變，表明MsWRKY33基因已經成功克隆到植物表達載體中。

圖4 MsWRKY33融合蛋白SDS-PAGE電泳考馬斯亮藍染色檢測Fig．4 Coomassie-stained SDS-PAGE gel illustrating MsWRKY33 His-tag fusion protein expression in E．coli

圖5 紫花苜蓿遺傳轉化過程Fig．5 The genomic transformation of alfalfa

采用紫花苜蓿葉片為外植體，用轉化了p BI121-MsWRKY33的農桿菌侵染后，在篩選培養基上培養（圖5C），外植體切口處誘導出愈傷組織（圖5D）；愈傷組織繼續培養，長出幼胚（圖5E）；幼胚逐漸發育成為成熟胚，并長出幼葉（圖5F），移到生根培養基上，在生根培養基上長出幼根（圖5G）。再生苗經GUS組織化學染色，顯示藍色，表明目的基因在紫花苜蓿植株中成功表達（圖5G小圖）。通過初步篩選，共獲得7株陽性轉基因植株。將這些陽性幼苗移入人工氣候室，進行煉苗，待植株強壯后，移入室外生長（圖5H）。

為進一步檢測轉化陽性植株，對轉基因材料進行了分子水平檢測。以未轉化的植株作為對照，提取轉基因植株DNA，對T－DNA中nptⅡ基因以及載體特異引物進行PCR檢測。結果表明，篩選出的7株陽性植株均擴增出PCR產物，且擴增產物與目的片段大小吻合（圖6A）。

進一步的，對DNA檢測陽性的株系進行了目的基因表達量的qRT－PCR檢測。結果顯示，所有受檢株系的MsWRKY33表達都上調，其中株系1，2，19的表達豐度最高（圖6B），可以作為下一步基因功能驗證的候選材料。

圖6 轉基因植株的分子檢測Fig．6 Molecular detection of transgenic plants by PCR

3 討論

WRKY轉錄因子是植物中一個龐大的基因家族，到目前為止，在擬南芥中共發現74個WRKY基因［18］，水稻中共發現102個［19］（一說為114個），大豆中197個［20］，大麥（Hordeum vulgare）中45個［21］等等。在最近的一項研究中，從蒺藜苜蓿的基因組中搜索到了28個WRKY轉錄因子基因［22］。所有的WRKY蛋白均含有一個或兩個WRKY結構域。最初根據所含WRKY結構域的數目和鋅指結構的特征將WRKY蛋白劃分3組：第Ⅰ組含有兩個WRKY結構域，其鋅指結構為Cys2-His2（C-X4-5-C-X22-23-H-X1-H）；第Ⅱ組含有一個WRKY結構域，鋅指結構與第1組相同；第Ⅲ組也只含一個WRKY結構域，鋅指結構為Cys2-His／Cys（C-X7-C-X23-H-X1-C）［23］。關于WRKY分類方式也不一而足，其中Zhang和Wang［24］對迄今為止已克隆到的所有WRKY超級家族基因進行了聚類分析，除了上述的根據WRKY域和鋅指結構的分類之外，分析結構顯示，根據第二類型的WRKY蛋白結構域內所包含的其他較為保守的結構域又可進一步將其分為a、b、c、d和e 5個亞類。本研究以模式植物擬南芥中的WRKY轉錄因子為參考基因，對MsWRKY33基因的進化地位進行了分析。根據Zhang和Wang［24］進行的進化分析，進化樹將MsWRKY33、MtWRKY和擬南芥的66個WRKY基因共同分為7類，分別是WRKY I、WRKY IIa、IIb、IIc、IId、IIe和WRKYⅢ，MsWRKY33和Mt WRKY緊緊聚在一起，共同歸在WRKY I類。因此，紫花苜蓿WRKY33基因可能具有WRKY I類轉錄因子相似的功能，尤其是與AtWRKY33相似的功能。在系統進化分析中，我們還引入了水稻的WRKY 33基因，但是，該基因并沒有如我們預期的那樣與AtWRKY33和MsWRKY33聚類在一起，而是聚在了IIb亞族。究其原因，可能是水稻與擬南芥中WRKY的編號各自獨立，編號相同的基因并沒有進化和功能上的相關性。

轉錄因子只有在細胞核中才能發揮其功能。本研究利用生物在線軟件Softberry ProtComp對MsWRKY33的亞細胞定位進行了預測。該軟件將幾種蛋白定位預測方法結合在一起，包括基于網絡的細胞核預測，與已知定位信息的同源蛋白比較，特定功能蛋白多肽預測，以及搜索定位特異motif等。該軟件與其他預測軟件相比較，具有獨立的植物蛋白和動物／真菌蛋白識別器，極大的提高了識別的準確性。用該軟件的分析結果表明，MsWRKY33定位于細胞核，這與MsWRKY33的轉錄因子身份是相符的。當然這一預測結果還需要后續試驗做進一步證明。

如前所述，MsWRKY33基因屬于WRKY I亞族，與擬南芥AtWRKY33基因的親緣關系非常近。這暗示其很可能具有與At WRKY33相似的功能。以往對WRKY轉錄因子的研究多集中在抗病性上。有研究顯示，At-WRKY 33與植物的真菌抗性相關，病原菌誘導基因的表達以及異源表達基因能夠增強植物抵御病原菌的能力［25-26］。也有少量針對非生物脅迫的研究，如Li等［13］在對WRKY25、26和33的研究中（這3個基因均屬于WRKYⅠ類）發現，3基因與植物的耐熱性調控相關，在植物的耐熱性中功能互作，協同相關。玉米（Zea mays）中與At WRKY33同源的基因Zm WRKY33受高鹽、干旱、冷脅迫和ABA的誘導，基因增強表達提高植物的耐鹽性［27］。因此我們認為MsWRKY33基因可能也參與了非生物脅迫的調控。根據這一預測，對該基因對不同非生物逆境的響應進行了研究，發現干旱、鹽、冷均可以誘導m RNA的累積（圖3）。暗示WRKY 33基因可能參與了這些逆境調控。于是我們進行了基因的遺傳轉化，在此基礎上，后續我們將對該基因繼續深入進行抗逆功能研究，期望揭示紫花苜蓿WRKY轉錄因子基因在抗非生物逆境中的作用。

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Isolation of MsWRKY33 transcription factor and its genetic transformation in Medicago sativa

FENG Guang-Yan1，WANG Xue-Min2*，FU Yuan-Yuan2，FANG Zhi-Hong2，GAO Hong-Wen2，ZHANG Xin-Quan1*
1.Department of Grassland Science，College of Animal Science and Technology，Sichuan Agricultural University，Wenjiang 611130，China；2.Institute of Animal Science，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing 100193，China

Plant-specific WRKY transcription factors（TFs）are widely involved in various stress responses．However，their roles in abiotic stresses are still not well known in alfalfa（Medicago sativa）．In this study，a WRKY gene，containing 1536 bp CDS length encoding a putative protein of amino acid 512，designated as MsWRKY33，was isolated from alfalfa．The alignment results revealed that the MsWRKY33 protein contains two conserved DNA-binding domains（WRKY domain）of 60 amino acids and a C2H2 zinc finger region（C-X4-C-X23-H-X-H），falling into group I of the WRKY protein．Protein localization prediction analysis indicated that Ms WRKY33 is a nuclear-targeting protein．The expression of MsWRKY 33 gene was up-regulated by salin-ity（NaCl），drought（PEG）and cold temperature（4℃），indicating that MsWRKY33 gene may be involved in the regulation of environmental stress responses in alfalfa．The fragment encoding 10-239AA was inserted into p ET-30α（＋）to construct the expression vectors，and SDS－PAGE analysis revealed that the MsWRKY33 protein could be expressed in prokaryotic cells．The full length cDNA of MsWRKY33 was amplified from alfalfa RNA and the plant expression vector pBI121-MsWRKY33 was constructed based on the pBI121 vector．Transgenic plants were obtained through somatic embryogenesis by Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation．The nptⅡgene and vector sequence were tested by PCR in the genome of transgenic plants and indicated that the target gene had been transferred．The qRT－PCR testing showed that the MsWRKY33 gene was over expressed in transgenic plants．This study will lay a foundation for further study of the function of the WRKY transcription factor in stress-tolerance regulation in alfalfa．

Medicago sativa；MsWRKY33；transcription factor；genetic transformation

10．11686／cyxb2015131 http：／／cyxb．lzu．edu．cn

馮光燕，王學敏，付媛媛，方志紅，高洪文，張新全．紫花苜蓿MsWRKY33轉錄因子的分離及遺傳轉化研究．草業學報，2015，24（11）：48-57．

FENG Guang-Yan，WANG Xue-Min，FU Yuan-Yuan，FANG Zhi-Hong，GAO Hong-Wen，ZHANG Xin-Quan．Isolation of MsWRKY33 transcription factor and its genetic transformation in Medicago sativa．Acta Prataculturae Sinica，2015，24（11）：48-57．

2015-03-10；改回日期：2015-05-20

現代農業產業技術體系牧草產業體系（CARS-35-01），國家自然科學基金項目（31101755）和中國農業科學院科技創新工程（ASTIPIAS10）資助。

馮光燕（1988-），男，四川遂寧人，在讀碩士。E-mail：fg62586336＠163．com

*通訊作者Corresponding author．E-mail：wangxuemin＠caas．cn，zhangxq＠sicau．edu．cn