MTS比色法測定小球藻細胞活性的研究

王海英，許 燕，王 溢，甘 科

(中南民族大學 生命科學學院， 武漢 430074)

MTS比色法測定小球藻細胞活性的研究

王海英，許 燕，王 溢，甘 科

(中南民族大學 生命科學學院， 武漢 430074)

為探討MTS法用于小球藻細胞活性快速測定的可行性，研究了小球藻光合作用，細胞密度和溫育溫度對MTS法測定細胞活性的影響，分析了銅離子脅迫中不同生理狀態小球藻的MTS細胞活性值與最大光化學量子產量的相關性.結果表明：MTS能通過小球藻細胞壁在胞內參加反應，反應產物能被檢測到，葉綠體光合作用的電子傳遞及其酶系對MTS測定細胞活性值無影響.MTS細胞活性測定值與藻細胞的密度成線性關系，在37 ℃ 時MTS的反應速率加快，同時藻細胞的MTS細胞活性值和最大光化學量子產量的值呈近似的線性關系，故MTS法能夠快速便捷地測定小球藻細胞的活性.

小球藻；細胞活性；MTS；最大光化學量子產量

小球藻(Chlorella)是一類普生性單細胞綠藻，其培養過程簡單、生長繁殖速度快、生態分布廣，可利用光能進行自養生長，還可在異養條件下生長；小球藻含有多糖和糖蛋白,具有抗腫瘤、抗病源菌、抗病毒感染和增強免疫力等活性[1,2]，在逆境環境條件下(如氮短缺)，小球藻細胞會大量積累油脂[3]；藻細胞還能有效地固定空氣、工業廢氣和可溶性碳酸鹽中的CO2[4]，因此小球藻的應用價值很高.為篩選活力強、生長快、活性代謝產物產量高的小球藻，方便、快捷、準確地檢測在特定環境下生長的藻細胞活性的方法顯得尤為重要.

一般通過分析光合速率和熒光釋放量來測定藻類光合生物細胞活性，但通常需要昂貴的設備儀器，技術操作要求高[5].動物細胞的活性檢測主要通過間接觀察DNA的合成含量和直接檢測細胞代謝活性，前者常用同位素3H-TdR摻入法，設備昂貴且操作復雜，存在放射性污染[6]；而后者常用四甲基偶氮唑鹽(MTT)比色法，在測定時產生不溶于水的結晶物，需要加有機溶劑溶解后方能比色，若溶解不全則會影響測定結果[7]，為解決這一問題，Buttke等設計了一種新型的MTT類似物MTS，它能被活細胞線粒體的琥珀酸脫氫酶降解而產生棕黃色水溶性甲臢，這種帶顏色的物質通過酶聯免疫檢測儀在492 nm處捕捉到其光譜吸收，通過吸光度反映活細胞數量和狀態[8]， MTS法快速準確，已被廣泛應用于動物細胞活性的測定.相比動物細胞，小球藻細胞具有細胞壁和葉綠體，用MTS比色法測定小球藻細胞活性時，細胞壁是否會阻礙MTS進入藻細胞，葉綠體內相關酶和光合作用是否干擾MTS反應等，本文針對這些問題，對MTS法測定小球藻細胞活性的可行性進行了系統研究.

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

實驗藻種蛋白核小球藻(Chlorellapyrenoidosa)來自中南民族大學生命科學學院發酵工程實驗室，經抗生素法制備無菌藻株. MTS (Promega Corporation, WI, USA)，3-(3,4-二氯苯基)-1,1-二甲基脲(DCMU, Sigma Chemical Co)，酶標儀(Multiskan Ascent, Thermo Electron corporation, Shanghai, China)，脈沖調制熒光儀(WATER-PAM, WALZ Germany).

1.2 小球藻的培養

用Bristol培養基進行藻的培養，主要成分為：0.25 g/L NaNO3, 0.075 g/L K2HPO4·3H2O, 0.075 g/L MgSO4, 0.025 g/L CaCl2·2H2O, 0.175 g/L KH2PO4,0.025 g/L NaCl,0.005 g/L FeCl3·6H2O, 1mL Fe-EDTA溶液,40 mL土壤提取液和1 mL/L A5微量元素，A5中包含有以下成分：0.22 g/L ZnSO4·7H2O,2.86 g/L H3BO3,1.81 g/L MnCl2·4H2O,0.079 g/L CuSO4·5H2O,0.039 g/L(NH4)6Mo7O24·4H2O.取對數生長的小球藻以無菌方式接種到新鮮滅菌的Bristol培養基中，用漁用泵通氣，空氣過濾器過濾空氣，熒光燈提供照明，光照強度為4 klx，溫度為25～27℃，連續照明培養.

1.3 銅離子處理

藻生長至對數生長期后進行銅離子脅迫，濃度梯度分別為5, 15, 25, 30, 35 μmol/L，設置對照組，置于搖床中光照強度為4 klx，溫度為25～27℃，連續照明培養40 h.

1.4 細胞密度和細胞活性的測定

用血球計數板法計量細胞密度；細胞活性的測定方法為：取400 μL藻液加上80 μL MTS溶液于1.5 mL的EP小管中.另以400 μL的培養基加上80 μL MTS溶液在相同的條件下作為對照.充分混合后在一定溫度下保溫.以15000 r/min離心1 min，取其上清于96孔板中.置于酶標儀中，在492 nm處測定吸光值.

1.5 葉綠體光合作用抑制

以3-(3,4-二氯苯基)-1,1-二甲基脲作為葉綠體光合作用抑制劑，MTS測定活性前在藻細胞中加入3 μM的DCMU保溫5 min，抑制葉綠體光合作用，另外以不加DCMU的作為對照組.

1.6 葉綠素熒光的測定

[9]，采用脈沖調制熒光儀測定不同濃度銅離子脅迫下的藻細胞的葉綠素熒光.測定前吸取2 mL藻液放入反應小室中，暗適應10 min后測定.光化光為100 μmol·m-2·s-1，閃光時間為1 s，測得藻細胞的最大光化學量子產量(Fv/Fm).

2 結果與分析

2.1 葉綠體對MTS測定細胞活性的影響

圖1為加有葉綠體電子傳遞鏈抑制劑DCMU與對照組藻細胞活性的比較.DCMU是一種葉綠體電子傳遞鏈抑制劑，它抑制了從PSII上的Q向PQ的電子傳遞，進而抑制葉綠體光合作用.結果顯示，經DCMU預處理的藻細胞活性與未經DCMU預處理的對照組細胞無顯著性差異(p>0.05)，可見葉綠體光合作用的電子傳遞及其酶系對用MTS測定細胞活性值不構成影響，即在有光和無光條件下MTS比色法測定細胞活性可用于有光合作用的藻細胞.

圖1 加DCMU與對照藻細胞MTS反應的對比Fig.1 MTS reaction of DCMU-treated Chlorella cells compared with control

2.2 細胞密度對MTS測定細胞活性的影響

活性細胞產生的NADH和NADPH參與 MTS的顏色反應，故492nm處的也吸光值依賴于細胞密度[5].圖2為不同細胞密度的蛋白核小球藻在相同MTS體系下測定的藻細胞活性，經MTS試劑與藻細胞保溫后，在492 nm處測得的吸光值與藻細胞的密度成線性關系(R2=0.9975,n=7).說明用MTS測定藻細胞活性時，每個樣品需要通過稀釋或濃縮將藻細胞密度調整到相同或至少相近的值以確保MTS細胞活性值的可比性.

圖2 藻細胞密度與MTS藻細胞活性間的關系Fig.2 Relationship between MTS cell viability and cell density of Chlorella

2.3 溫度對MTS測定細胞活性的影響

MTS還原反應是一個酶介導的反應[5]，顏色反應與保溫溫度密切相關.圖3為反應的溫度對MTS測定細胞活性的影響.由圖3可見，37℃ 較27℃ 更有利于MTS反應，顏色反應速率明顯加快，為縮短測定時間，當細胞密度較低時反應溫度可選擇在約37℃，若細胞密度高時可適當降低溫度測定細胞活性. 保溫20 min時顏色反應值已能被酶聯儀所捕捉而顯示數據，說明MTS能順利進入有細胞壁的小球藻細胞參加反應并能在一定的反應時間后被檢測，細胞壁不是MTS反應的屏障.

圖3 溫度對MTS測定藻細胞活性的影響Fig.3 Effect of temperature on MTS cell viability of Chlorella

2.4 藻細胞MTS活性與最大光化學量子產量的關系

最大光化學量子產量(Fv/Fm)反映了PSII反應中心光化反應的最大潛在量子產率，多數光合生物在無脅迫的情況下為常數，但當光合生物受到脅迫或傷害時會明顯下降，Fv/Fm具有高靈敏度和特異性，常用于反映藻細胞代謝活性和光合作用效率的大小[9,10].

為了表征MTS法測定的細胞活性對小球藻的光合損傷狀態，本文利用脈沖調制熒光儀測定了不同濃度Cu2+脅迫下的藻細胞的最大光化學量子產量(Fv/Fm)，見圖4中Cu2+濃度為30 μmol/L時藻細胞的492 nm處的吸光值為0.07，Fv/Fm的值降低至0.495，Cu2+濃度為35 μmol/L時，MTS細胞活性值和Fv/Fm變化不大，且藻液發黃出現沉淀，出現藻細胞死亡的現象.電子探測顯微分析顯示，海洋藻類在0.05 mg/L Cu2+中暴露5d 后，代謝作用受阻[11].本文中高于30 μmol/L的Cu2+濃度連續脅迫處理40 h后，MTS法不能很好地表征藻細胞活性，可能由于蛋白核小球藻的代謝作用受阻，導致藻細胞的細胞膜的通透性發生變化，不能把MTS送至線粒體處發生反應，或由于藻細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶在高濃度Cu2+作用下變性，不能把MTS降解成黃色水溶性甲臢，未能測定到MTS細胞活性.當Cu2+≤30 μmol/L時處理的藻細胞MTS活性值與最大光化學量子產量(Fv/Fm)呈良好線性關系(R2=0.9151,n=5)，說明MTS細胞活性值在小球藻存活狀態下的測定值可很好地表征細胞的光合活性，作為損傷度不高的小球藻活性測定的替代方法.

圖4 藻細胞的最大光化學量子產量(Fv/Fm)與 MTS測定藻細胞活性間的關系Fig.4 Relationship between MTS reduction and Fv/Fm of Chlorella

3 結語

小球藻細胞壁不會阻礙MTS進入細胞內參與反應，光合作用的電子傳遞及其酶系對MTS測定細胞活性值沒有影響；測定細胞活性時需要將藻細胞稀釋到相近的濃度，37℃的溫度有利于MTS的反應速率加快，縮短測定時間；在藻細胞存活狀態下，藻細胞的MTS細胞活性值和脈沖調制熒光儀測定的藻細胞樣品的最大光化學量子產量的值間有較好的線性關系，可以很好地用來表征藻細胞的活性.

參 考 文 獻

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Research on the Cell Viability ofChlorellaDetermined by MTS Colorimetric Assay

WangHaiying,XuYan,WangYi,GanKe

(Collage of Life Sciences, South-Central University for Nationalities, Wuhan 430074, China )

To investigate the feasibility of MTS colorimetric assay for cell viability determination ofChlorella, the effect of photosynthesis, cell density and incubation temperature were studied. The relation between the MTS cell viability value and the maximal photochemical efficiency (Fv/Fm) under different growing status with the stress of heavy metal (Cu2+) was analyzed. The results showed that MTS solution could diffuse across the cell wall ofChlorellaand the reaction product could be detected. The photosynthetic electron transport and the enzyme of chloroplasts had no impact on the determination of MTS cell viability. The cell viability value was linearly proportional with cell density and the MTS reaction rate was accelerated at 37℃. There was approximately linear dependency between the maximal photochemical efficiency (Fv/Fm) and the value of MTS. This showed that MTS assay could be used for the rapid and convenient determination of cell viability ofChlorella.

Chlorella; cell viability; MTS; the maximal photochemical efficiency

2014-11-05

王海英(1974-),女,教授,博士,研究方向:微藻生物技術,E-mail: wanghaiying@mail.scuec.edu.cn

質檢公益性行業科研專項(201310141)

Q28; Q2-33

A

1672-4321(2015)03-0033-04