AQP-8和Caspase7在羊水過少孕婦胎膜組織中的表達

李小琴，解雁飛

(延安大學附屬醫院產科，陜西 延安716000)

AQP-8和Caspase7在羊水過少孕婦胎膜組織中的表達

李小琴，解雁飛

(延安大學附屬醫院產科，陜西 延安716000)

目的 探討水通道蛋白-8(AQP-8)和凋亡蛋白Caspase7在羊水量過少產婦和羊水量正常的產婦胎膜中的表達差異。方法 采用免疫組化方法(SP法)分別檢測30例羊水量過少實驗組和30例羊水量正常對照組產婦胎膜組織中AQP-8和Caspase7的蛋白表達水平，并分析這兩種蛋白的表達強度。結果 AQP-8和Caspase7蛋白在實驗組與對照組產婦的胎膜中均有陽性表達。實驗組胎膜中的AQP-8蛋白表達水平明顯比對照組低，Caspase7的表達卻明顯比對照組高，而兩者的表達差異均有統計學意義(t值分別為4.56、2.60，均P<0.05)；同時AQP-8與Caspase7在實驗組胎膜細胞中的表達卻呈負相關(r=-0.66，P<0.05)。結論 羊水量過少孕婦胎膜中AQP-8蛋白的低表達與Caspase7蛋白的高表達，提示AQP-8和Caspase7在產婦胎膜中的異常表達可能是羊水過少發生的原因之一。

羊水過少；胎膜；水通道蛋白；凋亡蛋白；免疫組織化學

臨床上將妊娠晚期(妊娠期超過28周)羊水量少于300mL者稱為羊水過少[1]。羊水過少是婦產科常見的妊娠合并癥，可明顯使孕婦剖宮產率增高，同時增加了圍生兒的患病率和死亡率。羊水過少會使宮縮時子宮與胎兒之間的緩沖減少，臍帶也容易受壓，使胎兒發生宮內缺氧率大大增加[2]；同時羊水過少可使肺的膨脹減小，從而阻礙肺的發育，使新生兒窒息率增加[3]。目前仍有一部分羊水過少的病因尚不明確，因此通過研究羊水平衡的調控對預防、診斷和治療羊水過少有著重要意義。

近年來，水通道蛋白(aquaporin，AQP)與凋亡蛋白Caspase在孕婦胎盤胎膜上的分布及其與羊水量調節關系的研究已漸漸引起國內外學者的重視。AQP作為跨膜轉運水分子的通道之一，可能參與孕婦體內的羊水平衡調控，參與母胎之間的液體交換；Caspase7作為一種凋亡效應Caspase，是細胞凋亡途徑中關鍵蛋白酶，也是細胞凋亡途徑中蛋白酶聯反應的必經之路，其在孕婦胎盤胎膜細胞中的正常表達能確保其正常有序的凋亡，從而維持著母胎之間的物質交換，保證胎兒的正常發育。因此，本研究通過運用免疫組化的方法檢測AQP-8和Caspase7在羊水量正常和羊水過少孕婦胎膜中的表達差異及其相關性，進一步探討羊水過少的病因。

1 對象和方法

1.1 研究對象

隨機選擇2013年6至11月在延安大學附屬醫院產科住院的足月孕(37～41周)擇期剖宮產分娩的羊水量正常產婦30例為羊水量正常對照組；隨機選取同期在延安大學附屬醫院產科住院的足月孕(37～41周)剖宮產分娩的羊水量過少產婦30例為羊水量過少實驗組。診斷標準以謝幸主編的《婦產科學》(2013年第8版)為準。

此外，兩組均排除合并妊娠期高血壓疾病、胎膜早破、胎兒窘迫、胎兒宮內生長受限、胎兒畸形及其他并發癥，無藥物服用史，無縮宮素引產史及母體脫水等因素。本研究得到本院倫理委員會的支持，所有研究對象均簽署知情同意書。

1.2 標本的采集和選擇

常規消毒鋪巾下，行子宮下段剖宮產術，在胎盤娩出后10min內分離胎盤胎膜組織，力求保持組織新鮮，勿使其干燥，取胎膜約2.0cm×2.0cm大小，將胎膜標本置于0.9%的生理鹽水中漂洗3次，去除血凝塊及血液，置于4%的多聚甲醛緩沖固定液中固定并編號。固定后充分水洗已固定的胎膜標本，以減少固定液造成的人為假象，并將其置于已標號的組織盒中蓋緊，于全自動脫水機中常規酒精脫水。行石蠟包埋組織塊，浸蠟。

1.3 研究方法及結果判定

1.3.1 免疫組化方法

1.3.1.1 石蠟組織的處理 取出已制備好并保存在冰箱中的石蠟組織塊，并請延安大學附屬醫院病理科的資深切片專家連續切片2張。用多聚賴氨酸粘附載玻片將組織薄片固定并標記后，將切片依次置入二甲苯中脫蠟、梯度酒精中水化、蒸餾水洗沖。最后用已配制好的磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗3次，將切片置于耐高溫染色架后放入蒸餾水中，防止切片干燥，以待抗原修復。

1.3.1.2 本實驗操作步驟 嚴格按照抗體說明書進行：①根據第一抗體的要求，對胎膜組織進行抗原熱修復；②消除內源性過氧化物酶活性。向免疫組化染色孵育盒底添加少量蒸餾水，將切片依次置入孵育盒里，然后向切片上的組織快速滴加過氧化氫溶液，將孵育盒蓋嚴后置入37℃恒溫培養箱中孵育20min，然后取出孵育盒，將切片用PBS沖洗；③滴加一抗抗體稀釋液。按照說明書將0.1mL的蒸餾水分別加入兔抗人AQP-8抗體及兔抗人Caspase7抗體(凍干粉)中，溶解混勻后制備成抗體原液，隨后配制一抗抗體稀釋液(抗體原液與PBS的比例為1:300)。向切片上的組織快速滴加適量的一抗抗體稀釋液后，室溫下孵育60min后，PBS緩沖液沖洗；④滴加二抗。將切片放置在免疫組化孵育盒上，向切片快速滴加二抗，置于室溫下孵育20min后，用PBS緩沖液沖洗；⑤顯色液(DAB)顯色。將切片放置在免疫組化孵育盒上，向切片依次快速滴加適量已配制好的新鮮DAB顯色試劑，室溫下染色約3～5min后蒸餾水沖洗終止顯色；⑥復染、脫水、透明及封片。將切片置入蘇木素染液中進行復染，把復染后的組織切片依次放入梯度酒精中脫水，二甲苯中透明，最后滴加中性樹膠的同時加載蓋玻片封片并粘貼標簽。

1.3.2 結果的判定

以鏡下在細胞內看到棕色或黃色顆粒者作為判定陽性細胞的標準。每張切片在高倍鏡(×400)下隨機選取5個視野，觀察所選擇視野中的所有細胞，同時記錄陽性細胞百分數(陽性細胞百分數=陽性細胞數/計算的胎膜細胞數)，然后計分(P)：0分為<5%的胎膜滋養細胞呈陽性；1分為5%～10%的胎膜細胞呈陽性；2分為11%～50%的胎膜細胞呈陽性；3分為>50%的胎膜細胞呈陽性。同時對多數陽性細胞呈現的棕黃色計分(I)：3分為強著色；2分為中等著色；1分為淺著色。最終的結果為組織學積分(H)=P+I。

1.4 統計學方法

2 結果

2.1 水通道蛋白-8和凋亡蛋白Caspase7在胎膜組織中的表達定位

本研究通過用免疫組化實驗方法檢測AQP-8、Caspase7蛋白在兩組產婦胎膜組織中的表達，結果顯示AQP-8、Caspase7蛋白在兩組產婦的胎盤和胎膜組織的細胞中均有陽性表達，呈棕黃色，其陽性表達部位主要分布于胎膜上皮細胞的細胞膜和胞漿中。AQP-8蛋白在羊水過少患者胎膜組織中表達呈弱陽性，同時在正常孕產婦的細胞中呈中度陽性表達，見圖1、圖2；Caspase7在羊水過少患者胎膜上皮細胞中呈中度陽性表達，而在正常孕產婦的細胞中呈弱陽性表達，見圖3、圖4。

圖1 羊水過少患者胎膜中AQP-8的表達

Fig.1 The expression of AQP-8 in membranes of patientswith oligohydramnio

圖2 正常產婦胎膜中AQP-8的表達

Fig.2 The expression of AQP-8 in membranes of normalpuerpera

圖3 羊水過少患者胎膜中Caspase7的表達

Fig.3 The expression of Caspase7 in membranes of patients with oligohydramnios

圖4 正常產婦胎膜中Caspase7的表達

Fig.4 The expression of Caspase7 in membranes of normal puerpera

2.2 水通道蛋白-8和凋亡蛋白Caspase7在胎膜組織中的表達比較

AQP-8和Caspase7在兩組孕產婦胎膜組織中陽性表達部位主要分布于胎膜上皮細胞的細胞膜和胞漿中。經兩樣本比較的t檢驗分析得出：實驗組的AQP-8蛋白表達水平低于對照組(P<0.05)，而實驗組孕產婦胎膜細胞中的Caspase7表達水平高于對照組(P<0.05)，差異均有統計學意義，見附表。因此可以認為孕產婦發生羊水過少與胎膜細胞中AQP-8的低表達及Caspase7的高表達有關。

Table Comparison of histologic integral of AQP-8 and Caspase7 expression in membranes

2.3 水通道蛋白-8和凋亡蛋白Caspase7在胎膜組織中的表達關系

經Spearman等級相關分析后發現：正常對照組孕產婦胎膜上皮細胞中AQP-8與Caspase7表達的相關系數rs=0.14，P>0.05，差異無統計學意義；而在實驗組rs=-0.66，P<0.05，差異有統計學意義，提示正常對照組孕產婦胎膜上皮細胞中AQP-8與Caspase7的表達并無相關性關系，而在實驗組胎膜細胞中AQP-8與Caspase7的表達水平呈負相關。

3 討論

3.1 水通道蛋白與凋亡因子

AQP從結構上而言是一種膜整合蛋白，可介導小分子物質快速被動跨膜轉運。除轉運水分子外，AQP-8還被發現可以轉運嘌呤、嘧啶、多元醇等小分子物質，因此推測AQP-8參與了水和其它溶質由母體向胎兒的轉運過程，決定羊水的膜內吸收途徑。有學者研究發現，在一些腫瘤細胞中如肺癌、白血病細胞等也存在AQP-8[4-5]。缺氧誘導因子的表達增加后會使AQP的表達上調[6]。自Afire等在1988年發現AQP后，目前已在哺乳動物體內發現了13種AQP，它們統稱為AQP家族(AQPs)。它們保持人體細胞內外環境的穩態，同時也參與機體部分重要的生理功能。

Caspase家族在細胞凋亡程序中起著關鍵性作用。細胞凋亡普遍存在于自然界，對于維持人體的穩定性和保證人體的正常發育均具有重要的意義。一旦體內的凋亡機制發生異常將引起多種疾病的發生。Caspase7即為半胱氨酸蛋白酶-7，是由303個氨基酸組成的蛋白質，分子量約為35kd。作為Caspases家族中最重要的成員之一，Caspase7是細胞凋亡共同通路的效應分子，可誘導細胞凋亡。在正常情況下，Caspase家族介導的細胞凋亡途徑有3種，但無論哪條通途，最終都匯合于效應Caspase(包括Caspase3、Caspase7)。Caspase7在細胞內通常以無活性的酶原形式存在，一旦被激活就啟動凋亡程序，并以級聯放大方式傳導和放大凋亡信號，向下游凋亡執行因子傳遞，最終導致細胞凋亡。同時，Caspases之間還能相互激活，活化后的Caspase能特異性的識別底物，具有高度的特異性，保證了其在細胞凋亡程序中的專一性。胰島素樣生長因子可調控Cyt-C釋放入胞質，從而抑制Caspase3引發的細胞凋亡[7-13]。

3.2 水通道蛋白、凋亡因子與羊水過少

孕婦胎盤胎膜上AQPs的表達及其與妊娠相關疾病關系的研究始于2000年，目前在孕婦胎盤或胎膜上僅發現有AQP-1、AQP-3、AQP-8和AQP-9的表達，暫時未發現其他AQP。為了解AQPs與羊水平衡的關系，Mann等(2006年)將AQP1基因敲除小鼠與正常小鼠相比，羊水量明顯增加，故推測胎膜上的AQP1缺陷可能是導致原發性羊水過多發生的病因。同時，Zhu等[14]在研究原發性羊水過多的病因時，發現其羊膜上皮細胞、絨毛膜滋養細胞中的AQP-8表達較正常組有明顯的升高。劉慧妹等[15]也運用RT-PCR檢測了5例羊水過多胎膜組織中AQP-1、-3、-8、-9 mRNA的表達，發現羊水過多組孕婦胎膜中AQP-8 mRNA表達顯著高于正常組。熊正方等[16]研究了5例正常和羊水過少孕婦的胎盤上AQP-1、-3、-8、-9 mRNA的表達，結果顯示羊水過少組的胎盤組織中僅有AQP-8 mRNA表達顯著低于正常組孕婦，這與Mann等的研究結果不一致。Yasui等(1997年)提出，對于AQPs調節羊水量的機制不僅與羊水的吸收有關，可能也與羊水的生成如胎肺分泌物有關。究竟AQPs是羊水量異常的病因，還是羊水量異常發生時的代償機制，仍有待于進一步的研究。

正常孕婦的胎膜細胞在胎盤胎膜發育全過程中進行有序的細胞凋亡。Caspase7在正常妊娠胎膜絨毛滋養細胞的正常表達可以確保正常胎膜細胞的凋亡，維持著母胎之間的物質交換及胎兒的正常發育。當Caspase7的表達異常時可誘發細胞凋亡程序發生障礙，滋養細胞凋亡增加后，其細胞體積縮小，從而導致大多數滋養細胞表面的AQP失活，不再介導水分子的跨膜運動，細胞對羊水的通透性下降，從而導致妊娠羊水過少的發生。因此，如果Caspase的表達異常是引起羊水過少的發病機制，那Caspase可作為一種新的治療羊水過少的手段。

本研究發現，在光鏡下AQP-8和Caspase7蛋白在兩組產婦胎膜細胞的細胞膜和細胞質中均有表達，在陽性細胞的細胞膜和細胞漿中均可見明顯的棕黃色染色陽性顆粒。與正常對照組比較，實驗組胎膜細胞中AQP-8蛋白的表達明顯降低；而Caspase7的表達以中度及強陽性為主，升高明顯，差異均有顯著性(均P<0.05)。由此推測，在實驗組孕婦胎膜細胞上Caspase7的表達影響AQP的結構和功能，會使AQP-8的表達下降，從而改變細胞對羊水的通透性，減少羊水膜內途徑的重吸收，阻止過多的液體重吸收進入胎兒血循環，達到平衡羊水量的目的。

3.3 展望

本研究表明AQP-8及Caspase7蛋白在羊水過少孕婦的胎膜組織中表達異常，為母胎液體交換及羊水平衡的分子機制提供了理論依據，同時，為羊水過少的臨床診斷及治療提供了新的思路，進而改善臨床最后的結局，最終降低剖宮產率、圍生兒病率和死亡率，提高了圍產醫學質量。但是，AQP-8及Caspase7蛋白調節胎膜羊水量平衡的機制還有待進一步研究，以后期望通過擴大樣本量進行多因素分析研究，來尋找羊水過少發生的生物學特性，進一步揭示其發生、發展的規律，為羊水過少的早預防、早診斷和早治療提供新的思路。

[1]謝幸,茍文麗.婦產科學[M].8版.北京:人民衛生出版社,2013:138.

[2]候麗蓉,李世恭,王麗紅.羊水過少172例臨床分析[J].山西醫藥雜志,2009,38(5):437-478.

[3]陳春曉,黃芳,馬亞娜.中國孕產婦羊水過少對圍生兒結局影響的Meta分析[J].中國婦幼健康研究,2013,24(2):162-166.

[4]Arrighi S, Aralla M, Genovese P,etal.Undernutrition during foetal to prepubertal life affects aquaporin 9 but not aquaporins 1 and 2 expression in the male genital tract of adult rats[J]. Theriogenology,2010,74(9):1661-1669.

[5]Shinkai Y, Sumi D, Toyama T,etal.Role of aquaporin 9 in cellular accumulation of arsenic and its cytotoxicity in primary mouse hepatocytes[J]. Toxicol Appl Pharmacol,2009,237(2):232-236.

[6]Ding J Y, Kreipke C W, Speirs S L,etal. Hypoxia-inducible factor-1alpha signaling in aquaporin upregulation after traumatic brain injury[J].Neurosci Lett,2009, 453(1):68-72.

[7]Lin S, Rhodes P G, Cai Z.Whole body hypothemia broadens the therapeutic window of intranasallv administered IGF-1 in a neonatal rat model of cerebral hypoxia ischemia[J].Brain Res,2011,1385:246-56.

[8]Rubovitch V, Edut S, Sarfstein R,etal.The intricate involvement of the insulin-like growth factor receptor signaling in mild traumatic brain injury in mice[J].Neurobiol Dis,2010,38(2):299-303.

[9]葉飛,席剛明,陳濤,等.胰島素樣生長因子1在腦梗死大鼠神經干細胞增殖、遷移和分化中的作用[J].中國組織工程研究與臨床康復,2010,14(6):1125-1129.

[10]Sundberg M, Hyysalo A, Skottman H,etal.A xeno-free culturing protocol for pluripotent stem cell-derived oligodendrocyte precursor cell production[J].Regen Med,2011,6(4):449-460.

[11]Pérez-Martín M, Cifuentes M, Grondona J M,etal.IGF-I stimulates neurogenesis in the hypothalamus of adult rats[J].Eur J Neurosci,2010,31(9):1533-1548.

[12]李智勇,夏鷹,陳曉東,等.IGF-1對大鼠缺血、缺氧神經元p-JNK及p-P38表達的影響[J].重慶醫學,2012,4(16):1572-1574.

[13]Lin S, Fan L W, Rhodes P G,etal.Intranasal administration of IGF-1 attenuates hypoxic ischemic brain injury in neonatal rats[J].Exp Neurol,2009,217(2):361-370.

[14]Zhu X, Jiang S, Hu Y,etal.The expression of aquaporin 8 and aquaporin 9 in fetal membranes and placenta in term pregnancies complicated by idiopathic polyhydramnios[J].Early Hum Dev,2010, 86(10):657-663.

[15]劉慧妹,郝榮增,熊正方.羊水過多孕婦胎膜組織中水通道蛋白-1、3、8、9mRNA的表達[J].中華圍產醫學雜志,2009,12(3):197-200.

[16]熊正方.劉慧姝.郝榮增.水通道蛋白3、8、9mRNA在人羊水過少胎盤組織中的表達[J].中華生物醫學工程雜志,2010,16(2) : 155-158.

[專業責任編輯：楊文方]

Expression of AQP-8 and Caspase7 in membranes of pregnant women with oligohydramnios

LI Xiao-qin, XIE Yan-fei

(DepartmentofObstetrics,Yan’anUniversityAffiliatedHospital,ShaanxiYan’an716000,China)

Objective To explore the difference in expressions of aquaporin 8 (AQP-8) and Caspase7 in membranes of puerpera with oligohydramnios and of normal puerpera. Methods Immunohistochemistry was performed to determine the expressions of AQP-8 and Caspase7 in membranes of experimental group (n=30, puerpera with oligohydramnios) and of control group (n=30, normal pregnant women), and the expression strength was analyzed. Results The expressions of AQP-8 and Caspase7 in membranes of two groups were positive. Compared with the control group, the expression of AQP-8 was lower and that of Caspase7 was higher in the experimental group, and the differences were significant (tvalue was 4.56 and 2.60, respectively, bothP<0.05). The expression of AQP-8 was negatively correlated with that of Caspase7 in the experimental group (r=-0.66,P<0.05).Conclusion The abnormal expression of AQP-8 and Caspase7 in membranes of puerpera may be one of the causes of oligohydramnios.

oligohydramnios；membranes；aquaporin(AQP)；Caspase7；immunohistochemistry

2014-11-03

李小琴(1973-)，女，副主任醫師，主要從事產科臨床工作。

10.3969/j.issn.1673-5293.2015.03.017

R714.25

A

1673-5293(2015)03-0450-03