棉花微管結合蛋白基因GhCLASP1的克隆與表達分析

朱守鴻，薛 飛*，趙蘭杰，劉永昌，李艷軍，熊顯鵬，孫 杰

（1石河子大學農學院/新疆生產建設兵團綠洲生態農業重點實驗室，新疆石河子832003；2石河子大學生命科學學院，新疆石河子832003）

棉花微管結合蛋白基因GhCLASP1的克隆與表達分析

朱守鴻1，薛 飛1*，趙蘭杰2，劉永昌1，李艷軍1，熊顯鵬1，孫 杰1

（1石河子大學農學院/新疆生產建設兵團綠洲生態農業重點實驗室，新疆石河子832003；2石河子大學生命科學學院，新疆石河子832003）

CLASP蛋白（CLASPs）是一種能夠特異地與微管結合，參與調節微管結構與功能的微管結合蛋白（MAPs），在植物細胞形成、細胞伸長等方面起著關鍵作用。該研究利用電子克隆結合RT-PCR技術從陸地棉（Gossypium hirsutum L.）中克隆獲得1個CLASP基因，命名為GhCLASP1（NCBI登錄號為KP742966）。序列分析顯示，GhCLASP1屬于CLASP基因家族，開放閱讀框長度為4 188 bp，編碼含1 395個氨基酸殘基的蛋白；Gh-CLASP1蛋白含有1個HEAT重復結構域和2個CLASP-N端結構域。進化分析表明，GhCLASP1與可可樹（Theobroma cacao）CLASP蛋白的親緣關系最近。q RT-PCR分析表明，GhCLASP1在棉花的根、莖、葉、花及纖維發育的不同時期均有表達，且GhCLASP1基因表達量最大值出現在纖維發育次生壁加厚期（開花后27 d），推測GhCLASP1基因可能對棉花纖維次生壁的形成起著重要的作用。利用本氏煙草（Nicotiana benthamiana）葉片瞬時表達系統對GhCLASP1基因編碼的蛋白進行亞細胞定位結果顯示，GhCLASP1蛋白定位在細胞膜上。上述結果為進一步研究CLASP基因在棉花中的功能奠定了基礎。

棉花；纖維發育；CLASP；表達分析；亞細胞定位

微管是植物細胞骨架的重要組成部分，在植物細胞分化、生長（伸長）和次生壁加厚以及物質運輸、信號轉導等方面均起著廣泛而重要的作用，尤其是在棉纖維伸長和次生壁合成過程中發揮著重要的作用［1-4］。

CLASP蛋白（CLIP-Associated Proteins，CLASPs）是一種能夠特異地與微管結合，參與調節微管結構與功能的微管結合蛋白（microtubule-associated proteins，MAPs）。它屬于膜蛋白的基質結合分子—1［5］，能夠特異地結合在微管的正端，又稱為微管正端跟蹤蛋白。同時，CLASP蛋白和微管結合也受到GSK3β（glycogen synthase kinase 3β）激酶磷酸化調節，該調節對于影響細胞內微管局部的穩定性起到很重要的作用［6］。有研究表明，kinesin-13家族使微管變得不穩定，增加崩塌的機會，使微管解聚。相反，CLASP蛋白具有調節動態微管的穩定性，促進微管多聚的功能［7］，在細胞內抑制微管崩塌的機會，起到重建因子的作用［8］。Ambrose等［9-11］發現SNX1（sorting nexin 1）通過和CLASP相互作用與微管相連，CLASP依靠生長素運輸通路PIN2（PIN-FORMED 2）回收調節微管。

在擬南芥基因組中CLASP基因只有1個拷貝，沒有發現CLIPs（cytoplasmic linker proteins）的同源物，表明CLASP在植物中具有獨特的作用［12］。與野生型擬南芥植株相比，CLASP的功能缺失突變體clasp-1表現出株型矮小，頂端優勢不明顯，葉表皮毛分支數目減少，下胚軸及根生長發育緩慢，側根增多，細胞伸長受阻等不良表型［9，12］。當用微管解聚藥劑處理突變體clasp-1時，突變體的根毛異常腫脹，下胚軸及根生長更加緩慢［12］。由于擬南芥表皮毛和棉纖維發育機制相似，棉花纖維細胞形狀為直線形、無分支，推測CLASP在棉花中可能具有相同的生物學功能。鑒于CLASP家族的基因可能參與并影響了植物生長發育、細胞內物質的運輸等主要生理過程，而棉花中有關CLASP基因的數量、功能的研究還未見有報道。所以，棉花中CLASP基因在纖維發育中的作用值得深入研究。

棉纖維細胞是研究植物細胞伸長和細胞壁纖維素生物合成的理想模型。本研究利用擬南芥At-CLASP蛋白為查詢序列，查詢雷蒙德氏棉基因組數據庫，克隆陸地棉中的CLASP基因，并對其序列及在棉纖維中的表達模式進行分析，以理解其在棉花生長發育中的作用，揭示該類基因家族在棉纖維發育及棉花品質形成等方面的分子機制，為進一步探索CLASP基因在棉花中的功能奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材 料

陸地棉（Gossypium hirsutum L.）品種‘新陸早33號'種子由石河子大學棉花研究所提供。種植在石河子大學試驗站。為了觀察基因的時空表達模式，取棉花種子，剝去種皮后用0.1%HgCl2浸泡10 min，滅菌水沖洗3～4次，播種于1/2 MS培養基上，28℃暗培養4 d，用霍格蘭營養液培養至2片真葉時，取幼苗的根、莖、葉樣品；在田間棉花盛花期掛牌標記當日開花花蕾，分別摘取開花后3、6、9、12、15、18、21、24、27和30 d的棉鈴，室內剝取纖維樣品；從田間植株摘取花。將上述材料液氮速凍后保存于—80℃冰箱，用于RNA的提取。

1.2 方 法

1.2.1 棉花總RNA提取及cDNA第一鏈合成 采用CTAB法提取棉花樣品總RNA［13］，用DNase I處理后，利用ND1000紫外分光光度計測定OD260和OD280值，計算RNA的濃度與純度。用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性，保存于—80℃備用。按照Reverse Transcriptase M-MLV（RNase H-）說明書合成cDNA的第一鏈。

1.2.2 棉花GhCLASP1基因克隆 以擬南芥At-CLASP基因（AT 2G20190）作為探針序列，與二倍體雷蒙德氏棉的基因組序列進行Blast比對（http：//www.phytozome.net/），獲得其同源基因，用Primer3設計擴增開放閱讀框的引物（表1）。

以棉纖維cDNA為模版進行PCR擴增，反應體系含10×buffer 2μL、2.5 mmol·L—1d NTP 1.6 μL、c DNA模版2μL、5 U·μL—1LA Taq DNA聚合酶0.2μL、10μmol·L—1上下游引物各1μL，補dd H2O至20μL。PCR反應程序94℃預變性5 min；94℃變性45 s，58℃退火45 s，72℃延伸4.5 min；重復32個循環；72℃延伸10 min。PCR產物用1%瓊脂糖電泳進行檢測，回收并純化后連接至p MD20-T載體，轉化大腸桿菌TOP10感受態細胞融合表達載體。構建好的載體通過限制性內切酶KpnⅠ和Bam HⅠ進行酶切鑒定，鑒定正確的重組質粒轉入農桿菌GV3101中。經過轉化液（100 μmol·L—1AS和10 mmol·L—1MgSO4）重懸的農桿菌注入生長3周的本氏煙草幼苗的葉片背面，將注射后的本氏煙草放入25℃、16 h/18 h光暗周期的培養箱中共培養3 d后，在激光共聚焦顯微鏡（Leica TCS SP5）下檢測熒光。（本實驗室保存），挑取單菌落，提取質粒進行PCR和酶切鑒定，鑒定正確的質粒送至北京華大基因公司測序。

1.2.3 GhCLASP1基因序列的生物信息學分析

用ProtParam（http：//web.expasy.org/protparam/）分析蛋白質的基本理化性質；用SOPMA軟件（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page＝/NPSA/npsa_sopma.html）在線預測和分析蛋白質的二級結構組成形式；用EBLEBI（http：//www.ebi.ac.uk/interpro/search/sequence-search）和NCBI的Blast P分析氨基酸序列的蛋白質保守區；采用DOG 2.0軟件繪制蛋白結構域圖；用WOLF PSORT（http：//psort.hgc.jp/）進行信號肽及亞細胞定位分析；采用Vector NTI和Clustal X進行多重序列比對及同源性比對，采用MEGA 6.0軟件構建進化樹分析。

1.2.4 GhCLASP1基因在棉花不同組織中的表達分析 根據GhCLASP1基因的cDNA序列，設計特異引物，利用q RT-PCR方法，以根、莖、葉、花和不同發育時期的棉纖維cDNA為模板，進行PCR擴增，檢測GhCLASP1基因在不同組織的表達情況。在羅氏LightCycler480實時熒光定量PCR儀上進行，內參基因為UBI，程序為94℃預變性1 min，95變性15 s，60℃退火20 s，72℃延伸30 s，45個循環。實驗重復3次，每次實驗3個重復，按照2—ΔΔCt法分析結果。

1.2.5 亞細胞定位載體構建及觀察 使用本實驗室保存的亞細胞定位瞬時表達載體pCambia1300221-GFP，構建GhCLASP1基因的植物亞細胞定位載體。分別將GhCLASP1全長CDS克隆到表達載體p Cambia1300221-GFP的KpnⅠ和Bam HⅠ之間，構建p Cambia1300221-GFP-CLASP

2 結果與分析

2.1 GhCLASP1基因的克隆及序列分析

利用擬南芥AtCLASP基因（AT 2G20190）序列作為探針，在二倍體雷蒙德氏棉中發現4個同源性較高的基因，其序列號分別為Gorai.001G235400.1、Gorai.004G223500.1、Gorai.001G183300.1和Gorai. 006G054600.1。由于它們在微管的動態性和組織結構方面的作用及其在棉花纖維發育中的功能還未知，選取其中1個在棉纖維發育過程中具有優勢表達的基因（Gorai.006G054600.1）為研究對象，其序列全長為12 641 bp，包含長度為4 188 bp的開放閱讀框（ORF），與擬南芥AtCLASP基因ORF核苷酸序列的相似性為60.52%，氨基酸序列一致性為53.70%。以‘新陸早33號'棉纖維cDNA為模板，用特異引物GhCLASP1F和GhCLASP1R，進行RT-PCR擴增，經1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，獲得1條約4 200 bp目的條帶（圖1）。回收目的片段，測序結果分析顯示擴增獲得的cDNA序列包含長度為4 188 bp的ORF，編碼1 395個氨基酸，與Gorai.006G054600.1序列相似性為98.69%，氨基酸序列一致性為97.71%，與陸地棉Cot AD_48232序列相似性為98.40%，氨基酸序列一致性為98.09%，表明四倍體陸地棉與二倍體雷蒙德氏棉不同的種間核酸序列之間存在一些差異。鑒于棉花中CLASP基因尚未見到相關研究報道，將其命名為GhCLASP1（NCBI登錄號為KP742966）。

2.2 GhCLASP1基因編碼蛋白的生物信息學分析

從GhCLASP1基因cDNA序列推測GhCLASP1蛋白包含1 395個氨基酸殘基，運用ProtParam預測該蛋白的基本理化性質。結果表明，GhCLASP1成熟蛋白的分子式是C6808H10948N1904O2090S69，分子量為155.125 4 k D，理論等電點為6.39，負電荷的氨基酸殘基數（Asp＋Glu）是166，正電荷的氨基酸殘基數（Arg＋Lys）是156；脂肪系數為91.39，總平均親水性為0.212，不穩定系數是47.69。

利用SOPMA在線預測分析GhCLASP1蛋白的二級結構，結果表明，該蛋白主要由α-螺旋、延伸直鏈、β-轉角和無規則卷曲4種結構形式構成，α-螺旋包含747個氨基酸，約占53.55%；延伸直鏈包含55個氨基酸，約占3.94%；β-轉角包含37個氨基酸，約占2.65%；無規則卷曲包含556個氨基酸，約占39.86%。可見，α-螺旋是該蛋白二級結構的主要組成部分。

圖1 GhCLASP1基因RT-PCR擴增M.MarkerⅢ；1～2.GhCLASP1 PCR擴增結果Fig.1 Electrophoresis images of the RT-PCR amplification of GhCLASP1 gene M.MarkerⅢ；1—2.The amplified products of GhCLASP1

圖2 GhCLASP1基因與陸地棉Cot AD-48232和AtCLASP基因的蛋白結構比較黑色和斜線區域分別表示CLASP-N端結構域和HEAT重復結構域Fig.2 GhCLASP1 gene and Gossypium hirsutum CotAD-48232 and AtCLASP gene protein structure Black area and that filled with oblique lines represent the CLASP-N terminal and HEAT repeat domain of protein，respectively

圖3 GhCLASP1與其它植物CLASP蛋白的進化樹分析系統樹各分支上數字是Bootstrap 1 000次循環檢驗的置信度；標尺代表遺傳距離；三角符號代表GhCLASP1Fig.3 Phylogenic relationship of GhCLASP1 and other plant CLASP proteins The numbers on the tree branches represent bootstrap confidence values as bootstrap is 1 000；The scale bar represents genetic distance；Triangle stands for GhCLASP1

為了進一步確定GhCLASP1基因是否屬于CLASP家族，利用EBL-EBI在線分析，結合NCBI中Blast P比對，對該基因氨基酸序列進行蛋白質保守區分析，發現GhCLASP1基因具有1個HEAT重復結構域和2個典型的CLASP-N端結構域，該CLASP基因屬于典型的CLASP基因家族成員，其位置如圖2所示。由WOLF PSORT軟件在線預測該蛋白的信號肽及亞細胞定位情況表明，Gh-CLASP1定位在細胞膜上。

2.3 GhCLASP1蛋白多重序列比對和蛋白進化樹分析

為了解棉花GhCLASP1與其他植物CLASP蛋白的親緣關系，利用Clustal X軟件和MEGA6.0軟件將GhCLASP1氨基酸序列與NCBI上公布的其他植物CLASP蛋白進行多重序列比較，結果（圖4）表明，棉花GhCLASP1與GeneBank中葡萄、桑樹、番茄等植物的序列相似性均較低，與雷蒙德氏棉和可可樹相似性較高，與陸地棉Cot AD-48232序列的相似性最高，其同源區域主要集中在CLASP-N端結構域，即在N端含有2個串聯的CLASP-N端結構域（圖4）。基于棉花GhCLASP 1及其它植物CLASP基因蛋白序列構建系統進化樹，分析結果（圖3）表明，棉花GhCLASP1同陸地棉Cot AD-48232基因在同一個進化分支，與擬南芥、煙草等物種CLASP基因遺傳距離較遠。

圖4 GhCLASP1與擬南芥AtCLASP等其他植物蛋白的CLASP-N端結構域多重序列比對所用植物CLASP包括陸地棉（Cot AD_48232）、雷蒙德氏棉（Gorai.006G054600）、可可樹（XP007034511）、擬南芥（At2G20190）、蓮藕（XP010263998）、葡萄（XP002265367）、桑樹（XP010109669）、番茄（XP004247111）和茸毛煙草（XP009589791）；黑色箭頭表示2個CLASP-N端結構域Fig.4 Amino acid sequences alignment of GhCLASP1 and other plant CLASP proteins The plant CLASP sequences used are Gossypium hirsutum（Cot AD_48232），Gossypium raimondii（Gorai.006G054600），Theobroma cacao（XP007034511），Arabidopsis thaliana（At2G20190），Nelumbo nucifera（XP010263998），Vitis vinifera（XP002265367），Morus notabilis（XP010109669），Solanum lycopersicum（XP004247111）and Nicotiana tomentosiformis（XP009589791）；The black arrows marked with two CLASP-N terminal domain of protein

2.4 GhCLASP1基因在棉花不同組織中的表達

為了解GhCLASP1基因在棉花中的時空表達特性，以棉花幼苗的根、莖、葉、田間采集的花及不同發育時期棉纖維的總RNA反轉錄的cDNA為模板，以棉花UBI基因作為內參基因，利用qRT-PCR技術，分析GhCLASP1在棉花不同組織的表達情況。結果表明，GhCLASP1基因在棉花的根、莖、葉、花及棉纖維中均有表達，并在棉纖維發育的早期表達量低；隨著棉纖維的發育，GhCLASP1表達量逐漸升高，在開花后27 d棉纖維中表達量達到高峰（圖5），暗示其可能在棉花纖維發育過程中發揮著重要的作用。

2.5 GhCLASP1亞細胞定位觀察

為了解GhCLASP1編碼蛋白的亞細胞定位情況，將構建酶切驗證正確的pCambia1300221-GFPCLASP融合表達載體轉化農桿菌，注射3 d后的煙草葉片于激光共聚焦顯微鏡下進行觀察，結果顯示該基因的GFP的熒光均分布在葉片的細胞膜上（圖6）。以上結果說明，Gh CLASP1可能定位在細胞膜上，與生物信息學分析中預測的結果一致。

圖5 GhCLASP1基因在棉花不同組織中表達的qRT-PCR分析1.根；2.莖；3.葉；4.花；5～14分別為開花后3、6、9、12、15、18、21、24、27、30 d纖維Fig.5 Quantitative real-time PCR analyses the expression level of GhCLASP1 gene in different tissues in cotton 1.Root；2.Stem；3.Leaf；4.Flower；5—14.Represent fiber cells at 3，6，9，12，15，18，21，24，27 and 30 d post anthesis，respectively

圖6 棉花微管結合蛋白GhCLASP1亞細胞定位分析A～C.3周煙草葉片中GFP-CLASP蛋白的亞細胞定位；D～F.3周煙草葉片中GFP蛋白的亞細胞定位；其中，A、D為熒光圖像；B、E為明場圖像；C、F為疊加圖像；標尺為20μmFig.6 Subcellular localization analysis of the microtubule associate protein GhCLASP1 A—C.Subcellular localization of the GFP-CLASP protein in leaf cells of 3-week-old Nicotiana benthamiana；D—F.Subcellular localization of the GFP protein in leaf cells of 3-week-old N.benthamiana；A and D for GFP fluorescence image；B and E for bright field image of the same leaf；C and F for merged image of the same leaf；Scale bar＝20μm

3 討 論

CLASP是與微管正端結合的蛋白，它既能結合微管也能結合細胞質連接蛋白（CLIP-Associated Proteins，CLAPs）［14］。CLASP蛋白的一般包括2個保守的結構域：HEAT重復結構域和CLASP-N端結構域。有些CLASP蛋白只含有CLASP-N結構。通過體內和體外試驗已經證實，HEAT結構域能形成螺旋結構及調節蛋白之間的相互作用，參與細胞內物質的運輸［15-16］；CLASP-N端結構域是很保守的結構域，是與微管結合的部位，具有調節動態微管的穩定性作用［17-18］。本試驗中克隆的Gh-CLASP1含有2個保守的CLASP-N端結構域和1個HEAT重復結構域，和擬南芥AtCLASP的結構域相比，GhCLASP1少了1個HEAT重復結構

域；與陸地棉Cot AD-48232的結構相比，多了1個HEAT重復結構域。這些HEAT重復結構域和CLASP-N端結構域可能對于蛋白功能的正常發揮是必需的。

棉花纖維發育分為纖維原始細胞分化和突起、纖維伸長、次生壁加厚和脫水成熟4個時期，這4個時期之間存在著某些重疊，沒有截然區分的界限［19］。在纖維發育的各個時期都有大量的相關基因參與纖維的發育和調控。本研究qRT-PCR表明，GhCLASP1基因在花后27 d表達量最高，該時期正是處于纖維次生壁加厚期，表明該基因可能在纖維發育次生壁合成期發揮重要的作用，可能對棉纖維比強度有重要影響。CLASP主要在微管的正端富集，其聚集的點沿著微管的整個長度分布［20-21］。在擬南芥中通過細胞學研究分析發現AtCLASP基因編碼的蛋白與所有的微管列陣共定位［20，22-23］，Dhonukshe等［24］研究表明PLT-生長素-MAP65-CLASP模型在擬南芥根的定向細胞分裂中起著重要的作用。CLASP定位在細胞的上下兩面有利于微管跨過邊緣從橫向排列變為縱向排列，從而使得細胞從垂周分裂轉變成平周分裂，CIASP的定位變化調控微管列陣的方向［24］。本研究中GhCLASP1蛋白亞細胞定位表明，Gh CLASP1蛋白定位在細胞膜上，與生物信息學預測的一致。據此我們推測其為一個微管結合蛋白，同時作用于微管和細胞膜，可能與細胞內物質的運輸相關，通過調控微管的排向和動態分布，參與纖維發育調控，影響纖維的伸長和次生壁的合成，從而改變纖維的品質。該基因在纖維發育過程中的功能還有待進一步深入研究。

到目前為止，在動植物基因組中發現的CLASP基因數目很少，如：人的基因組中只有2個CLASP基因［14］，在果蠅和線蟲基因組中已報道的有其同源相似物［25-27］。而在植物擬南芥基因組中只有1個CLASP基因［12］。根據已經公布陸地棉基因組數據庫［28］，預測棉花中有8個CLASP基因，其在棉花中的功能尚未知，彼此之間是否有功能冗余也有待進一步研究。本研究為進一步探討棉花中CLASP基因的功能奠定了基礎。

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（編輯：宋亞珍）

Cloning and Expression Analysis of GhCLASP1 Gene in Gossypium hirsutum L.

ZHU Shouhong1，XUE Fei1*，ZHAO Lanjie2，LIU Yongchang1，LI Yanjun1，XIONG Xianpeng1，SUN Jie1
（1 College of Agronomy，Shihezi University/Key Oasis Eco-agriculture Laboratory of Production and Construction Group，Shihezi，Xinjiang 832003，China；2 College of Life Sciences，Shihezi University，Shihezi，Xinjiang 832003，China）

CLIP-Associated Proteins（CLASPs）is specifically binding to microtubules of microtubule associated proteins（MAPS），involved in mediating the structure and function of microtubules，and play key roles during cell formation and cell elongation.A new CLASP gene was obtained from Gossypium hirsutum L. by electronic cloning and reverse-transcription polymerase chain reaction（RT-PCR）technology.Sequence analysis showed that GhCLASP1 belongs to the CLASP gene family，the full length ORF of GhCLASP1 is 4 188 bp，encoding 1 395 amino acids.Gh CLASP1 has one HEAT domain and two CLASP-N structures. The phylogenetic analysis of homologue CLASP proteins of other plants showed that Gh CLASP1 had a close relationship with TcCLASP of Theobroma cacao.Real-time quantitative reverse transcription PCR（qRT-PCR）showed that GhCLASP1 was expressed in root，stem，leaf，petal and fiber at different development periods.The highest expression of the GhCLASP1 was observed in the secondary period of the cotton fiber wall thick（27 day post anthesis）and suggesting that GhCLASP1 might play an important role in the formation of secondary wall synthesis of cotton fiber.Transient expression system of the Nicotiana benthamiana leaves was used to analyze subcellular localization，and showed that GhCLASP1 might locatein the cell membrane.This study proved a foundation for studying the functions of CLASP genes in fiber development.

cotton；fiber development；CLASP；expression analysis；subcellular localization

Q785；Q786

A

1000-4025（2015）10-1941-08

10.7606/j.issn.1000-4025.2015.10.1941

2015-05-26；修改稿收到日期：2015-08-02

國家自然科學基金（U1128301）；國家“十二五”科技支撐計劃（2011BAD35B05）；石河子大學高層次人才專項（RCZX201212）

朱守鴻（1987—），男，在讀博士研究生，主要從事棉花遺傳育種研究。E-mail：zhushouhong2014@126.com

*通信作者：薛 飛，博士，副教授，主要從事棉花遺傳育種及棉花功能基因組學研究。E-mail：xuefei2013@hotmail.com