植物維生素B6從頭合成與代謝轉換研究進展

黃龍全，張劍韻

維生素B6（VB6）是一組可相互轉換的吡啶衍生物的總稱，包括吡哆醇（pyridoxine，PN）、吡哆胺（pyridoxamine，PM）、吡哆醛（pyridoxal，PL）、磷酸吡哆醇（pyridoxine 5′－phosphate，PNP）、磷酸吡哆胺（pyridoxamine 5′－phosphate，PMP）和磷酸吡哆醛（pyridoxal 5′－phosphate，PLP）。其 中，PLP 是140多種細胞酶的輔酶，在生物體內發揮廣泛、重要的作用。植物和微生物是自然界VB6的制造者，動物從食物中獲得VB6。在植物體內，PLP作為胱硫醚合成酶［1］、氨基環丙烷羧化物合成酶［2］、絲氨酸棕櫚酰轉移酶［3］、蘇氨酸合成酶［4］、胱硫醚裂合酶［5］等的輔酶有詳細研究；PLP 也是乙烯、葉綠素和生長素 合 成 所 必 需 的［6－7］；PLP 還 涉 及 亞 油 酸 和 淀 粉 的合成［8］。近年來發現VB6也是抗氧化劑，可有效淬滅單線態氧和超氧陰離子自由基［9－10］；它作為細胞信號傳導的調節分子，對細胞膜上的離子通道具有調節作用［11］；它發揮抗逆作用，保護植物免受低溫、紫外線、氧化、滲透壓等環境脅迫的影響［12－13］。無論是闡明VB6參與調控植物生長發育和環境反應的機理，通過遺傳改良提高食源性植物的VB6含量，還是利用VB6的特殊生理功能提高植物的逆境適應能力，都依賴于對VB6代謝的研究。植物VB6代謝包括VB6的從頭合成和合成后的代謝轉換。本文綜述了植物VB6從頭合成與代謝轉換的研究進展。

1 植物VB6 的從頭合成

1.1 自然界存在兩種VB6 從頭合成途徑

至今發現兩種VB6從頭合成途徑（de novo synthetic pathway），兩者的底物、產物和作用酶均不相同。首先發現的DXP依賴途徑（DXP dependent pathway）在大腸桿菌有詳細研究，利用1－脫氧－D－木酮糖－5－磷酸（DXP）和4－磷酸羥基－蘇氨酸首先合成PNP，再經PNP氧化酶的作用，轉變為PLP后用于細胞代謝過程［14］。

另外一條途徑DXP 非依賴途徑（DXP independent pathway）于1999年發現。該途徑以谷氨酰胺、3－磷酸甘油醛（或磷酸二羥丙酮）和5－磷酸核糖（或5－磷酸核酮糖）為底物直接合成PLP［15－17］（圖1）。Ehrenshaft等［15］在研究尾孢菌（C.nicotianae）對自身毒素的抗性中發現了涉及VB6代謝的新基因，最初指定為單線態氧抗性基因SOR1，后來鑒定為PDX1。2001年又從尾孢菌鑒定出涉及VB6合成的第2 個基因PDX2［16］。目前已經明確PDX1和PDX2構成PLP合酶復合體（PLP synthase complex），PDX2發揮谷氨酰胺酶的作用，催化從谷氨酰胺產生氨；PDX1發揮閉環蛋白的作用，催化5－磷酸核糖、3－磷酸甘油醛和氨的縮合，完成PLP 的合成［17］。DXP非依賴途徑的產物直接用于細胞代謝，生物效率高于DXP依賴途徑，是自然界VB6的主要合成途徑。DXP 非依賴途徑通過谷氨酰胺將VB6和氨基酸代謝聯系起來，通過丙糖和戊糖磷酸代謝池又將VB6與細胞能量途徑聯系起來。

1.2 植物通過DXP非依賴途徑從頭合成VB6

VB6合成途徑作用酶及其編碼基因的鑒定是極為重要的一歩。學術界很長時間認為植物通過DXP依賴途徑合成VB6，但始終沒有找到實驗依據。作為植物逆境應答中VB6作用研究的一部分，2005年Denslow 等［18］從煙草鑒定出PDX1 和PDX2同源序列。使用兼并引物的基因擴增獲得2個PDX1序列，彼此相差15個堿基，編碼相同氨基酸序列，可能是2 個等位基因或者2 個拷貝。PDX2為單拷貝基因，表達也遠低于PDX1。多個研究小組從擬南芥也鑒定出PDX1和PDX2同源序列，并開展了更為深入的研究［13，19－23］。目前已經明確植物通過DXP非依賴途徑從頭合成VB6。

圖1 DXP非依賴性維生素B6 合成途徑Fig.1 DXP independent vitamin B6synthetic pathway

擬南芥PDX2也是單拷貝基因，位于5號染色體上（At5g60540），基因長度為2 180bp，含有7個外顯子，轉錄長度為768bp，編碼255個氨基酸、理論分子量為27 303Da的蛋白。存在3個PDX1同系物，分別命名為AtPDX1.1、AtPDX1.2和AtPDX1.3。PDX1.1（At2g38230）、PDX1.2（At3g16050）和PDX1.3（At5g01410）分別位于2號、3號和5號染色體上。PDX1.1和PDX1.3具有89%的相似性，而與PDX1.2的相似性為60%。擬南芥還存在一個小的不完全拷貝（PDX1.4），其與PDX1.1基因上游序列33%相同，在細胞代謝中可能沒有作用。PDX1同系物都沒有基因內含子，提示其原核起源。PDX1.1、PDX1.2和PDX1.3的轉錄長度分別為1 053、1 380和1 297bp。PDX2對擬南芥的生長發育至關重要，突變體胚胎致死［19，23］。因為難以獲得PDX2的純合突變體，所以大量的研究集中 在PDX1同系物上［13，19－22］。其 中PDX1.3 的 轉錄豐度最高，突變體表型和VB6水平的變化最大，研究也最為詳細。

PDX1.1基因沉默植物出現萎黃和根系生長不良，而PDX1.1和PDX1.3基因都沉默植物葉片萎黃畸形，多數死亡，幸存植物的花朵小、未能結籽，提 示PDX1.1 和PDX1.3可能存在功能重疊［21］。Titiz等［20］對PDX1.1 和PDX1.3 基因進行了TDNA 插入突變。pdx1.3突變體的表型與Wagner等的結果非常相似，但pdx1.1突變體的VB6水平沒有下降，也不呈現萎黃表型。Titiz等也進行了PDX1.1和PDX1.3雙突變，惡化的表型和致命的雙突變也預示兩基因至少部分功能重疊。但是，2個基因的時空表達存在差異［13，20－21］，提示兩者也可能具有相對獨立的功能，在擬南芥基因組中都有存在的意義。擬南芥PDX1.2的作用還不清楚，基因插入突變體的表型與野生型沒有差異［21］。但擬南芥遭遇紫外線和氧化脅迫時PDX1.2轉錄上調［22］，提示PDX1.2可能在脅迫條件下發揮作用。

1.3 植物VB6 的從頭合成涉及逆境應答

煙草感染假單胞桿菌后PDX1和PDX2的基因表達下調，而水楊酸和茉莉酮酸甲酯處理可致基因短暫上調［18］。Chen等［13］在分離干旱和鹽脅迫響應蛋白互作伴侶的酵母雙雜交實驗中，首先分離出PDX1.3。植物的根、莖、葉、花和長角果都能檢測出PDX1.3的轉錄，基因的最強表達出現在脈管組織和保衛細胞。pdx1.3突變體的葉綠體和根的生長異常，幼苗的根對鹽和甘露醇敏感，提示PDX1.3蛋白涉及對滲透和離子脅迫的生物應答。pdx1.3突變體根部缺乏色氨酸依賴性生長素的合成，這可能是出現短根表型的原因［24］。2006年，Wagner等［21］獲得了PDX1.3基因EMS 突變體rsr4－1，突變體的蔗糖響應下降，呈現根生長退化、矮小和退綠葉。突變體的表型可以采用向生長媒體中添加PL 的方法加以恢復，添加PN、PM 或者PLP可部分恢復。

Denslow 等［22］報道了非生物脅迫下擬南芥PLP合酶基因的應答調節。正常狀態下，擬南芥PDX1.1和PDX1.3高水平表達，PDX1.2不表達或低水平表達，PDX2中間水平表達。在植物遭遇強光、低溫、干旱、紫外線、百草枯和臭氧時，PDX1和PDX2基因都上調。作者進一步分析多種脅迫因子對煙草VB6存在形態的影響，發現PLP 水平不同程度地應答上升，并引起PL 和PN 的相應變化，隨后回歸對照水平［25］。

2007年Herrero 等［26］在煙草中表達尾孢菌PLP合成酶基因，嘗試提高煙草的VB6含量。結果僅有一個株系VB6水平的增加達到顯著水平，比野生型和轉化對照系高出約17%。然而，轉化系煙草內源PDX1和PDX2 基因的表達下降，提示植物VB6的從頭合成受到嚴格調控。2011年，Raschke等［27］在擬南芥過量表達PDX 蛋白，獲得了VB6含量顯著增加的植株。他們還發現僅能提高PDX1的蛋白表達量，高VB6含量植株的生長期延長，細胞體積增大，對氧化脅迫的抵抗性也增強。

1.4 VB6 從頭合成途徑的細胞定位

PDX1和PDX2 復合體的細胞定位還存在爭議。Tambasco－Studart等報道所有PDX1和PDX2蛋白都定位于細胞溶質［19］。然而，Chen 等［13］把PDX1.3定位于細胞器和膜系統。Denslow 等［21］也報道能夠從質膜和細胞核觀察到PDX2 蛋白。從SUBA 擬南芥亞細胞定位數據庫匯總的亞細胞定位信息看，PDX1和PDX2定位于細胞溶質和細胞器。基于預測程序，PDX1.1、PDX1.3 和PDX2定位于細胞溶質、線粒體和質體，PDX1.2定位于細胞溶質和線粒體。

2 植物VB6 從頭合成后的代謝轉換

除了VB6的從頭合成，細菌和真核生物細胞中還普遍存在一條相似的PLP補救途徑，補救途徑涉及一系列酶的作用，通過VB6各型的代謝轉換使得細胞能夠直接利用外源PN、PM 或PL來合成細胞代謝所需要的PLP。補救途徑在微生物和哺乳動物有詳細研究。雖然PLP是占優勢的輔酶型，其他形式的VB6在細胞中通過補救途徑也保持動態平衡。

2.1 植物PL激酶

PL激酶（PL kinase，EC 2.7.1.35）在金屬陽離子的存在下，利用ATP催化PL、PN 和PM 的5′位醇基磷酸化，生成相應的磷酸酯型。從大腸桿菌發現兩種PL 激酶，pdxk 基因編碼普通PL 激酶，而pdxy 基因編碼的特殊PL 激酶僅以PL 為底物，且活性很低［28－29］。目前，真核生物中僅發現pdxk 基因，而多數原核生物同時具有pdxk和pdxy。

2002、2004和2008年，分別從擬南芥［30］、小麥［31］和油菜［32］克隆出PL 激酶基因。從擬南芥鑒定出的At5g37850與大腸桿菌pdxk 同源，與哺乳動物PL 激酶氨基酸序列的相似性大于40%。At5g37850也稱SOS4，其突變體對鹽高度敏感。擬南芥SOS4基因在葉、莖、根和花均等表達，根尖高度表達，種子吸水60h后可檢測出PL 激酶基因的表達。小麥基因組至少有2個PL 激酶拷貝，在根、芽、穗和花藥均有轉錄。油菜也有2 個PL 激酶拷貝，基因的轉錄受發育和環境的調節。目前還缺乏采用實驗的方法對PL 激酶進行細胞定位，預測結果表示存在于質體和線粒體。

擬南芥SOS4基因突變的研究證明PL 激酶是一個新的鹽耐受性決定因子，其突變體sos4 萎黃，與野生型相比植株重量減輕，根部對蔗糖和鹽高度敏感，存在NaCl時根的生長嚴重受損；突變體出乎預料地出現了VB6積累，其中PLP 的增加量最為顯著，其次是PN 和PM［33］。PLP 的增加可能是因為從頭合成途徑基因的上調，因為sos4 突變體PDX 基因的轉錄量比野生型的高。除了對鹽和蔗糖敏感，sos4突變體耐旱而不耐寒。最近發現葉綠體依靠PL激酶維持磷酸酯型VB6水平［34］。

2.2 植物PNP氧化酶

補救途徑的另一個重要酶是FMN 依賴性PNP氧化酶（PNP oxidase，EC 1.4.3.5），氧化底物PNP和PMP上的4′位醇基或氨基為醛基，生成PLP。2007年克隆出擬南芥At5g49970基因，編碼蛋白由3個部分構成，N 端為葉綠體轉運肽，中部為未知功能的Yjef＿N 區域，C 端為PNP氧化酶（PDX3）［35］。Sang等［35］在大腸桿菌中表達該基因，通過酶活性分析證明了其功能。擬南芥PNP氧化酶在不同組織中的表達存在差異，受光、熱、ABA 和乙烯處理的上調，受干旱和NaCl的下調。生物信息學預測PNP 氧化酶定位于葉綠體，也獲得了GFT－AtPPOX 融合實驗的支持。Gonzalez等［33］采用對大腸桿菌pdxh 突變體的互補實驗，也驗證了擬南芥At5g49970的PNP氧化酶功能。他們還對該基因進行了插入突變，2個獨立插入突變系氧化酶的活力均下降。pdx3 突變體的VB6總水平下降，而VB6各型與野生型相比較沒有顯著差異。生長在標準室內環境中的pdx3 突變體比野生型對照矮小。高光照條件下，pdx3 突變體對增強的光照反應遲鈍，植株重量無變化，而野生型在強光照條件下生長量增加。突變體對低溫、鹽與蔗糖引起的滲透壓響應與野生型無區別。pdx3 突變體的SOS4以及從頭合成途徑基因，特別是PDX1.1基因的表達增強。雖然從頭合成途徑基因的表達增加，但pdx3突變體與野生型或者sos4突變體相比較，PDX1的酶活力下降。2011年Sang等［36］又報道PNP 氧化酶在細胞溶質和葉綠體中將PNP 和PMP 氧化為PLP。

2.3 植物PL還原酶

PL還原酶（PL reductase，EC 1.1.1.65）也稱為PN 脫氫酶，利用NADPH 將PL 還原成PN，反應在體外是可逆的，但在體內逆反應幾乎不可能發生。2004年，Morita等［37］發現裂殖酵母PL 還原酶基因突變體能夠在缺乏VB6的合成培養基上生長，認為該酶對酵母生存而言是非必要的，僅涉及PL轉變為PN 后的細胞排出。

2011年，采用序列同源比對的方法從擬南芥鑒定出PL 還原酶（PLR1），在酵母PL 還原酶缺失突變體中表達AtPLR1 編碼區域，驗證了該酶催化NADPH 依賴性PL 的 還 原 反 應［38］。采 用T－DNA插入突變的研究發現，plr1突變體VB6從頭合成途徑基因的表達水平變化不大，而補救途徑作用酶PDX3和SOS4 基因的表達發生顯著變化。并且，pdx3和sos4突變體AtPLR1 基因的表達也上調。高效液相色譜的分析結果顯示，2 個plr1 突變體VB6總水平下降，其中PL、PLP、PM 和PMP 水平顯著下降，而PN 和PNP 沒有顯著變化。突變體PL水平下降和PN 水平沒有變化是很意外的，提示AtPLR1基因的表達產物可能不是唯一的PL 還原反應的作用酶。突變體的根系生長正常，但植株明顯小于野生型；對低溫和高光照的抵抗性與野生型沒有差異，但明顯受NaCl和甘露醇的抑制，提示PL還原酶也可能涉及植物對滲透脅迫的抵抗性。

植物的葉際是一個復雜的生態系統，具有豐富的微生物多樣性。這些微生物改變植物體表微環境和參與物質循環。VB6是水溶性維生素，其跨膜轉移已有廣泛的研究，很早就明確只有非磷酸酯型VB6能夠穿越細胞膜。植物即可以從環境中吸收VB6，過量VB6也向環境釋放［39］。我們發現葉際微生物在煙草葉面可以將來源于葉組織的PL 還原為PN，提示植物PL 的還原可能還存在葉際微生物的作用［40］。

2.4 煙草VB6 的代謝轉換與調控

作為重要經濟作物和模式植物，煙草VB6從頭合成途徑最早被闡明。我們以組培煙草為材料構建無菌實驗模型，解析了植物體內VB6的代謝轉換，獲得了代謝轉換的重要調控信息。采用底物（PL、PM 和PN）飼喂和應答分析的研究發現，煙草葉片組織中PLP保持穩定、PL 水平受到控制，PL 還原為PN 以及PM 與PL的相互轉化是VB6代謝轉換的重要內容［39］。在建立以HPLC 檢測為基礎的VB6代謝酶活性檢測方法的基礎上，從煙草葉片組織鑒定出PL激酶、PNP氧化酶、PL還原酶，以及酶促PM－PL轉換和PLP 水解脫磷酸反應，在體外最適反應條件下，葉片組織粗提液中這些酶的催化活力分別為0.15、0.10、0.08、0.64和23.08nmol·min－1·mg－1，在代謝酶活力水平上探討了植物體內VB6的代謝轉換［41］。我們的研究結果提示PLP→PL→PN 是植物（煙草）體內VB6從頭合成后代謝轉換的主體流向，PL 激酶和PNP氧化酶構成的PLP補救合成以及酶促PM 和PL 的相互轉換是VB6主體代謝的補充（圖2）。

2.5 煙草PLP磷酸酶的初步鑒定

PLP的水解在動物和微生物有詳細研究，受特異和非特異性磷酸酶的作用。堿性磷酸酶涉及維持細胞外PLP濃度的穩定，而酸性磷酸酶涉及細胞內PLP濃度的穩定。1992年從人紅細胞純化出特異性PLP磷酸酶［42］，2003年從人腦克隆出PLP 磷酸酶基因［43］，從老鼠組織cDNA中也克隆出PLP 磷酸酶基因。我們以PLP為底物，從煙草純化出水解PLP、PMP和PNP的磷酸酶。該酶為二聚體結構、分子量約為50kD，是一個新的非特異性酸性磷酸酶［44］。植物體內是否存在特異性PLP 磷酸酶還有待進一步的研究。

2.6 煙草PL和PM 相互轉換作用酶的初步鑒定

很早就發現某些生物體內存在PL 和PM 的相互轉換。從大腸桿菌和兔肝純化出PM－草酰乙酸轉氨酶，該酶可逆性地催化PM 和草酰乙酸、PL 和天冬氨酸之間的轉氨反應，但是最終被認為是一個未知轉氨酶的脫輔基形式［45］。因為該文作者發現從豬心純化出的谷氨酸－草酰乙酸轉氨酶在脫去輔酶PLP或者PMP后，也能夠催化PM 和酮酸之間的轉氨反應。PM－丙酮酸轉氨酶（PM－pyruvate aminotransferase，EC 2.6.1.30）和PMP－α－酮戊二酸轉氨酶（PMP－α－ketoglutarateaminotranferase，EC2.6.1.54）是目前已經明確和僅有的PLP非依賴性轉氨酶，特異性地以VB6為底物而非輔酶，參與VB6代謝轉換［46－47］。我們在發現煙草體內存在PM 和PL相互轉換的基礎上，進一步純化出其作用酶。結果表示煙草體內存在PM－丙酮酸轉氨酶，對PM 和PL的相互轉換發揮主導作用，同時也明確煙草的谷氨酸－草酰乙酸轉氨酶在脫去輔酶后，能夠催化PM 和草酰乙酸或者α－酮戊二酸之間的轉氨反應［48］。

圖2 煙草體內維生素B6 代謝轉換示意圖［39］Fig.2 Postulated interconversions of different vitamin B6forms in tobacco plants［39］Thick arrow shows the predominant VB6 metabolic flux

3 展 望

植物合成的VB6對植物自身的生長發育和逆境適應，以及人和動物營養具有重要意義。植物VB6從頭合成途徑已經明確，研究積累也較豐富，而代謝轉換尚未明了，還有許多不明之處。PN 葡糖苷（PN glucoside）是植物體內特有的VB6衍生物［49］，可能受UDP－葡萄糖依賴性葡糖基轉移酶（UDP－glucose－dependentglucosyltransferase）的 作用由PN 生成。植物體內水解PLP、PMP 和PNP的磷酸酶、PM－丙酮酸轉氨酶以及催化生成PN 葡糖苷的葡糖基轉移酶，都還需要在基因水平上加以明確。雖然從擬南芥鑒定出PL 還原酶基因，但T－DNA插入突變的研究結果顯示該基因的表達產物不是唯一的作用酶［37］。植物體內PL 的還原和PN 的形成還需要更加深入的研究。

同時，從植物檢出4－吡哆酸（4－pyridoxic acid）［50］，盡管其起源和去向還是未解之謎，但提出了VB6的異化問題。因為4－吡哆酸在哺乳動物是排泄型VB6，在微生物是VB6降解途徑的一個中間產物。至今從細菌發現兩種VB6降解途徑，PM－丙酮酸轉氨酶是降解途徑Ⅰ的重要作用酶［51］。從煙草分離出PM－丙酮酸轉氨酶，暗示植物體內可能存在VB6降解途徑Ⅰ。對植物VB6降解的研究具有重要意義，是VB6代謝平衡機制的重要內容，還將為今后通過基因工程技術提高食源性植物的VB6含量提供靶標基因。

另外，植物的質體、線粒體和過氧化物酶體等都存在重要的PLP依賴酶，這些酶的活力受制于細胞器內PLP 的平衡供給。PLP 不能通過質膜，并且PLP的4′位醛基非常活潑，極易與伯胺和仲胺形成醛亞胺結構。PLP與非VB6蛋白的非特異性結合將導致生理功能的紊亂。因此，植物VB6從頭合成與代謝轉換的調控機制也是亟待研究的重要科學問題。

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