外源脯氨酸對鹽脅迫下甜瓜脯氨酸代謝的影響

顏志明，馮英娜，韓艷麗，魏 躍，郭世榮

（1江蘇農林職業技術學院，江蘇鎮江212400；2南京農業大學園藝學院，南京210095；3江蘇現代園藝工程技術中心，江蘇鎮江212400）

外源脯氨酸對鹽脅迫下甜瓜脯氨酸代謝的影響

顏志明1，2，3，馮英娜1，3，韓艷麗1，魏 躍1，3，郭世榮2

（1江蘇農林職業技術學院，江蘇鎮江212400；2南京農業大學園藝學院，南京210095；3江蘇現代園藝工程技術中心，江蘇鎮江212400）

為探明外源脯氨酸對鹽脅迫下甜瓜脯氨酸代謝的影響，以甜瓜品種‘雪美'為材料采用營養液栽培，對鹽脅迫（100 mmol·L—1NaCl）、鹽脅迫下添加外源脯氨酸（100 mmol·L—1NaCl＋0.2 mmol·L—1Proline）以及對照3種處理后甜瓜幼苗葉片脯氨酸（Pro）含量、吡咯啉-5-羧酸合成酶（P5CS）、鳥氨酸轉氨酶（OAT）和脯氨酸脫氫酶（ProDH）活性進行測定，并對OAT和ProDH基因進行克隆及半定量表達分析。結果顯示：與對照相比較，鹽脅迫條件下甜瓜幼苗葉片內Pro含量顯著增加，P5CS活性增幅大于OAT活性，OAT基因表達量大部分時段內沒有增加，ProDH活性下降，Pro DH基因表達量減少；鹽脅迫下添加外源脯氨酸進一步使幼苗葉片內Pro含量增加、OAT、ProDH活性提高、P5CS活性降低，并且使OAT基因表達量迅速增加、ProDH基因表達量先增加后回落。研究表明，鹽脅迫條件下，甜瓜幼苗體內脯氨酸積累主要是通過增強脯氨酸的谷氨酸合成途徑和抑制脯氨酸降解來實現；適量外源脯氨酸可以增強鹽脅迫幼苗脯氨酸的鳥氨酸合成途徑，但對谷氨酸合成途徑有一定的抑制作用；通過調節合成和降解2種代謝途徑進一步提高了脯氨酸含量，從而增強甜瓜幼苗耐鹽脅迫能力。

脯氨酸；鹽脅迫；甜瓜；谷氨酸途徑；鳥氨酸途徑

甜瓜（Cucumis melo L.）又名香瓜，為葫蘆科一年生蔓性植物，果實香甜富含糖、淀粉、礦物質及維生素等營養物質，是一種深受人們喜愛、種植面積較大瓜果。由于多在溫室采用無土栽培技術，易導致栽培基質中鹽分含量增加，而甜瓜是對鹽敏感植物，鹽漬化造成的鹽脅迫傷害能極大地抑制甜瓜生長，造成甜瓜產量和品質降低［1］。研究表明植物受到鹽漬時體內會合成較高含量的脯氨酸（Pro），這些積累的內源脯氨酸可以減輕鹽脅迫對植物的傷害［2］。植株體內脯氨酸合成途徑主要有兩條，分別為谷氨酸（Glu）途徑和鳥氨酸（Orn）途徑，其中吡咯啉-5-羧酸合成酶（P5CS）是谷氨酸途徑的關鍵酶，鳥氨酸轉氨酶（OAT）是鳥氨酸途徑的關鍵酶，而脯氨酸脫氫酶（ProDH）則是脯氨酸降解反應的限速酶［3］。許多研究［4-7］表明當植物本身產生的脯氨酸不足以消除逆境傷害時，可以使用外源脯氨酸來緩解逆境傷害，外源脯氨酸在增強作物對干旱、鹽、高溫等逆境脅迫耐性方面具有重要的作用。

作者曾在1×Hoagland營養液中培養甜瓜幼苗，生長正常（圖1，A），添加100 mmol·L—1NaCl的1×Hoagland營養液中的甜瓜幼苗植株矮小、生長不良，受鹽害癥狀較為嚴重（圖1，B），而在添加100 mmol·L—1NaCl＋0.2 mmol·L—1脯氨酸的1×Hoagland營養液中的甜瓜幼苗生長基本正常、受鹽害癥狀明顯減輕（圖1，C）。針對這種現象，作者進一步研究了外源脯氨酸對鹽脅迫下甜瓜幼苗生長、光合作用、光合熒光參數、葉綠素含量及活性氧物質含量的影響［8-10］，初步探討了外源脯氨酸緩解水培甜瓜鹽脅迫傷害的生理機制。在以上研究的基礎上，本試驗擬探討鹽脅迫下添加外源脯氨酸后甜瓜幼苗葉片內脯氨酸含量和P5CS、OAT、ProDH活性及相關基因表達的變化，旨在闡明外源脯氨酸對鹽脅迫下甜瓜脯氨酸代謝的影響，進一步了解外源脯氨酸緩解甜瓜鹽脅迫傷害的生理和分子調節機制，為植物耐鹽脅迫研究提供重要信息。

圖1 3種情況下甜瓜幼苗生長情況的比較A.1×Hoagland營養液（CK）；B.鹽脅迫（1×Hoagland營養液＋100 mmol·L—1NaCl）；C.外源脯氨酸處理（1×Hoagland營養液＋100 mmol·L—1NaCl＋0.2 mmol·L—1Proline）Fig.1 Growth comparison of Cucumis melo seedling under three different treatments A.1×Hoagland solution（CK）；B.Salt stress（1×Hoagland＋100 mmol·L—1NaCl）；C.Exogenous proline（1×Hoagland＋100 mmol·L—1NaCl＋0.2 mmol·L—1Proline）

1 材料和方法

1.1 試驗材料及處理

試驗于2014年5月在江蘇農林職業技術學院園藝試驗基地連棟溫室內進行，供試甜瓜品種為‘雪美'［9］。試驗以1×Hoagland營養液為基礎，共設置鹽脅迫（100 mmol·L—1NaCl）、外源脯氨酸（100 mmol·L—1NaCl＋0.2 mmol·L—1proline）2個處理和對照（1×Hoagland營養液），甜瓜幼苗定植于相應栽植槽中，均采用氣泵間歇通氣培養，每2 d換1次營養液。分別取各處理和對照植株第0、2、4、6、8天真葉進行各項指標的測定，試驗3次重復。

幼苗嫩葉于液氮中速凍保存用于總RNA提取。Trizol試劑盒、DNaseI分別為美國Invitrogen和BIPEC公司產品，M-MLV反轉錄酶、p MD19-T載體、Taq酶等為TaKaRa公司產品，DNA純化試劑盒、宿主菌大腸桿菌TOP10購自天根生化科技公司。

1.2 脯氨酸含量和P5CS、OAT、ProDH活性測定

脯氨酸含量采用酸性茚三酮法測定［11］。P5CS活性測定參照Song等［12］方法，以0.1ΔA440·g—1· h—1為一個酶活力單位（1 U）。OAT活性測定參照Kim等［13］方法，以0.01ΔA510·g—1·h—1為一個酶活力單位（1 U）。ProDH活性測定參照趙福庚等［14］方法，以0.01ΔA600·g—1·min—1為一個酶活力單位（1 U）。

1.3 OAT、ProDH基因的克隆及表達分析

1.3.1 OAT、Pro DH基因的克隆 以1×Hoagland營養液培養（對照）的甜瓜幼苗嫩葉為材料，采用Trizol試劑盒按照說明書提取總RNA，DNAseI處理去除基因組DNA，再以Oligo（d T）為反轉錄引物M-MLV反轉錄酶合成單鏈c DNA。根據已報道的甜瓜OAT序列（GenBank登錄號為XM_ 008446277）和Pro DH序列（GenBank登錄號為XM_008461224）利用Primer Premier 5.0軟件分別設計引物（表1），PCR反應體系均為cDNA 1μL、上下游引物（10μmol·L—1）各1μL、10×buffer 2.5μL、d NTP 1μL、Taq酶0.2μL，加dd H2O至25μL。OAT擴增反應參數為：94℃預變性3 min；94℃變性30 s，50.7℃退火30 s，72℃延伸1 min，共35個循環；最后72℃延伸10 min，4℃保存，目的片段長度為690 bp；Pro DH退火溫度為52.8℃，其余擴增參數相同，目的片段長度為1 035 bp。PCR產物以1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測和分離，目的片段用DNA純化試劑盒純化后連接到p MD19-T載體中，轉化到TOP10感受態細胞。挑取單菌落放大培養，相同條件下進行PCR擴增檢測，挑取陽性克隆由上海生工生物工程有限公司完成序列測定，在NCBI網站進行BLAST比對。

1.3.2 OAT、ProDH基因表達分析 分別從鹽脅迫處理、外源脯氨酸處理和對照第0、2、4、6、8天的甜瓜幼苗嫩葉中提取總RNA，經DnaseI處理去除基因組DNA，再以Oligo（d T）為反轉錄引物MMLV反轉錄酶合成單鏈cDNA。以甜瓜Profilin基因（GenBank登錄號為AY292386）為內參基因，根據序列設計1對引物（表1），擴增反應參數為：94℃預變性3 min；94℃變性30 s，52℃退火30 s，72℃延伸30 s，共35個循環；最后72℃延伸10 min，4℃保存，目的片段長度為366 bp。PCR擴增產物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，根據擴增結果調整cDNA模板濃度。分別以表1中OAT、Pro DH引物進行PCR擴增，反應體系和擴增參數同1.3.1，進行半定量PCR表達分析。

表1 甜瓜OAT、ProDH和內參Profilin基因的PCR引物Table 1 PCR primers of OAT，Pro DH and reference Profilin genes in melon（Cucumis melo L.）

圖2 外源脯氨酸對鹽脅迫下甜瓜幼苗葉片脯氨酸含量的影響CK.對照（1×Hoagland營養液）；T1.鹽脅迫（1×Hoagland營養液＋100 mmol·L—1NaCl）；T2.外源脯氨酸處理（1×Hoagland營養液＋100 mmol·L—1NaCl＋0.2 mmol·L—1Proline）；下同Fig.2 Effect of exogenous proline on proline content in leaves of C.melo seedlings under salt stress CK.Control（1×Hoagland）；T1.Salt stress（1×Hoagland＋100 mmol·L—1NaCl）；T2.Exogenous proline（1× Hoagland＋100 mmol·L—1NaCl＋0.2 mmol·L—1proline）；The same as below.

1.4 數據分析

試驗數據結果采用SAS軟件進行統計分析。

2 結果與分析

2.1 外源脯氨酸對鹽脅迫下甜瓜幼苗葉片脯氨酸含量的影響

脯氨酸是一種重要的滲透調節劑，其含量的增加對提高逆境下植物細胞液濃度、降低細胞水勢、增強吸水功能等起著重要的促進作用，逆境脅迫下植株常通過增加脯氨酸含量提高滲透勢以緩解脅迫引起的傷害［15］。圖2顯示，鹽脅迫處理（T1）甜瓜幼苗葉片脯氨酸含量隨處理時間呈現先上升后稍下降趨勢，并在處理4 d時達到最大值（117.42μg/g），且在處理期間（2～8 d）脯氨酸含量始終極顯著高于對照（CK），增幅分別為33.1%、65.8%、60.6%和38.0%；在鹽脅迫下添加脯氨酸（T2）進一步提高了甜瓜幼苗葉片脯氨酸含量，也同樣隨處理時間呈現先上升后稍下降變化趨勢，在處理6 d時達到最大值（132.73μg/g）且各時期含量均始終高于同期T1處理，升幅分別為28.1%、12.1%、22.7%和29.2%，其中第2、6、8天差異達到顯著水平。以上結果表明鹽脅迫下甜瓜葉片內會產生較高含量的脯氨酸以緩解逆境脅迫，鹽脅迫下添加適量外源脯氨酸能進一步增加植株內脯氨酸含量，從而增強植株抗鹽脅迫能力。

2.2 外源脯氨酸對鹽脅迫下甜瓜幼苗葉片P5CS、OAT、ProDH活性的影響

圖3，A顯示，甜瓜幼苗葉片P5CS活性在T1處理下隨時間延長呈現先上升后稍下降的變化趨勢，在處理4 d時活性達最高（8.174 U），其在處理期間（2～8 d）均極顯著高于對照，增幅分別為59. 7%、87.9%、56.6%和49.0%；P5CS活性在T2處理下隨時間延長也呈現先上升后稍下降的相似變化趨勢，也在處理4 d時活性達最高值（6.93 U），其在處理期間（2～8 d）均低于同期T1處理，其中第4天時差異達到顯著水平，但其在整個處理期間始終極顯著高于同期對照，增幅分別為54.2%、59.3%、41.7%和46.6%。這表明鹽脅迫下甜瓜幼苗葉片內P5CS活性會明顯增加，能通過增強谷氨酸途徑促進Pro合成，但鹽脅迫下添加外源脯氨酸對葉片P5CS活性和谷氨酸途徑具有一定抑制作用。

由圖3，B可知，甜瓜幼苗葉片OAT活性在T1處理下隨時間延長呈現上升-小幅回落-再上升趨勢，并始終顯著高于同期對照水平，增幅分別為22.3%、24.0%、19.4%和31.3%，但增幅小于P5CS；葉片OAT活性在T2處理下進一步提高，隨時間的變化趨勢與T1處理相同，但處理期間（2～ 8 d）OAT活性均明顯高于T1處理，與T1相比增幅分別為18.0%、27.5%、24.3%和16.7%，其中第4、6天時差異達到顯著水平。可見，鹽脅迫誘導甜瓜幼苗葉片內OAT活性增強，在促進脯氨酸合成中鳥氨酸途徑也發揮重要作用；鹽脅迫下添加脯氨酸能更加明顯提高葉片OAT活性、進一步增強鳥氨酸途徑促進脯氨酸合成。

由圖3，C可以看出，甜瓜幼苗葉片ProDH活性在T1處理2 d后就迅速下降，在脅迫4 d時達到最低（5.91 U）隨后略有所回升，但各處理時期（2～ 8 d）ProDH活性與對照相比均極顯著降低，降幅分別為44.64%、47.52%、41.92%和40.33%；與對照相比較，處理時期（2～8 d）T2處理幼苗葉片中ProDH活性也顯著降低但降幅均小于T1處理，其中處理第2和4天時分別比同期T1處理顯著高出20.0%和23.7%。可見，鹽脅迫能顯著地降低甜瓜幼苗葉片ProDH活性、抑制Pro的降解，而添加外源脯氨酸可使鹽脅迫幼苗葉片ProDH活性增加，這可能是葉片內脯氨酸含量增加引起反饋調節。

圖3 外源脯氨酸對鹽脅迫下甜瓜幼苗葉片P5CS、OAT和ProDH活性的影響Fig.3 Effect of exogenous proline on P5CS，OAT and ProDH activities in leaves of C.melo seedlings under salt stress

2.3 OAT、ProDH基因克隆及RT-PCR半定量表達分析

2.3.1 OAT、ProDH基因的克隆 反轉錄單鏈cDNA后進行PCR擴增，分別獲得與OAT、ProDH預期長度相吻合片段（圖4），參考黃志等［26］MeP5CS基因序列設計引物但未能擴增出P 5CS片段。測序后在NCBI網站進行BLAST比對，其中，690bp片段與甜瓜OAT基因（GenBank登錄號為XM_ 008446277）只有1個堿基不同，相似性達99.86%（圖4，A）；1035 bp片段與甜瓜Pro DH基因（Gen-Bank登錄號為XM_008461224）有7個堿基不同，相似性達到99.32%（圖4，B）。表明克隆到的均為目的基因片段。

2.3.2 OAT和ProDH表達分析 如圖5所示，對照幼苗葉片中OAT、ProDH基因在0～8 d階段的表達量基本相同，變化較小（圖5，A）。T1處理幼苗葉片OAT表達量在鹽脅迫2～6 d與處理前（0 d）基本相同，直到處理8 d時表達量才明顯增加；而其葉片ProDH表達量在處理2 d就降低，于處理4 d時表達量最小，雖在處理6、8 d時表達量有所回升但仍然小于處理前（圖5，B）。T2處理幼苗葉片OAT表達量在添加脯氨酸后能迅速增加，在處理2～8 d的OAT表達量均明顯高于處理前；而其相應的Pro DH表達量隨處理時間呈現先升后降趨勢，并在處理2 d時表達量最大值，此后表現為逐步減少，處理6、8 d時表達量與處理前基本相同（圖5，C）。可見，甜瓜幼苗葉片中ProDH基因在鹽脅迫下轉錄受到抑制，脯氨酸的降解在轉錄水平上受到調控，而鹽脅迫下添加脯氨酸能迅速增強OAT轉錄。

圖4 甜瓜OAT（A）和ProDH（B）基因克隆M.DL 2 000；1、2.OAT基因片段；3、4.Pro DH基因片段Fig.4 Cloning of OAT（A）and Pro DH（B）genes in C.melo seedling M.DL 2 000；1，2.Fragment of OAT；3，4.Fragment of Pro DH

圖5 OAT、ProDH在對照（CK）、鹽脅迫（T1）和鹽脅迫添加脯氨酸（T2）處理甜瓜葉片中的表達Fig.5 Expression of OAT，ProDH in leaves of C.melo seedling under contrast，salt stress（T1）and salt stress with exogenous proline（T2）

3 討 論

許多研究表明，逆境脅迫下植物體可以通過積累脯氨酸來增強其抗逆性。脯氨酸是一種重要的滲透保護劑，不但能夠防止水分散失，而且還可提高抗氧化酶活性、清除鹽脅迫產生的活性氧保護細胞膜結構［16-18］。本試驗也表明鹽脅迫下甜瓜幼苗葉片內會產生較高含量的脯氨酸以緩解逆境脅迫，鹽脅迫下添加適量外源脯氨酸能進一步增加植株內脯氨酸含量從而增強植株抗鹽脅迫能力，這與石榴、櫻桃［19］、草坪草［20］、黃瓜［21］、大豆［5］和菊花［22］等結果較為一致。

有學者［23］認為植物體內游離脯氨酸積累量的變化在一定程度上可以反映植物抵抗逆境脅迫的能力，鹽脅迫下游離脯氨酸多集中于植物代謝旺盛的光合器官葉片和生殖器官，其含量是其他部位的數倍到數十倍［24］。因此本試驗以甜瓜葉片為試驗材料較能集中反映鹽脅迫下甜瓜脯氨酸的代謝調節規律。

本試驗中，鹽脅迫（T1處理）甜瓜幼苗葉片內脯氨酸含量顯著增加，同時P5CS活性增幅顯著，而OAT活性增幅相對較小，OAT表達量在大部分處理時段里沒有增加，因此推斷在鹽脅迫開始階段甜瓜幼苗體內脯氨酸積累主要途徑是谷氨酸合成途徑，這與Lei［25］和曹芳［26］結論相同。同時，鹽脅迫降低了甜瓜幼苗葉片內ProDH活性，減少Pro DH表達量，從而使脯氨酸降解受到抑制，這也導致植株體內脯氨酸進一步積累，與段九菊［21］對黃瓜的研究結果較為相似。

許多研究表明當植物本身產生的脯氨酸不足以消除逆境傷害時，可以使用外源脯氨酸清除活性氧［27］和保護酶活性［6，28］以緩解逆境傷害。作者前期研究表明在鹽脅迫下添加0.2 mmol·L—1外源脯氨酸能夠緩解甜瓜幼苗的鹽傷害［9-10］，本研究結果進一步說明這與葉片內脯氨酸含量增加有關。本試驗中外源脯氨酸降低了鹽脅迫下甜瓜幼苗葉片P5CS活性的增幅，說明外源脯氨酸可以在一定程度上抑制P5CS活性和谷氨酸合成途徑；同時，葉片OAT活性進一步增加，OAT表達量也迅速增加，又表明外源脯氨酸可以促進鳥氨酸合成途徑，這可能與外源脯氨酸能夠保護OAT有關［8］。

另外，也有研究表明施用過高濃度外源脯氨酸，不但不能緩解脅迫危害，反而會抑制植物的生長，對植物造成傷害。如在綠豆細胞培養基中加入20～ 33 mmol·L—1脯氨酸可以減緩NaCl脅迫引起的不良反應，當濃度達到50 mmol·L—1或者更高時，細胞生長反而受到抑制［29］；在苜蓿愈傷組織培養過程中，10 mmol·L—1的外源脯氨酸對于緩解鹽脅迫的效果明顯，但當濃度過高超過30 mmol·L—1時則抑制愈傷組織生長甚至有毒害作用［30］。因此，外源脯氨酸作為抗逆增強劑使用須慎重，須先做預備試驗確定施用濃度范圍避免發生傷害。鹽脅迫下甜瓜葉片內脯氨酸濃度始終都受合成和降解2種代謝途徑共同調節，使脯氨酸濃度保持在一定適宜范圍內避免過高濃度的脯氨酸可能造成的傷害。在本試驗鹽脅迫條件下添加外源脯氨酸提高了甜瓜幼苗葉片ProDH活性和階段性增加ProDH表達量，促進了體內脯氨酸的降解，正是這種代謝調節的體現。

綜上所述，鹽脅迫條件下甜瓜幼苗體內主要是通過增強脯氨酸的谷氨酸合成途徑和抑制脯氨酸降解以增加脯氨酸含量從而緩解鹽脅迫，添加適量外源脯氨酸可增強鳥氨酸合成途徑進一步增加脯氨酸含量，從而提高甜瓜幼苗耐鹽脅迫能力。下一步將繼續對鹽脅迫下添加脯氨酸對脯氨酸代謝關鍵基因的互作、時空表達等影響進行研究，并對鹽脅迫下甜瓜植株生長保護劑進行進一步試驗和發掘。

［1］ MENDLINGER S.Effect of increasing plant density and salinity on yield and fruit quality in muskmelon［J］.Scientia Hort.，1994，57（1）：41—49.

［2］ YAMADA M，MORISHITA H，URANO K，et al.Effects of free Proline accumulation in petunias under drought stress［J］.Journal of Experimental Botany，2005，56（417）：1 975—1 981.

［3］ DELAUNEY A J，VERMA D P S.Proline biosynthesis and osmoregulation in plants［J］.Plant J.，1993，4（2）：215—223.

［4］ LIU SH R（劉書仁），GUO SH R（郭世榮），SUN J（孫 錦），et al.Effects of proline on reactive oxygen metabolism and content of osmotic adjustment substances of cucumber under high temperature stress［J］.Acta Agriculturae Boreali-Occidentalis Sinica（西北農業學報），2010，19（4）：127—131（in Chinese）.

［5］ H YAN（賀 巖），LI ZH G（李志剛），CHEN Y ZH（陳云昭），et al.Effects of exogenous proline on the physiology of soyabeanplantlets regenerated from embryos in vitro and on the ultrastructure of their mitochondria under NaCl stress［J］.Soybean Science（大豆科學），2000，19（4）：314—319（in Chinese）.

［6］ SHRUTI M，RAMA S D.Inhibition of ribonuclease and protease activities in arsenic exposed rice seedlings：role of proline as enzyme protectant［J］.Journal of Plant Physiology，2006，163（9）：927—936.

［7］ MANSOUR M.Protection of plasma membrane of onion epidermal cells by glycine betaine and proline against NaCl stress［J］.Plant Physiology and Biochemistry，1998，36：767—772.

［8］ 顏志明.外源脯氨酸提高甜瓜幼苗耐鹽性的生理調節功能［D］.南京：南京農業大學，2011.

［9］ YAN ZH M（顏志明），SUN J（孫 錦），GUO SH R（郭世榮），et al.Effects of exogenous proline on growth and reactive oxygen substance metabolism of melon seedlings under salt stress［J］.Jiangsu J.of Agr.Sci.（江蘇農業學報），2011，27（1）：141—145（in Chinese）.

［10］ YAN ZH M（顏志明），SUN J（孫 錦），GUO SH R（郭世榮），et al.Effects of exogenous proline on seedling growth，photosynthesis and photosynthetic fluorescence characteristics in leaves of melon under salt stress［J］.Jiangsu J.of Agr.Sci.（江蘇農業學報），2011，27（1）：141—145（in Chinese）.

［11］ 侯彩霞.游離脯氨酸的測定［M］//中國科學院上海植物生理研究所，上海市植物生理學會.現代植物生理學實驗指南.北京：科學出版社，1999：303—304.

［12］ SONG S Q，LEI Y B，TIAN X R.Proline metabolism and cross-tolerance to salinity and heat stress in germinating wheat seeds［J］.Russian Journal of Plant Physiology，2005，52（6）：793—800.

［13］ KIM H R，RHO H W，PARK J W，et al.Assay of ornithine aminotransferase with ninhydrin［J］.Analytical Chemistry，1994，223：205—207.

［14］ ZHAO F G（趙福庚），SUN CH（孫 誠），LIU Y L（劉友良），et al.Effects of ABA and NaCl on metabolism of polyamines and proline in Suaedaglauca Bunge［J］.Journal of Plant Physiology and Molecular Biology（植物生理與分子生物學學報），2002，28（2）：117—120（in Chinese）.

［15］ QUAN X Q（全先慶），ZHANG Y J（張渝潔），SHAN L（單 雷），et al.Advances in proline metabolism researches of higher plants［J］. Biotechnology Bulletin（生物技術通訊），2007，（1）：14—18（in Chinese）.

［16］ SARADHI P，ALIA P，ARORA S，et al.Proline accumulates in plants exposed to UV radiation and protects them against UV induced peroxidation［J］.Biochemistry Biophysiology Resource Communication，1995，209（1）：1—5.

［17］ HARE P D，CRESS W A.Metabolic implications of stress-induced Proline accumulation in plants［J］.Plant Growth Regul，1997，21（2）：79—102.

［18］ SIRIPORNADULSIL S，TRAIN S，VERMA D P S，et al.Molecular mechanisms of proline-mediated tolerance to toxic heavy metals in transgenic microalgae［J］.Plant Cell，2002，14（11）：2 837—2 847.

［19］ ZHANG J F（張金鳳），SHUN M G（孫明高），XIA Y（夏 陽），et al.Salt stresses affect proline contents，nitrate reductase activities and electrical conductivity of seedling leaves of megranate and cherry［J］.Journal of Shandong Agricultural University（Nat.Sci.Edo.）（山東農業大學學報·自然科學版），2004，35（2）：164—168（in Chinese）.

［20］ LU J J（盧靜君），DUO L A（多立安），LIU X J（劉祥君）.Changes in SOD and POD activity and free proline content of Loliumperenne and Festucaelata leaves under different levels of salt stress［J］.Bulletin of Botanical Research（植物研究），2004，24（1）：115—119（in Chinese）.

［21］ DUAN J J（段九菊），GUO SH R（郭世榮），FAN H F（樊懷福），et al.Effects of salt stress on proline and polyamine metabolisms in the roots of cucumber seedlings［J］.Acta Bot.Boreal.-Occident.Sin.（西北植物學報），2006，26（12）：2 486—2 492（in Chinese）.

［22］ GUAN ZH Y（管志勇），CHEN F D（陳發棣），CHEN S M（陳素梅），et al.Morphological and physiological changes of chrysanthemum inflorescence under NaCl stress［J］.Acta Bot.Boreal.-Occident.Sin.（西北植物學報），2009，29（8）：1 624—1 629（in Chinese）.

［23］ TANG ZH CH（湯章城）.The probable significance of proline accumulation under stress［J］.Plant Physiology Communications（植物生理學通訊），1984，1：15—21（in Chinese）.

［24］ CHEN T X（陳托兄），ZHANG J L（張金林），LU N（陸 妮），et al.The characteristics of free proline distribution in various types of salt resistant plants［J］.Acta Prataculturae Sinica（草業學報），2006，15（1）：36—41（in Chinese）.

［25］ LEI Y，YIN C.Effect of osmotic stress and sodium nitroprusside pretreatment on proline metabolism of wheat seedlings［J］.Biologia Plantrum，2007，51（2）：386—390.

［26］ CAO F（曹 芳），WEI Y SH（魏永勝）.Effect of potassium nitrate on proline metabolism in tobacco（Nicotianatabacum L.）under osmotic stress［J］.Acta Agriculturae Boreali-occidentalis Sinica（西北農業學報），2010，19（9）：144—148（in Chinese）.

［27］ HOQUE M A，BANU M N A，NAKAMURA Y，et al.Proline and glycinebetaine enhance antioxidant defense and methylglyoxal detoxification systems and reduce NaCl-induced damage in cultured tobacco cells［J］.Journal of Plant Physiology，2007，165（8）：813—824.

［28］ YAN ZH M（顏志明），SUN J（孫 錦），GUO SH R（郭世榮），et al.Effects of exogenous Proline on the ascorbate-glutathione cycle in roots of cucumismelo seedlings under salt stress［J］.Plant Science Journal（植物科學學報），2014，32（5）：502—508（in Chinese）.

［29］ KUMAR V，SHARMA D K.Isolation and characterization of sodium chloride resistant callus culture of Vignaradiate（L.）Wilczek var. radiata［J］.Journal of Experimental Botany，1989，40（1）：143—147.

［30］ EHSANPOUR A A，FATAHIAN N.Effects of salt and proline on Medicago sativa callus［J］.Plant Cell，Tissue and Organ Culture，2003，73（1）：53—56.

（編輯：裴阿衛）

Effects of Exogenous Proline on Proline Metabolism of Cucumis melo under Salt Stress

YAN Zhiming1，2，3，FENG Yingna1，HAN Yanli1，WEI Yue1，GUO Shirong2
（1 Jiangsu Polytechnic College of Agriculture and Forestry，Zhenjiang，Jiangsu 212400，China；2 College of Horticulture，Nanjing Agricultural University，Nanjing 210095，China；3.Jiangsu Engineering and Technology Center for Modern Horticulture，Zhenjiang，Jiangsu 212400，China）

The melon（Cucumis melo L.）variety‘Xuemei'was nutrient solution cultured to investigate the effect of exogenous proline on proline metabolism under salt stress.The content of proline，△1-pyrroline-5-carboxylate synthase（P5CS）enzyme activity，ornithine-oxo-acid transaminase（OAT）enzyme activity，proline dehydrogenase（ProDH）enzyme activity in leaves were measured under salt stress，addition of exogenous proline under salt stress and the controlrespectively，cloning and semi-quantitative expression analysis of OAT and Pro DH gene were also undertaken.The results showed that compared with the control，the content of proline in the leaves of the seedlings increased significantly under salt stress.The increase of P5CS enzyme activity was larger than that of OAT enzyme，the amount of OAT gene expression did not increase in the majority of time period.ProDH enzyme activity decreased and the amount of Pro DH gene expression also decreased in the leaves of melon seedling under salt stress.With the addition of exogenousproline under salt stress.The content of proline further increased，the activities of OAT and ProDH enzyme improved and activity of P5CS enzyme decreased，the amount of OAT expression increased rapidly，the amount of Pro DH expression increased at first and then fell.This result suggested that proline accumulationin the melon seedlings was mainly through the increase of glutamate pathway and inhibition of proline degradation under salt stress.The adequate exogenous proline under salt stress could enhance the ornithine pathway but had a certain inhibitory effect on the glutamate pathway，and proline was further accumulated to enhance salt tolerance of melon seedling by regulating the synthesis and degradation，two kinds of metabolism ways.

proline；salt stress；Cucumis melo L.；glutamate pathway；ornithine pathway

Q945.78；Q789

A

1000-4025（2015）10-2035-07

10.7606/j.issn.1000-4025.2015.10.2035

2015-06-10；修改稿收到日期：2015-08-21

江蘇省自然科學基金（BK20131243）；江蘇省農業三新工程（SXGC［2015］311）；青藍工程（蘇教師［2014］23）

顏志明（1977—），男，博士，副教授，主要從事蔬菜栽培與分子生理研究。E-mail：yanzming@sohu.com