磷酸肌酸鈉對力竭運動大鼠心肌線粒體解偶聯蛋白2和能量代謝變化的影響

李曉燕，紀麗麗，張紅明，孟可，張國明，韓淑芳

磷酸肌酸鈉對力竭運動大鼠心肌線粒體解偶聯蛋白2和能量代謝變化的影響

李曉燕，紀麗麗，張紅明，孟可，張國明，韓淑芳

目的探討磷酸肌酸鈉對一次力竭運動大鼠心肌線粒體能量代謝變化的影響，探討磷酸肌酸鈉對應激心肌的保護機制。方法雄性Wistar大鼠36只，隨機分為對照組(n=12)、一次力竭組(n=12)、磷酸肌酸鈉組(n=12)。實驗結束后測定各組心肌ATP含量及血漿腎上腺素(E)、去甲腎上腺素(NE)、游離脂肪酸(FFA)濃度，并采用RT-PCR及Western blotting檢測心肌線粒體解偶聯蛋白2(UCP2)表達情況。結果與對照組相比，一次力竭組、磷酸肌酸鈉組血漿FFA、E、NE濃度均增高(P<0.05)，心肌ATP含量均降低。RT-PCR及Western blotting結果顯示，一次力竭組、磷酸肌酸鈉組UCP2 mRNA表達量分別較對照組增加64%、24%，UCP2蛋白表達量分別較對照組增加65%、26%。相關分析顯示，心肌組織UCP2表達量與血漿FFA濃度呈顯著正相關(r=0.98，P<0.01)，血漿FFA濃度與血漿E、NE水平呈顯著正相關(r=0.93，r=0.88，P<0.01)。結論力竭運動后心肌組織UCP2表達量顯著上調，ATP合成減少，能量代謝障礙，可能是運動導致心源性猝死的機制之一。補充外源性磷酸肌酸鈉可拮抗運動應激導致的UCP2表達升高，增加ATP儲備，改善心肌能量代謝，可能對運動導致的心源性猝死預防有一定的積極作用。

解偶聯蛋白2；猝死，心臟；運動過度；磷酸肌酸鈉；能量代謝

世界衛生組織和國際心臟病學會將運動性猝死定義為有或無癥狀的運動員或體育鍛煉者在運動中或運動后24h內意外死亡[1]。目前運動性猝死的具體機制尚不完全清楚。心肌線粒體解偶聯蛋白2(uncoupling protein 2，UCP2)是線粒體內膜上的質子轉運體[2]，可通過“質子漏”作用，將線粒體內膜外的H+轉運回線粒體基質，使氧化磷酸化過程脫偶聯，ATP的生成減少，呼吸鏈上的電子回漏減少，活性氧(reactive oxygen species，ROS)生成減少，從而減弱氧化應激對組織細胞的損傷[3]。磷酸肌酸(creatine phosphate，CP)廣泛存在于興奮性組織(如肌肉、腦)中，在肌酸激酶的催化下將高能磷酸鍵轉移給ADP合成ATP，對氧化應激狀態的心肌細胞具有保護作用[4]。本實驗通過觀察一次力竭運動后大鼠心肌線粒體UCP2表達的改變及其與心肌能量代謝變化的關系，探討運動性心肌損傷的可能發生機制，及補充外源性磷酸肌酸鈉后能否通過降低UCP2的表達、改善心肌能量代謝保護應激下的心肌細胞，為運動性猝死的防治提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組 健康雄性成年Wistar大鼠36只，體重200±50g，由山東大學實驗動物中心提供，所有大鼠先適應性喂養3d，并在3d內進行適應性游泳3次，每次15min。泳池體積為100cm×70cm×80cm，水深50cm，水溫控制在28～32℃。游泳過程中用玻璃棒不斷驅趕大鼠，以防其漂浮在水面或浮于泳池壁。游泳訓練結束后，用毛巾擦干鼠毛并用吹風機吹干。第4天按簡單隨機分組法將大鼠分為對照組(n=12，不運動，第16天處死)，一次力竭組(n=12，不運動，于實驗第16天進行一次性力竭游泳運動)，磷酸肌酸鈉組(n=12，不運動但每天腹腔注射磷酸肌酸鈉15mg/只，至實驗第16天注射藥物后進行一次性力竭游泳運動)。力竭標準：大鼠沉入水底超過10s或游泳動作明顯不協調，撈出后無逃避反應且無法完成翻正反射[5]。

1.2 主要試劑 注射用磷酸肌酸鈉(意大利阿爾法韋士曼制藥公司)；亞細胞結構線粒體提取試劑盒(武漢博士德生物)；BCA蛋白質定量試劑盒(武漢博士德生物)；UCP2抗體(美國 Millipore)；SDSPAGE凝膠配制試劑盒(江蘇碧云天生物)；抗β-actin兔多克隆抗體(北京康為世紀生物)；山羊抗兔IgG(H+L)，HRP(北京康為世紀生物)；兩步法反轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)試劑盒(美國Bio-Rad)。

1.3 大鼠血漿游離脂肪酸(free fatty acids，FFA)濃度測定 實驗結束后立即處死大鼠取血，離心得血漿，–70℃保存，于濟南軍區總醫院生化室全自動檢測儀檢測大鼠血漿FFA濃度。

1.4 大鼠心肌組織ATP含量及血漿腎上腺素(epinephrine，E)、去甲腎上腺素(norepinephrine，N E)濃度測定 采用酶聯免疫雙抗體夾心法(ELISA)。其中ATP測定取大鼠心肌組織加入一定量PBS(pH7.4)勻漿后3000r/min離心20min，取上清。然后將各標本分別加入到預先包被抗體的透明酶標包被板中，37℃溫育30min，洗板5次。加入酶標試劑，37℃溫育30min，洗板5次。加入底物A、B，37℃避光15min后加入終止液。底物在辣根過氧化物酶催化下轉化成藍色，并在酸的作用下最終轉化成黃色，其顏色的深淺與樣品中待測物濃度呈正相關。在450nm波長下測定吸光度(A)值，根據標準品和樣本的A值，計算得出樣本中ATP、E、NE含量。

1.5 RT-PCR檢測大鼠心肌線粒體中UCP2 mRNA表達水平 Trizol法提取心肌總RNA，測定其濃度及純度。根據GenBank公布的UCP2序列設計熒光定量PCR引物：上游5'-CAAGACCATTGCACGAGAGG-3'，下游5'-CCCGAAGGCAGAAGTGAAG-3'，退火溫度59℃，共40個循環。內參β-actin熒光定量PCR引物序列：上游5'TGGCACCCAGCACAATGAA-3'，下游5'-CTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA-3'，退火溫度59℃，40個循環。取同一樣本總RNA 1μl進行兩步法RT-PCR。

1.6 Western blotting測定心肌線粒體UCP2蛋白表達水平 取大鼠心肌組織100～200mg，加入線粒體提取試劑A液，充分勻漿后低溫差速離心法提取線粒體，加入預混的線粒體提取試劑B+C液，充分漩渦震蕩后10 000r/min離心15min，得到線粒體蛋白，BCA法測定線粒體總蛋白含量。計算50μg蛋白上樣量體積，加入5×上樣緩沖液100℃煮沸5min使蛋白質變性后上樣，進行10% SDS-PAGE電泳至溴酚藍完全跑出，轉膜、封閉各90min，加入一抗(1:1000)4℃封閉過夜。TBST洗3遍，加入辣根過氧化物酶標記的二抗(1:1000)37℃孵育90min后進行化學發光顯影。采用凝膠分析系統Quantity One計算條帶光密度值。

1.7 統計學處理 采用SPSS 13.0軟件進行統計分析。計量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用SNK-q檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 大鼠血漿FFA、E、NE濃度及心肌組織ATP含量比較 與對照組相比，一次力竭組、磷酸肌酸鈉組血漿FFA、E、NE濃度均增高，心肌ATP含量均降低，差異有統計學意義(P<0.05)。其中，磷酸肌酸鈉組血漿FFA、E、NE濃度均低于一次力竭組，心肌ATP含量高于一次力竭組，差異有統計學意義(P<0.05，表1)。

2.2 各組大鼠心肌線粒體UCP2 mRNA表達水平比較 磷酸肌酸鈉組、一次力竭運動組大鼠心肌線粒體UCP2 mRNA表達量分別較對照組增加24%、64%，差異均有統計學意義(P<0.05)。磷酸肌酸鈉組大鼠心肌線粒體UCP2 mRNA表達量較一次力竭運動組降低23%，差異有統計學意義(P<0.05，圖1)。

表1 各組血漿FFA、E、NE濃度及心肌組織ATP含量(n=12，±s)Tab.1 Contents of plasma FFA, E, NE and myocardial ATP in different groups (n=12,±s)

表1 各組血漿FFA、E、NE濃度及心肌組織ATP含量(n=12，±s)Tab.1 Contents of plasma FFA, E, NE and myocardial ATP in different groups (n=12,±s)

FFA. Free fatty acids; ATP. Adenosine triphosphate; E. Epinephrine; NE. Norepinephrine. (1)P<0.05 compared with control group; (2)P<0.05 compared with once exhaustive exercise group

Group FFA (mmol/L) ATP (ng/ml) E (ng/L) NE (ng/L) Control 0.13±0.06 14.54±0.41 58.56±4.78 73.46±5.66 Once exhaustive exercise 0.43±0.10(1) 9.45±0.91(1) 119.07±4.72(1) 123.30±6.09(1)Creatine phosphate sodium 0.33±0.07(1)(2) 11.85±0.56(1)(2) 102.70±4.64(1)(2) 113.95±5.29(1)(2)

圖1 各組大鼠心肌線粒體UCP2 mRNA表達水平比較Fig.1 Expression levels of UCP2 mRNA in each groupA. Control group; B. Once exhaustive exercise group; C. Creatine phosphate sodium. (1)P<0.05 compared with control group; (2)P<0.05 compared with once exhaustive exercise group

2.3 各組大鼠心肌線粒體UCP2蛋白表達水平比較

與對照組相比，一次力竭組、磷酸肌酸鈉組大鼠心肌線粒體UCP2蛋白表達量均增高，分別增加約65%、26%，差異均有統計學意義(P<0.05)。與一次力竭組相比，磷酸肌酸鈉組大鼠心肌線粒體UCP2蛋白表達降低23%，差異有統計學意義(P<0.05，圖2)。

2.4 血漿FFA濃度與心肌線粒體UCP2蛋白表達量相關性分析 心肌線粒體UCP2蛋白表達量與血漿FFA濃度呈顯著正相關(P<0.01，圖3)。

2.5 心肌組織ATP含量與UCP2蛋白表達量的相關性分析 心肌組織ATP含量與UCP2蛋白表達量呈顯著負相關(P<0.01，圖4)。

2.6 血漿E、NE濃度與血漿FFA濃度的相關性分析 血漿FFA濃度與血漿E、NE水平呈顯著正相關(P<0.01，圖5、6)。

圖2 各組大鼠心肌線粒體UCP2蛋白表達水平比較Fig.2 Comparison of the expression levels of UCP2 in myocardial mitochondria of each groupA. Control group; B. Once exhaustive exercise group; C. Creatine phosphate disodium. (1)P<0.05 compared with control group; (2)P<0.05 compared with once exhaustive exercise group

圖3 大鼠血漿FFA與心肌線粒體UCP2蛋白表達量的散點圖Fig.3 Scatter plot of plasma FFA and the expression of UCP2 in myocardial tissue

3 討 論

心肌在收縮和舒張時需要消耗大量能量，尤其在舒張時消耗能量較收縮時更多，在能量代謝異常時，如劇烈運動過程中，心肌收縮和舒張功能會進行性惡化，導致各種惡性心律失常甚至心源性猝死(sudden cardiac death，SCD)[6]。心臟能量來源主要由葡萄糖、脂肪酸等經線粒體有氧氧化產生的ATP直接供給。在能量代謝異常時會優先保證ATP的生成及供給[7]。Murray等[8]研究發現，心衰時衰竭的心肌細胞ATP水平可降至正常的70%～75%，同時伴有UCP2表達水平和FFA濃度的增加。UCP2表達上調、解偶聯作用增強又會加重心肌能量代謝障礙[9]。Cortright等[10]研究發現，經過2h急性跑臺運動后小鼠骨骼肌中UCP2的表達上調。Bo等[7]研究發現，無論之前是否經過有氧訓練，在進行一次力竭運動后大鼠心肌線粒體UCP2 mRNA表達量均顯著上調。本實驗結果也證實，在進行一次力竭運動后大鼠心肌組織UCP2蛋白和mRNA表達量均上調，且隨UCP2表達的增加，ATP合成減少，兩者呈顯著負相關，提示運動時能量代謝障礙與UCP2表達增高密切相關，UCP2表達增高不僅是運動時線粒體功能障礙的表現，還能進一步加重線粒體功能紊亂。此外，本研究結果顯示，血漿FFA濃度與心肌組織UCP2表達量呈顯著正相關，提示UCP2的表達與血漿FFA濃度密切相關，血漿中FFA水平的增高會誘導UCP2的表達增加。機體在劇烈運動時交感-腎上腺髓質系統即刻調動，大量分泌兒茶酚胺類物質，腎上腺素可通過β1、β3受體激活甘油三酯酶，加速脂肪分解，導致血漿FFA濃度增高。血漿FFA濃度增高后可能通過激活過氧化物酶體增殖物活化受體(peroxisome proliferator-activited receptor，PPAR)來調控心肌UCP2的表達。Murray等[8]研究證實，在小鼠的心臟組織中，血漿FFA濃度升高可促進心肌UCPs的蛋白表達，且UCP2蛋白表達增加是通過激活PPARα實現的，PPARα受體的特異性拮抗劑MK886可同時在mRNA和蛋白水平拮抗FFA濃度升高引起的UCP2表達增加[11]。

圖4 大鼠心肌線粒體UCP2蛋白表達量與ATP含量的散點圖Fig.4 Scatter plot of the expression of UCP2 in myocardial tissue and the content of ATP

圖5 血漿E濃度與FFA濃度的散點圖Fig.5 Scatter plot of plasma epinephrine and FFA

圖6 血漿NE濃度與FFA濃度的散點圖Fig.6 Scatter plot of plasma norepinephrine and FFA

本研究結果顯示，腹腔注射磷酸肌酸鈉后進行一次性力竭運動的大鼠心肌線粒體UCP2蛋白和mRNA表達均低于未經藥物干預的大鼠，且心肌組織ATP含量降低程度低于未經干預大鼠，差異均有統計學意義，提示腹腔注射磷酸肌酸鈉可通過降低UCP2的表達來提高體內ATP儲量，減輕氧化應激對心肌的損傷。該結果提示在進行一次大強度運動前給予一定量的磷酸肌酸鈉可減輕急性運動應激對心肌的損傷，從而降低心源性猝死的風險。磷酸肌酸在肌肉收縮的能量代謝中發揮重要作用，它是心肌和骨骼肌的化學能量儲備，當ATP為肌動蛋白的收縮提供能量后水解生成ADP，磷酸肌酸在肌酸激酶的催化下迅速將其高能磷酸鍵轉移至ADP，重新合成ATP，為肌肉收縮提供能量。在運動后的恢復期內，剩余的肌酸又可以被ATP磷酸化生成磷酸肌酸作為能量的儲備。外源性磷酸肌酸在臨床中主要用于心臟手術時加入心臟停搏液中保護心肌，或改善缺血狀態下的心肌代謝異常。補充外源性磷酸肌酸不僅能通過提供高能磷酸鍵提高ATP儲備，而且可以降低細胞膜的流動性，增加膜的可塑性和穩定性，保護細胞免受胞內酶的損傷，還能直接作用于線粒體，維持線粒體的能量供應及正常功能[12]。Moibenko等[13]研究發現，在劇烈運動訓練前應用外源性磷酸肌酸鈉可以穩定血管內皮，增強體液因子的內皮依賴性血管舒張作用，減輕劇烈運動后胞內漏出物導致的血管栓塞、代謝產物堆積、肌纖維受損、自由基損害及缺血再灌注損傷。

大量研究表明，不同的運動模式對機體生理功能的影響不同，漸進的有氧運動可改善機體能量代謝，提高抗氧化能力，而急性的力竭運動可增加自由基的產生，對機體造成損傷，甚至導致猝死。國內外調查研究結果顯示，運動訓練導致的猝死約80%為SCD，但其具體機制尚未闡明[1,14]。Turner等[15]研究發現，在可興奮細胞表達上調的UCP2能夠阻斷線粒體對Ca2+的攝取，干擾心肌的正常興奮收縮耦聯，增加心律失常的風險。本研究發現，超負荷運動達力竭狀態后心肌組織UCP2表達顯著上調，ATP合成減少，能量代謝障礙，可能是運動訓練導致心源性猝死的機制之一。同時，補充外源性磷酸肌酸后可拮抗運動應激導致的UCP2表達增加，提高ATP儲備，可改善能量代謝異常，提高最大作功能力，延遲力竭狀態的出現，加快運動后的恢復，保護心血管系統功能，可能對預防運動導致的心源性猝死有一定積極作用。

[1]Maron BJ, Shirani J, Poliac LC,et al. Sudden death in young competitive athletes. Clinical, demographic, and pathological profiles[J]. JAMA, 1996, 276(3): 199-204.

[2]Liu L, Tan BT, Li Y,et al. Protective effect and its mechanism of curcumin on ischemia-reperfusion injury of cerebral cortex in rats[J]. Med J Chin PLA, 2013, 38(3): 190-194.[劉莉, 譚波濤,李昱, 等. 姜黃素對大鼠大腦皮質缺血再灌注損傷的保護作用及其機制研究[J]. 解放軍醫學雜志, 2013,38(3): 190-194.]

[3]Hoss SE, Bahr GM, Echtay KS,et al. Lopimune-induced mitochondrial toxicity is attenuated by increased uncoupling protein-2 level in treated mouse hepatocytes[J]. Biochem J, 2015, 468(3): 401-407.

[4]Li HY, Chen C. Interventional effects of pretreatment with total polyphenols extracted from Toona sinensis on the injury induced by myocardial ischemia-reperfusion in rats[J]. Med J Chin PLA, 2011, 36(1): 58-60.[李紅月, 陳超. 香椿子總多酚預處理對大鼠心肌缺血再灌注損傷的干預作用觀察[J]. 解放軍醫學雜志, 2011, 36(1): 58-60.]

[5]Thomas DP, Marshall KI. Effects of repeated exhaustive exercise on myocardial subcellular membrane structures[J]. Int J Sports Med, 1988, 9(4): 257-260.

[6]Grabs V, Peres T, Zelger O,et al. Decreased prevalence of cardiac arrhythmias during and after vigorous and prolonged exercise in healthy male marathon runners[J]. Am Heart J, 2015, 170(1): 149-155.

[7]Bo H, Jiang N, Ma G,et al. Regulation of mitochondrial uncoupling respiration during exercise in rat heart: role of reactive oxygen species (ROS) and uncoupling protein 2[J]. Free Radic Biol Med, 2008, 44(7): 1373-1381.

[8]Murray AJ, Panagia M, Hauton D,et al. Plasma free fatty acids and peroxisome proliferator-activated receptor in the control of myocardial uncoupling protein levels[J]. Diabetes, 2005, 54(12): 3496-3502.

[9]Murray AJ, Cole MA, Lygate CA,et al. Increased mitochondrial uncoupling proteins, respiratory uncoupling and decreased efficiency in the chronically infarcted rat heart[J]. J Mol Cell Cardiol, 2008, 44(4): 694-700.

[10] Cortright RN, Zheng D, Jones JP,et al. Regulation of skeletal muscle UCP-2 and UCP-3 gene expression by exercise and denervation[J]. AM J Physiol, 1999, 276(1 Pt 1): E217-E221.

[11] Li N, Wang J, Gao F,et al. The Role of uncoupling protein 2 in the apoptosis induced by free fatty acid in rat cardiomyocytes[J]. J Cardiovasc Pharmacol, 2010, 55(2): 161-167.

[12] Liu YQ, Li TD, Ren YH,et al. Protective effect of phosphocreatine on mitochondrial membrane in cardiomyocytes[J]. Chin Heart J, 2004, 16(1): 14-16.[劉瑛琪, 李天德, 任藝虹, 等. 磷酸肌酸對心肌細胞線粒體的保護作用[J]. 心臟雜志, 2004, 16(1): 14-16.]

[13] Moibenko AA, Marchenko GI, Kotsuruba VN,et al. Effect of exogenous phosphocreatine on endothelium and endothelium dependent vascular reactions in immune cardiac injury[J]. Curr Ther Res, 1992, 52(6): 791-801.

[14] Maron BJ, Pelliccia A. The heart of trained athletes: cardiac remodeling and the risks of sports, including sudden death[J]. Circulation, 2006, 114(15): 1633-1644.

[15] Turner JD, Gaspers LD, Wang G,et al. Uncoupling protein 2 modulates myocardial excitation-contraction coupling[J]. Circ Res, 2010, 106(4): 730-738.

Effects of creatine phosphate disodium on the uncoupling protein 2 in myocardial mitochondria and the energy metabolism in rats after exhaustive exercise

LI Xiao-yan1, JI Li-li2, ZHANG Hong-ming1, MENG Ke2, ZHANG Guo-ming1, HAN Shu-fang11Department of Cardiology, General Hospital of Jinan Command, Jinan 250031, China
2Graduate School of Liaoning Medical University, Jinzhou, Liaoning 121001, China
This work was supported by the 2014 Major Projects of PLA Logistics Research (AWS13C008)

ObjectiveTo explore the effect of creatine phosphate disodium (CPDS) on the energy metabolism of myocardial mitochondria in rats after single exhaustive exercise, and the underline mechanism of protection effects of CPDS on myocardium under stress situation. MethodsThirty six male Wistar rats were randomly divided into control group, once exhaustive exercise group, and CPDS group (12 for each). The concentrations of myocardial ATP, plasma epinephrine (E), norepinephrine (NE) and free fatty acid (FFA) were determined. RT-PCR and Western blotting were performed to detect the expressions of uncoupling protein 2 (UCP2) in myocardial mitochondria.ResultsThe concentrations of plasma FFA, E and NE increased and the contents of myocardial ATP declined significantly in single exhaustive exercise group and CPDS group as compared with that in control group (P<0.05). RT-PCR revealed that the expressions of UCP2 mRNA were up-regulated by 64% and 24%, respectively, in single exhaustive exercise group and CPDS group when compared with that in control group. Western blotting showed that the expressions of UCP2 were increased by 65% and 26%, respectively, in single exhaustive exercise group and CPDS group when compared with that in control group. Correlation analysis showed a significant positive correlation of the expression of myocardial UCP2 to the concentration of plasma FFA (r=0.98,P<0.01), also of the concentration of plasma FFA to the levels of plasma E and NE (r=0.93,r=0.88,P<0.01).ConclusionsAfter exhaustive exercise, the expression of myocardial UCP2 is significantly up-regulated, the synthesis of ATP reduced, and the energy metabolism disturbed, which may be one of the mechanisms leading to sudden cardiac death in sports training. Meanwhile, supplement of external CPDS may antagonize the increased expression of UCP2 induced by exercise stress, increase ATP reserves and improve the energy metabolism, and it may have a positive effect on prevention of sudden cardiac death induced by exhaustive exercise.

uncoupling protein 2; death, sudden, cardiac; hyperkinesis; creatine phosphate disodium; energy metabolism

R541

A

0577-7402(2015)11-0897-05

10.11855/j.issn.0577-7402.2015.11.08

2015-06-01；

2015-08-15)

(責任編輯：張小利)

2014全軍后勤科研重大項目子項目(AWS13C008)

李曉燕，醫學碩士，主任醫師。主要從事心血管內科基礎、臨床及介入方面的工作

250031 濟南 濟南軍區總醫院心內科(李曉燕、張紅明、張國明、韓淑芳)；121001 遼寧錦州 遼寧醫學院研究生院(紀麗麗、孟可)