miR-155對HBV蛋白表達的抑制作用及機制

蔡啟茵，任廣立，張衛云，馮宇鵬，馬恒顥

miR-155對HBV蛋白表達的抑制作用及機制

蔡啟茵，任廣立，張衛云，馮宇鵬，馬恒顥

目的觀察miR-155對SOCS1 mRNA及蛋白水平的影響，探究miR-155對HBsAg、HBeAg表達的抑制作用。方法從HepG2.2.15細胞中提取基因組，經PCR擴增得到miR-155前體序列，純化并連接入pmR-mCherry載體，構建重組質粒pmiR-155，經去內毒素后轉染至HepG2.2.15細胞。將細胞分為重組組(轉染pmiR-155質粒)、空載組(轉染pmR-mCherry質粒)、轉染試劑組、空白組。采用熒光實時定量PCR檢測各組細胞內miR-155的表達，RT-PCR檢測各組細胞SOCS1 mRNA的表達，Western blotting檢測各組細胞SOCS1 蛋白的表達，ELISA檢測各組細胞HBsAg、HBeAg的表達。結果熒光實時定量PCR結果顯示，以空白組細胞內miR-155的表達量為基準，重組組miR-155表達量(519.43±52.10)明顯高于空載組(24.24±16.70)及轉染試劑組(35.04±26.09，P＜0.05)；RT-PCR結果顯示，重組組SOCS1 mRNA表達量(0.63±0.91)顯著低于空白組(P＜0.05)；Western blotting結果顯示，重組組SOCS1蛋白表達量顯著低于空白組。以空白組的表達量為基準，重組組HBsAg和HBeAg蛋白表達的抑制率分別為55.62%±3.77%和47.87%±2.46%(P＜0.01)。結論過表達的miR-155可抑制細胞內SOCS1和HBV蛋白的表達。

乙型肝炎，慢性；微RNAs；乙型肝炎表面抗原；乙型肝炎核心抗原

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)呈全球性流行，每年約100萬人死于HBV相關的肝衰竭或原發性肝癌。干擾素和核苷類似物是目前抗HBV的主要藥物[1]，可在一定程度上抑制HBV的復制，減輕肝損害，但無法徹底清除體內的病毒[2]。最近研究發現，miRNAs不僅可干擾病毒聚合酶或相關蛋白合成，而且可改變抗原提呈，從而達到抑制病毒復制的作用[3]。miR-155被認為是新興的炎癥因子，可調控免疫系統發育和應答、抗病毒感染等生物進程[4]。研究指出，miR-155通過抑制細胞因子信號轉導抑制因子1(suppressor of cytokine signaling1，SOCS1)調節體內的干擾素信號通路，增強抗病毒效應[5]。然而，目前尚無證據證明特定的miRNA可通過調控信號通路來達到干擾HBV表達的作用。本研究通過構建miR-155真核過表達載體，體外轉染HepG2.2.15細胞，從蛋白和基因水平評估miR-155 對SO CS1表達的影響，同時觀察細胞所分泌HBsAg、HBeAg水平的改變，為進一步研究miR-155 在HBV慢性感染中抗病毒作用提供線索。

1 材料與方法

1.1 主要材料及試劑 pmR-mCherry質粒由美國Dr. Keith Peden惠贈。大腸埃希菌菌株DH5α及肝癌細胞株HepG2.2.15細胞由本院醫學實驗科保存。PCRTaq、QuickCutEcoR Ⅰ、QuickCutBamH Ⅰ、T4DNA連接酶及DNA切膠回收試劑盒均購自TaKaRa公司；去內毒素質粒小提中量試劑盒購自Omega公司；Trizol總RNA提取試劑盒、脂質體Lipofectamine 2000及M-MLV 1st strand Kit購自Invitrogen公司；抗SOCS1多克隆抗體購自Cell Signaling公司；辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG(二抗，1:4 000)購自北京中杉金橋科技有限公司；乙型肝炎病毒表面抗原診斷試劑盒、乙型肝炎病毒e抗原診斷試劑盒購自深圳華康生物醫學有限公司；用于熒光定量PCR檢測的miR-155及U6特異性引物均為廣州銳博生物科技有限公司產品。

1.2 載體構建 根據miRBase及GenBank數據庫查找得到成熟miR-155莖環序列及miR-155前體側翼序列，利用Primer 5.0及Oligo 7設計引物(表1)。以HepG2.2.15細胞基因組為模板PCR擴增得到miR-155前體序列，經EcoRⅠ和BamHⅠ雙酶切，退火連接到pmR-mCherry載體，克隆轉化、搖菌、測序鑒定后，得到重構質粒pmiR-155。去內毒素提取重組質粒用于轉染實驗[6]。

1.3 HepG2.2.15細胞培養及轉染 將HepG2.2.15細胞培養于含200mg/L G418、100g/L FBS、10萬U/L青鏈霉素、10g/L L-谷氨酰胺的高糖DMEM培養液中，于37℃、5%CO2培養箱中培養。細胞傳代培養3次后消化接種至6孔板，4.8×105個細胞/孔，培養24h后待細胞融合度達80%時轉染(轉染時不加雙抗)[7]。設重組組(轉染pmiR-155質粒)、空載組(轉染pmR-mCherry質粒)、轉染試劑組、空白組。轉染試劑Lipofectamine 2000(μl)與質粒(μg)的比例為3:1。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequence

1.4 熒光實時定量PCR檢測各組miR-155表達 應用Trizol法提取各組細胞中總RNA，經紫外分光光度法測定濃度及純度后，采用莖環法[8]反轉錄得到cDNA，進行熒光實時定量PCR反應。反應程序為95℃ 10s，60℃ 20s，70℃ 10s，循環40次。所得數據采用2-ΔΔCt表示，并評估樣本間差異。

1.5 RT-PCR檢測各組SOCS1 mRNA表達 應用Trizol法提取各組總RNA，反轉錄得到cDNA，行RT-PCR。反應程序：94℃ 30s，57℃ 30s, 72℃30s，循環30次。GAPDH序列的PCR反應程序除退火溫度改為56℃外，其余與SOCS1相同。所得產物經凝膠電泳及測序鑒定。應用Gel-pro Analyzer分析各組mRNA的相對表達量。

1.6 Western blotting檢測各組SOCS1蛋白表達轉染72h后收集各組細胞，用預冷PBS沖洗3遍，每孔加入100μl裂解液，冰上放置30min后移入離心管，4℃、12 000r/min離心30min，收集上清液。BCA法測定蛋白濃度。加入50μl 2×上樣緩沖液混勻，99℃煮10min，取50μg樣品行12% SDS-PAGE凝膠電泳。電泳結束后用半轉移儀將蛋白從凝膠轉移到PVF膜，封閉液封閉，先后與抗SOCS1多克隆抗體(1:1 000稀釋)和辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG(1:4 000稀釋)孵育，洗膜，加入化學發光劑ECL，在Sage Creation凝膠成像儀中曝光顯影。

1.7 HBsAg和HBeAg蛋白的檢測 收集細胞轉染24、48h和72h的培養上清液，1000r/min離心5min，吸取上清，應用ELISA法檢測各組細胞HBsAg和HBeAg的分泌量。嚴格按試劑盒說明操作，結果用吸光度(A)值表示。

1.8 統計學處理 采用SPSS 17.0軟件進行統計分析，所有數據均以表示，組間均數比較采用One-Way ANOVA法，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 miR-155真核過表達載體的構建及鑒定 經測序鑒定，PCR擴增的人miR-155前體序列連入pmR-mCherry真核過表達載體，序列正確，沒有堿基丟失、替換等，重組質粒構建成功(圖1)。

2.2 miR-155在轉染細胞中的表達 經熒光實時定量PCR檢測，以空白組細胞內miR-155的表達量為基準，重組組miR-155表達量(519.43±52.10)明顯高于空載組(24.24±16.7)及轉染試劑組(35.04±26.09，P＜0.05)。

2.3 miR-155對SOCS1 mRNA表達的抑制作用RT-PCR檢測結果表明，以GAPDH表達為參照，空載組(0.95±0.79)、轉染試劑組(0.94±0.52)與空白組SOCS1 mRNA的表達量無明顯差異，重組組SOCS1 mRNA的表達量(0.63±0.91)顯著低于空白組(P＜0.05，圖2)。

2.4 miR-155對SOCS1蛋白表達的抑制作用Western blotting檢測表明，以β-actin表達為參照，轉染72h后，空載組、轉染試劑組與空白組SOCS1蛋白表達量均無明顯差異，而重組組SOCS1蛋白表達量顯著低于空白組(P＜0.05，圖3)。

2.5 miR-155對HBsAg和HBeAg蛋白表達的抑制作用 ELISA檢測結果表明，轉染后重組組培養上清液的HBsAg、HBeAg表達量明顯受到抑制，尤其是轉染后48h。空載組、轉染試劑組對蛋白的表達幾乎沒有影響。轉染48h時，重組組HBsAg和HBeAg蛋白表達的抑制率分別為55.62%±3.77%和47.87%±2.46%，與其他3組相比差異均有統計學意義(P<0.05，圖4)。

圖1 重組質粒pmiR-155部分核酸序列測序結果Fig.1 Sequencing results of partial nucleic acid of recombinant plasmid pmiR-155

圖2 RT-PCR檢測轉染后各組細胞內SOCS1 mRNA表達Fig.2 Expression of SOCS1 mRNA in each group (RT-PCR) M. DL2000; 1. pmiR-155 plasmid group; 2. pmR-mCherry plasmid group; 3. Reagent group; 4. Blank group

圖3 Western blotting檢測轉染后各組細胞SOCS1蛋白表達Fig.3 Expression of SOCS1 proteins in each group (Western blotting)1. pmiR-155 plasmid group; 2. pmR-mCherry plasmid group; 3. Reagent group; 4. Blank group

圖4 ELISA檢測轉染后各組細胞HBsAg(A)和HBeAg(B)蛋白表達Fig.4 Expression of HBsAg (A) and HBeAg (B) proteins in each group (ELISA)

3 討 論

miRNA可通過降解靶細胞mRNAs或抑制蛋白翻譯來調控轉錄后期的基因表達[9-10]。miR-155是21nt的小分子RNA，在抗病毒感染、抗腫瘤和免疫調節中發揮重要作用[11-13]。Banerjee等[14]研究發現，miR-155通過激活IFN-γ信號通路誘導Th1細胞分化，活化CD4+T細胞來調節免疫系統穩定。Rodriguez等[15]證實miR-155可作用于IL-2信號途徑，抑制SOCS1的表達，從而影響調節性T細胞的分化能力。此外，研究已證實了SOCS1是miR-155的靶位點，可負反饋性阻斷細胞因子信號轉導過程(如干擾素、IL-10、IL-12等信號通路)[16]。miR-155抑制SOCS1表達后可削弱其對相關細胞因子的負反饋調節，促進細胞因子的分泌，增強抗病毒作用。然而，在HBV慢性感染中，miR-155對SOCS1的抑制及干擾HBV蛋白分泌的作用及機制尚未明確。

本研究所選用的H BV慢性感染細胞模型HepG2.2.15細胞能持續分泌HBV蛋白及表達HBV DNA，是探討miR-155在HBV慢性感染中所發揮作用的較佳細胞模型。目前尚未見在HepG2.2.15細胞中研究miR-155對SOCS1表達影響的報道。本研究成功構建了人miR-155真核過表達載體，并轉染至HepG2.2.15細胞，結果顯示，SOCS1的mRNA和蛋白表達量隨著細胞內的miR-155表達上調而下降，且轉染了人miR-155過表達載體的HepG2.2.15細胞HBsAg、HBeAg分泌量也明顯降低。

綜上，本研究證實了在HBV慢性感染中，過表達miR-155可抑制SOCS1及HBV蛋白的表達，其作用機制很有可能是由于過表達的miR-155下調了SOCS1的表達，削弱了其負反饋調節，增強了機體的抗病毒作用，從而抑制HBsAg、HBeAg的表達。本研究結果為進一步探討miR-155在HBV慢性感染中的免疫調節及抗病毒作用奠定了基礎，并為miRNAs治療HBV提供了實驗證據。

[1]Yang HY, Chen GM, Cui YM,et al. Clinical study on safety and immunogenicity of therapeutic dual-plasmid HBV DNA vaccine mediated byin vivoelectroporation[J]. Med J Chin PLA, 2013, 38(3): 204-209.[楊海燕, 陳光明, 崔一民, 等. 電脈沖介導的治療性雙質粒HBV DNA疫苗的臨床安全性及免疫原性研究[J]. 解放軍醫學雜志, 2013, 38(3): 204-209.]

[2]Hadziyannis SJ, Vassilopoulos D, Hadziyannis E. The natural course of chronic hepatitis B virus infection and its management[J]. Adv Pharmacol, 2013, 67: 247-291.

[3]Gambari R, Fabbri E, Borgatti M,et al. Targeting microRNAs involved in human diseases: a novel approach for modification of gene expression and drug development[J]. Biochem Pharmacol, 2011, 82(10): 1416-1429.

[4]Vigorito E, Kohlhaas S, Lu D. MiR-155: an ancient regulator of the immune system[J]. Immunol Rev, 2013, 253(1): 146-157.

[5]Lu LF, Thai TH, Calado DP,et al. Foxp3-dependent microRNA155 confers competitive fitness to regulatory T cells by targeting SOCS1 protein[J]. Immunity, 2009, 30(1): 80-91.

[6]Cai QY, Ren GL, Zhang WY,et al. Construction of eukaryotic overexpression vector of human miR-155 and its expression of HBeAg in HepG 2.2.15 hepatoma cells[J]. World Chin J Digest, 2014, 22(28): 4217-4222.[蔡啟茵, 任廣立, 張衛云,等. 人miR-155真核過表達載體的構建及其對HepG2.2.15細胞中HBeAg的抑制效應[J]. 世界華人消化雜志, 2014, 22(28): 4217-4222.]

[7]Sells MA, Chen ML, Acs G. Production of hepatitis B virus particles in Hep G2 cells transfected with cloned hepatitis B virus DNA[J]. Pro Natl Acad Sci USA, 1987, 84(4): 1005-1009.

[8]Chen C, Ridon DA, Broomer AJ,et al. Real-time quantification of microRNAs by stem-loop RT-PCR[J]. Nucleic Acids Res, 2005, 33(20): e179.

[9]Wen LJ, Wu JH, Song SJ,et al. Effect of simulated null gravity on the secretion of adrenomedullary hormones and miRNA-375 expression in rats[J]. Med J Chin PLA, 2015, 40(4): 322-326.[溫麗君, 吳繼華, 宋淑軍, 等. 失重對大鼠腎上腺髓質激素分泌及miRNA-375表達的影響[J]. 解放軍醫學雜志, 2015, 40(4): 322-326.]

[10] Tan H, Chen RM, Li XY,et al. Differences of CD4+ T lymphocyte miRNA gene expression in acute coronary artery syndrome (ACS) patients and the effects of rosuvastatin on its expressions[J]. Med J Chin PLA, 2014, 39(2): 99-104.[談紅, 陳瑞敏, 李曉燕, 等. 瑞舒伐他汀對急性冠脈綜合征患者CD4+ T淋巴細胞miRNA表達的影響[J]. 解放軍醫學雜志, 2014, 39(2): 99-104.]

[11] Tili E, Croce CM, Michaille JJ. miR-155: on the crosstalk between inflammation and cancer[J]. Int Rev Immunol, 2009, 28(5): 264-284.

[12] Pareek S, Roy S, Kumari B,et al. MiR-155 induction in microglial cells suppresses Japanese encephalitis virus replication and negatively modulates innate immune responses[J]. J Neuroinflammation, 2014, 11: 97.

[13] Czyzyk-krzeska MF, Zhang X. MiR-155 at the heart of oncogenic pathways[J]. Oncogene, 2014, 33(6): 677-678.

[14] Banerjee A, Schambach F, DeJong CS,et al. Micro-RNA-155 inhibits IFN-gamma signaling in CD4+T cells[J]. Eur J Immunol, 2010, 40(1): 225-231.

[15] Rodriguez A, Vigorito E, Clare S,et al. Requirement of bic/ microRNA-155 for normal immune function[J]. Science, 2007, 316(5824): 608-611.

[16] Cornish AL, Chong MM, Davey GM,et al. Suppressor of cytokine signaling-1 regulates signaling in response to interleukin-2 and other gamma c-dependent cytokines in peripheral T cells[J]. J Biol Chem, 2003, 278(25): 22755-22761.

Inhibitory effect of miR-155 on expression of hepatitis B virus and its mechanism

CAI Qi-yin, REN Guang-li*, ZHANG Wei-yun, FENG Yu-peng, MA Heng-hao
Department of Pediatrics, General Hospital of Guangzhou Command, Guangzhou 510010, China
*< class="emphasis_italic">Corresponding author, E-mail: guangliren@hotmail.com

, E-mail: guangliren@hotmail.com
This work was supported by the Science and Technology Foundation of Guangzhou (2013J4100116)

ObjectiveTo investigate the mechanism of miR-155 regulating SOCS1 in the inhibition of HBsAg and HBeAg.MethodsThe pre-miR-155 was amplified from total DNA of HepG2.2.15 by PCR. The target gene fragment was digested and cloned into the pmR-mCherry plasmid. PmiR-155 was transfected into HepG2.2.15 cells (recombinant group) by liposome-mediated method. The empty plasmid, the reagent group and untreated cells were set as control. Firstly the expression of miR-155 was detected by the real-time quantitative PCR. Secondly, the expression of SOCS1 mRNA was detected by RT-PCR, and then the expression of SOCS1 protein was determined by Western blotting. Finally, the expression of HBsAg and HBeAg was determined by ELISA.ResultsThe pmiR-155 eukaryotic over-expression vector was successfully constructed. MiR-155 level of HepG2.2.15 cells which was transfected with the recombinant plasmid (519.43±52.10) was obviously higher than those of the empty plasmid (24.24±16.70) and reagent groups (35.04±26.09,P<0.05). RT-PCR showed the expression of SOCS1 mRNA was lower in recombinant group than in untreated group. The expression of SOCS1 protein markedly decreased as shown with Western blotting. Over-expression of miR-155 could inhibit the expressions of HBsAg and HBeAg (55.62±3.77)% and (47.87±2.46)% (P<0.01) respectively.ConclusionsOver-expression of miR-155 can down regulate the expression of SOCS1, and inhibit the expressions of HBsAg and HBeAg.

hepatitis B, chronic; microRNAs; hepatitis B surface antigens; hepatitis B core antigens

R512.6

A

0577-7402(2015)11-0902-04

10.11855/j.issn.0577-7402.2015.11.09

2015-05-18；

2015-07-29)

(責任編輯：熊曉然)

廣州市科技計劃項目(2013J4100116)

蔡啟茵，醫學碩士。主要從事兒科病毒感染性疾病的研究

510010 廣州 廣州軍區廣州總醫院兒科(蔡啟茵、任廣立、張衛云、馮宇鵬、馬恒顥)

任廣立，E-mail: guangliren@hotmail.com