死亡相關蛋白(DAP-5)在慶大霉素誘導的人腎小管上皮細胞凋亡過程中的表達變化及機制

高建軍，谷昭艷，許永星，梁勃然，韋加美，高月花，那宇

死亡相關蛋白(DAP-5)在慶大霉素誘導的人腎小管上皮細胞凋亡過程中的表達變化及機制

高建軍，谷昭艷，許永星，梁勃然，韋加美，高月花，那宇

目的建立慶大霉素誘導人腎小管上皮細胞(HK2)凋亡模型；觀察死亡相關蛋白5(DAP5)在HK2凋亡過程中的表達變化，并探討其與PI3K/Akt/mTOR通路之間的關系。方法以3.2mg/ml慶大霉素作用于HK2，應用瓊脂糖凝膠電泳觀察凋亡細胞DNA條帶，流式細胞儀測定細胞凋亡率。采用Western blotting法觀察DAP5與Akt、p-Akt表達的改變，應用雷帕霉素阻斷PI3K/Akt/mTOR通路后觀察DAP5的表達變化。結果慶大霉素作用24h后HK2細胞即出現凋亡，凋亡率隨時間延長而增加，24、36、72h的凋亡率分別為5.9%，23.0%，49.9%(P<0.05)。與此同時，細胞DAP5活化裂解生成DAP5/p86，且表達逐漸增加(P<0.05)。在凋亡的同時p-Akt蛋白的表達水平也逐漸增加(P<0.05)，應用雷帕霉素阻斷PI3K/Akt/mTOR通路后，裂解產生的DAP5/p86減少(P<0.05)。結論慶大霉素可誘導HK2細胞發生細胞凋亡，凋亡率隨時間的延長而增加。在誘導HK2細胞凋亡過程中DAP5裂解活化產生DAP5/p86，且這一過程可能是經過PI3K/ Akt/mTOR途徑來完成的。

慶大霉素；凋亡；死亡相關蛋白；腎小管上皮細胞

氨基糖甙類抗生素的腎毒性已為臨床所證實，其臨床表現主要為急性腎小球壞死和急性腎衰竭，表現為組織及功能上的近端小管毒性損傷[1-2]。氨基糖甙類抗生素進入腎小管上皮細胞(尤其是近端小管上皮細胞)后，可造成溶酶體酶大量漏出。繼而損害線粒體等細胞內結構，細胞出現變性、壞死[3]。慶大霉素作為氨基糖甙類的代表性藥物，除了造成溶酶體的改變，致細胞變性、壞死之外，同時也可使腎臟近端小管上皮細胞表現出凋亡特征，但慶大霉素誘導腎小管上皮細胞凋亡的具體機制尚不完全清楚。

死亡相關蛋白5(death-associated protein 5，DAP5)是一真核細胞翻譯調節因子，其在調控蛋白質翻譯及細胞凋亡方面均有重要作用[4-5]。在各種應激狀態下DAP5的表達增加，通過調控部分凋亡相關蛋白的翻譯來發揮其抑制凋亡的作用[6-8]，以維持細胞正常的生理功能。在慶大霉素誘導的腎小管上皮細胞凋亡過程中DAP5所發生的變化至今未見報道。本實驗在體外觀察慶大霉素誘導的人腎小管上皮細胞凋亡模型中DAP5表達的變化，以期進一步闡明慶大霉素的腎毒性機制，并尋找有效的對抗腎毒性的治療手段。

1 材料與方法

1.1 實驗材料及儀器 人腎小管上皮細胞(HK2)購于美國菌種保藏中心(ATCC)。培養條件為45% DMEM+45% F12+10%胎牛血清，37℃，5%CO2。硫酸慶大霉素(gentamicin)溶液購于美國Sigma公司；DMEM、F12培養基購于美國Gibco公司，胎牛血清、Mede1.680型Mic130platereader(美國Bio Rad公司)；DU800型Speetropho.tometer(美國Beckman Coulter公司)。

1.2 凋亡細胞DNA片段的檢測 將慶大霉素溶液(終濃度3.2mg/ml)與處于對數生長期的HK2細胞分別共同培養12、24、48、72h，以不加慶大霉素溶液進行培養24h的細胞作為陰性對照。經胰蛋白酶消化細胞后收集細胞，按天根生化科技(北京)有限公司基因組DAN提取試劑盒說明書提取細胞DNA，在加有EB的1.2%的瓊脂糖凝膠上電泳后，在紫外燈下觀察并攝影。

1.3 流式細胞儀檢測細胞凋亡率 收集3×105個細胞，加入6孔板中，培養24h細胞貼壁后，棄去培養液，用無血清的培養集同步培養12h后，分別加入正常培養液及3.2mg/ml慶大霉素溶液的培養液，繼續培養24、48、72h后終止培養。收集細胞用PBS清洗2遍，以70%乙醇溶液固定4h以上，離心棄去固定液，3ml PBS重懸5min，500～1000r/min離心5min，棄去PBS，加入FITC標記的Annexin-V，室溫4℃避光30min，再加入PI，避光反應5min，加入適量Buffer，上流式細胞儀測定10 000個細胞的細胞凋亡率。實驗重復3次。

1.4 Western blotting法檢測Akt、p-Akt及DAP5的表達 細胞接種于6孔板中培養24h后，移去原有培養液，加入含3.2mg/ml慶大霉素的培養液，分別培養12、24、48、72h后終止培養。以不加慶大霉素培養24h作為空白對照。經胰蛋白酶消化后收集細胞，加入RIPA裂解液(1ml 1×RIPA+1μl leupeptin+1μl aprotinin+10μl PMSF)裂解細胞，冰浴30min，在4℃下12 000r/min離心30min。用BCA法測定細胞蛋白濃度后加入RIPA配成等濃度等體積，加入等體積2×SDS，100℃煮沸5min蛋白變性，冰浴10min。經聚丙烯酰胺凝膠電泳，100V電泳4h后轉移至醋酸纖維素膜，轉膜電流50mA，時間2h。以脫脂奶粉封閉1h，分別加入DAP5(1:200)、Akt(1:800)、p-Akt(1:300)及β-actin(1:1000)一抗，4℃過夜，TBST充分洗膜，加入對應二抗，室溫下孵育1h，TBST洗膜，加熒光液后于暗室顯影。

1.5 Western blotting檢測雷帕霉素(rapamicin)作用后DAP5的表達 細胞接種于6孔板中培養24h后，移去原有培養液，分別設立正常對照組、慶大霉素組(3.2mg/ml gentamicin)、慶大霉素+雷帕霉素組(3.2mg/ml gentamicin+1ng/ml rapamicin)，培養72h后終止培養。余消化細胞，提取蛋白，Western blotting法檢測DAP5，方法同1.4。

1.6 統計學處理 采用SPSS 17.0 軟件進行分析。所有數據均用表示，多組間比較采用單因素方差分析檢驗，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 瓊脂糖凝膠電泳檢測結果 對照組細胞基因組DNA經瓊脂糖電泳后未見不同大小片段的DNA梯形條帶，僅見距離加樣孔不遠的一條大分子基因組DNA條帶；而以3.2mg/ml的慶大霉素干預24h后細胞DNA電泳均呈現出特征性梯形條帶，大小為180～200bp的不同條帶，其中48～72h時的細胞DNA條帶較多，也較為清晰。表明凋亡細胞隨時間而增加(圖1)。

2.2 細胞凋亡檢測結果 應用流式細胞儀分析慶大霉素干預后的HK2細胞的凋亡率，可觀察到隨時間的延長，Annexin V染色陽性細胞增多，表明凋亡率增加(P<0.05，圖2)，24、36、72h的凋亡率分別為5.9%、23.0%和49.9%。

2.3 Western blotting法檢測DAP5及Akt的表達 用3.2mg/ml慶大霉素干預HK2細胞后，細胞中p-Akt及DAP5蛋白表達的檢測如圖3A，應用β-actin作為內參照，對兩者的比值進行統計分析，結果表明隨時間延長，p-Akt表達增加，DAP5/p97表達下降。同時發現，隨時間的延長，DAP5/p86逐漸出現且表達增加，證實在慶大霉素的作用下，DAP5/p97裂解為DAP5/p86，且隨時間的延長而增加(圖3B)。

圖1 DNA瓊脂糖凝膠電泳檢測HK2細胞凋亡Fig.1 Detection of HK2 apoptosis by DNA agarose gel electrophoresis1. Control; 2. 24h; 3. 48h; 4. 72h; M. Molecule marker

2.4 雷帕霉素對DAP5蛋白表達的影響 雷帕霉素+慶大霉素組與慶大霉素組比較，DAP5/p97表達明顯增加(P<0.05)，DAP5/p86表達明顯下降(P<0.05)。雷帕霉素+慶大霉素組與正常組比較差異無統計學意義(圖4)。

圖2 慶大霉素處理不同時間細胞凋亡的變化Fig.2 HK2 apoptosis after gentamicin treatment (flow cytometry)(1)P<0.05 compared with control group; (2)P<0.05 compared with 24h group; (3)P<0.05 compared with 36h group

圖3 慶大霉素處理不同時間DAP5及Akt的表達變化Fig.3 Expressions of DAP5 and Akt after gentamicin treatment (Western blotting)A. Western blotting; B. Quantitative analysis; (1)P<0.05, (2)P<0.01 compared with 0h group; (3)P<0.05 compared with 24h group; (4)P<0.01 compared with 24h group

圖4 雷帕霉素作用后各組DAP5蛋白表達的Western blotting檢測結果Fig.4 Expression of DAP5 after rapamycin treatment (Western blotting)A. Western blotting; B. Quantitative analysis; (1)P<0.05 compared with control group

3 討 論

慶大霉素的腎毒性已受到廣泛關注，但其機制尚未完全闡明，目前有線粒體損傷、溶酶體損傷和氧自由基損傷等學說。有研究證實，腎小管上皮細胞在應激狀態下可通過多條途徑發生凋亡[9]。接受小劑量慶大霉素治療的大鼠近曲小管上皮細胞可發生明顯的凋亡而無壞死的發生，且凋亡程度與用藥劑量間呈線性關系[10]。

本研究以人近端腎小管上皮細胞HK2為研究對象，將慶大霉素刺激后的細胞DNA行瓊脂糖凝膠電泳可觀察到細胞凋亡的特異性“梯形”DNA條帶，反映了細胞核內核酸內切酶作用的結果。流式細胞儀檢測發現凋亡率隨慶大霉素作用時間的延長而增加。上述結果證實慶大霉素的腎毒性是部分通過誘導小管上皮細胞凋亡而實現的。

DAP5為eIF4G翻譯起始因子家族中的一員，分子量為97kD，故又名p97。真核生物蛋白質的翻譯起始有賴于eIF4G結合eIF4A和eIF4E形成起始復合物eIF4F。其中eIF4A的結合位點位于eIF4G的中部及C末端；eIF4E的結合位點在eIF4G的N末端；eIF4G中部還包涵一個eIF3結合位點，eIF4G和eIF3的相互作用能募集40S核糖體亞單位。因DAP5擁有類似于eIF4G羧基端的eIF4A及eIF3結合位點，因此能競爭性抑制eIF4G與eIF4A和eIF3的結合；但又不能與eIF4E結合，因此無法使eIF4E與mRNA帽狀結構結合，因此，其可抑制起始翻譯復合物的形成，阻斷蛋白質的翻譯。另一方面，除經典的依賴帽子結構的翻譯途徑外，真核生物中同時也存在另一條稱為經內部核糖體進入位點(Internal Ribosome Entry Site，IRES)的翻譯途徑。這一途徑在IRES反式作用因子的協助下能夠直接啟動翻譯，而不需要翻譯起始復合物的形成。目前發現的IRES反式作用因子有DAP5、PTB、hnRNPK等[11]。這一翻譯途徑在正常情況下受到嚴密的調控，而在輻射、缺氧、凋亡、休克及氨基酸饑餓等對生存不利的條件下，即使依賴帽狀結構的翻譯途徑受阻甚至關閉，經IRES途徑介導的翻譯仍能進行，從而維系細胞的基本生理功能[12-13]。

隨著研究的不斷深入，人們發現在凋亡環境中DAP5/p97可裂解掉C末端成為86kD的蛋白DAP5/ p86，這一過程是由Caspase對p97氨基酸790位點進行裂解來完成的[14]。DAP5/p86可與某些特殊mRNA的IRES元件結合，使其可在經典翻譯途徑受抑的情況下，仍可通過IRES途徑翻譯合成，因此這一IRES元件被稱為“death IRESes”。這類mRNA目前發現的有：Apaf-1、c-myc、XIAP及HIAP2 mRNAs[13,15-16]。這些作用元件在凋亡過程中發揮著不同的作用。另外，DAP5也可經IRES途徑促進自身mRNA的翻譯，形成正反饋環路，擴大其在IRES途徑中的作用。全長的DAP5/p97對IRES翻譯途徑卻無調控作用，這進一步證實DAP5在凋亡因素的作用下，裂解后形成有功能的翻譯調控因子DAP5/ p86，進而增強IRES翻譯途徑的效率[17]。這與我們的研究結果是相同的。

本研究觀察了在慶大霉素誘導的腎小管上皮細胞凋亡過程中，DAP5/p97裂解成為DAP5/p86，并隨時間的延長生成量逐漸增加。通過本研究推測DAP5/p86可能是作為一種代償機制來抑制慶大霉素誘導的凋亡。有研究證實DAP5在三氧化二砷(ATO)誘導的急性粒細胞白血病細胞凋亡時表達增加，用雷帕霉素抑制Akt/mTOR途徑可使DAP5的表達增加，故而認為PI3K/Akt/mTOR途徑可抑制DAP5的活性[18]。本研究結果也發現在慶大霉素誘導的HK2凋亡中p-Akt表達增加，p-Akt作為PI3K/ Akt/mTOR通路的代表之一，其表達增加可表明PI3K/Akt/mTOR通路激活。PI3K/Akt/mTOR通路是調控細胞內蛋白總量合成的主要信號通路，其激活與DAP5的裂解相似，可抑制凋亡過程中的蛋白合成下降，從而發揮抑制凋亡的作用。本研究還發現應用雷帕霉素抑制PI3K/Akt/mTOR通路后，DAP5/ p97裂解為DAP5/p86減少。表明DAP5的活化裂解功能是通過PI3K/Akt/mTOR途徑調控的，兩者可共同發揮抑制凋亡的作用。

綜上所述，本結果表明，在慶大霉素誘導的細胞凋亡過程中，DAP5/p97可代償性激活而發揮抑制凋亡的作用，這一作用可能是通過PI3K/Akt/ mTOR途徑來完成的。

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Expression of DAP-5 in HK2 cell apoptosis induced by gentamicin

GAO Jian-jun1, GU Zhao-yan2, XU Yong-xing1, LIANG Bo-ran1, WEI Jia-mei1, GAO Yue-hua1, NA Yu1*1Department of Nephrology, 306 Hospital of Chinese PLA, Beijing 100101, China
2Healthcare Department, Hainan Branch of Chinese PLA General Hospital, Sanya, Hainan 572000, China
*< class="emphasis_italic">Corresponding author, E-mail: nayu306@163.com

, E-mail: nayu306@163.com
This work was supported by the National Natural Science Foundation of China (81300265), and Army Medical Science Youth Development Project (13QNP088)

ObjectiveTo reproduce a model of gentamicin induced apoptosis of human kidney epithelial cell (HK2), to observe the expression of death-associated protein 5 (DAP5) in HK2 cells, and to explore the relationship between PI3K/Akt/ mTOR signal pathway and DAP5.MethodsHK2 cells were cultured with 3.2mg/ml gentamicin. Cell apoptosis was determined by DNA agarose gel electrophoresis, the apoptotic rate was determined with flow cytometry. Protein expressions of DAP5, Akt and p-Akt were assessed with Western blotting. Rapamycin was used to block PI3K/Akt/mTOR signal pathway in HK2 cell apoptosis model, and the change in DAP5 expression was observed.ResultsHK2 apoptosis appeared 24h after gentamicin treatment, and the apoptotic rate was found to be increased with the prolongation of gentamicin treatment. The apoptotic rates were 5.9%, 23.0% and 49.9%, respectively, at 24h, 36h and 72h after gentamicin treatment (P<0.05). At the same time, lysis of DAP5 protein occurred to form DAP5/p86, and the expressions of DAP5/p86 and p-Akt protein were also upregulated gradually in the process (P<0.05). However, generation of DAP5/p86 was reduced when PI3K/Akt/mTOR signal pathway was blocked by rapamycin during this period (P<0.05).ConclusionGentamicin may induce apoptosis of HK2 cell in time-dependent manner. During the process of apoptosis of HK2 cells, lysis of DAP5 may occur to form DAP5/p86, and PI3K/Akt/mTOR signal pathway may positively regulate the expression of DAP5.

gentamicin; apoptosis; death-associated protein 5; kidney epithelial cell

R595.3

A

0577-7402(2015)11-0906-05

10.11855/j.issn.0577-7402.2015.11.10

2015-03-10；

2015-08-14)

(責任編輯：張小利)

國家自然科學基金(81300265)；全軍醫學科技青年培育項目(13QNP088)

高建軍，醫學碩士，主治醫師。主要從事藥物性腎損害方面的研究

100101 北京 解放軍306醫院腎內科(高建軍、許永星、梁勃然、韋加美、高月花、那宇)；572000 海南三亞 解放軍總醫院海南分院保健科(谷昭艷)

那宇，E-mail：nayu306@163.com