骨質疏松綿羊腰椎內不同椎弓根螺釘界面的顯微CT研究

劉達，謝慶云，鄭偉，康夏，張波，權毅，周江軍，雷偉，潘顯明

·基礎研究·

骨質疏松綿羊腰椎內不同椎弓根螺釘界面的顯微CT研究

劉達，謝慶云，鄭偉，康夏，張波，權毅，周江軍，雷偉，潘顯明

目的通過顯微CT技術比較骨質疏松綿羊腰椎內可膨脹椎弓根螺釘(EPS)與骨水泥強化螺釘(PMMA-PS)的界面情況。方法健康成年雌性綿羊8只，成功建立骨質疏松模型后將每只綿羊的腰椎(L1-L6)隨機分為3個不同置釘組(采用相同的方法制備釘道)，普通椎弓根螺釘(CPS)組經釘道向椎體內擰入CPS，PMMA-PS組在擰入CPS之前向釘道內注入骨水泥(PMMA)1.0ml，EPS組經釘道向椎體內擰入EPS。分別于術后6周和12周處死綿羊，對螺釘及周圍骨組織進行顯微CT掃描，通過三維重建和骨組織計量學方法評價釘道界面情況。結果術后6周和12周時CPS組和EPS組中骨小梁與螺釘直接接觸，形成了“釘-骨”界面，PMMA-PS組中螺釘被PMMA嚴密包裹，形成了“釘-PMMA-骨”界面。EPS組螺釘的前段脹開形成“爪狀”結構，擠壓并顯著改善了周圍骨質的質量。從術后6周到12周，CPS組和PMMA-PS組中螺釘周圍的骨質質量無明顯變化，未見PMMA降解吸收，PMMA-PS組中形成了二次界面。術后12周時EPS膨脹部分周圍的骨質條件較術后6周有顯著提高，形成了良好的“釘-骨”界面。結論在骨質疏松綿羊腰椎內，EPS通過膨脹擠壓刺激周圍骨質生長，在術后早期顯著提高了局部骨質的質量，隨著擠壓應力的持續存在，局部骨質質量在后期進一步改善，形成了良好的生物性界面，為螺釘的遠期穩定提供了良好的骨質基礎。

骨質疏松；椎弓根螺釘；聚甲基丙烯酸；腰椎；顯微CT

目前，椎弓根螺釘系統已經廣泛用于治療脊柱骨折、畸形及退行性疾病[1-3]，但骨質疏松時椎弓根螺釘的固定強度明顯降低，嚴重影響預后。為有效增強骨質疏松條件下螺釘的把持力，本課題組前期設計了可膨脹的椎弓根螺釘(expansive pedicle screw，EPS)，可顯著提高螺釘的固定強度[4-8]，且不增加螺釘在椎弓根內的長度和直徑，能有效降低因改進螺釘設計帶來的諸多風險。大量研究顯示，縱然傳統的骨水泥(polymethylmethacrylate，PMMA)存在許多不足，但憑借其出色的力學強度和強化作用，目前仍被用于強化螺釘的穩定性[8-11]。釘道界面情況是螺釘穩定固定的前提條件，特別是在體內，釘道界面的變化直接決定了螺釘等內固定的動態穩定性和遠期穩定性。因此，對于椎弓根螺釘釘道界面的研究有助于深入了解螺釘在體內穩定的機制。目前，有關EPS和PMMA強化螺釘(polymethylmethacrylate-augmented pedicle screw，PMMA-PS)界面的優劣，國內外研究甚少。本研究旨在通過顯微CT三維重建和骨組織計量學方法評價不同椎弓根螺釘在骨質疏松綿羊腰椎中釘道界面的微觀情況，以期為進一步研究其在體內穩定的機制提供依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料及儀器 普通椎弓根螺釘(conventional pedicle screw，CPS)長度20.0mm，直徑4.5mm(圖1A)。EPS長度20.0mm，直徑4.5mm，中央空腔直徑1.0mm。螺釘前半段有一縱向裂隙，通過中央空腔將內栓插入螺釘后使螺釘的前段膨脹(圖1B、C)。CPS 64枚，EPS(含配套內栓、壓棒和頂絲)32枚，所有螺釘均由醫用鈦合金制成，由山東樞法模-威高骨科醫療器械公司提供。PMMA(天津合成材料工業研究所生產)用于強化螺釘。雙能X線吸收骨密度儀(Lunar Corp，Madison，WI，USA)由成都軍區總醫院內分泌科提供。eXplore Locus SP 型Micro-CT(Healthcare，GE，USA)由西京醫院全軍骨科研究所提供。

1.2 動物及模型建立 健康成年雌性綿羊8只，體重55.7±5.6kg，年齡5.5±0.7歲，均已過生育哺乳期，由成都軍區總醫院實驗動物中心提供。所有涉及動物實驗的操作均嚴格遵守國家及成都軍區總醫院關于動物實驗的醫學倫理學規定。采用速眠新(0.1ml/kg)麻醉成功后，取俯臥位測量綿羊去勢前腰椎的骨密度(bone mineral density，BMD)，然后對所有綿羊行雙側卵巢切除術。術前半小時及術后肌注頭孢唑啉鈉1.0g，2次/d，共3d。術后1個月開始肌注甲潑尼龍0.45mg/(kg.d)，連續注射9個月后逐漸減量至停止(共10個月)，觀察1個月無不良反應后再次測量綿羊腰椎BMD，下降>25%時確定為脊柱骨質疏松動物模型建立成功[12]。

圖1 普通椎弓根螺釘(CPS)和膨脹式椎弓根螺釘(EPS) Fig. 1 The conventional pedicle screw and expansive pedicle screw of vertebral archA. Conventional pedicle screw (CPS); B. Components of expansive pedicle screw (EPS), including EPS, bolt, rod and nut; C. Assembled EPS

1.3 實驗方法 骨質疏松綿羊取俯臥位，速眠新0.1ml/kg肌內注射麻醉成功后，沿腰部正中切口逐層切開，分離顯露腰椎(L1-L6)的椎板及橫突。采用人字嵴頂點法確定進釘點，與棘突成40°角方向制備釘道，深度為20mm。透視確定定位針位置良好。每只綿羊的L1-L6隨機分入3個不同的置釘組。CPS組：經釘道向椎體內直接擰入CPS；PMMA-PS組：向釘道注入PMMA(1.0ml)后再擰入CPS；EPS組：經釘道向椎體內直接擰入EPS。依次縫合切口。圍術期給予頭孢唑啉鈉預防感染。密切觀察術后動物生命體征、飲食、雙下肢活動及切口愈合情況。術后6周和12周隨機處死4只綿羊，取出帶有螺釘的腰椎，游離成單個椎體。每個腰椎隨機選擇一側椎弓根螺釘進行釘道的顯微CT三維重建和骨組織計量學分析。

1.4 顯微CT三維重建 用特制的環鉆沿螺釘的長軸鉆取以螺釘為中心、直徑約1.5cm的圓柱狀標本。在44mm_tube_21μm_270min_ss條件下對螺釘及周圍的骨質進行顯微CT掃描和重建，觀察各組中的釘道界面情況。掃描和重建條件：分辨率21μm，旋轉角度200°，旋轉角度增量0.5°，電壓80kV，電流80μA，曝光時間2960ms，幀平均數6，像素組合為1×1；黑白掃描校正；Hounsfeild刻度校正；重建條紋標準化校正軟件，Micro View三維重建處理軟件(GE Healthcare，USA)。

1.5 骨組織計量學分析 取CPS組和EPS組中螺釘周圍相同位置、相同體積的區域為感興趣區域(RIO，圖2)，設定重建閾值為1000，進行骨計量學分析。數據庫產生的主要參數包括：①組織骨密度(tissue mineral density，TMD)，即單位體積內高于設定界值的骨量，以mg/cm3表示；②骨體積分數(bone volume fraction，BVF)，即骨小梁的體積(BV)除以ROI的體積(TV)，以百分比(%)表示；③骨表面積體積比(bone surface/bone volume，BS/BV)，即骨小梁的表面積(BS)除以骨的體積(BV)，以mm–1表示；④骨小梁厚度(trabecular thickness，Tb.Th)，以μm表示；⑤骨小梁數目(trabecular number，Tb.N)，以mm–1表示；⑥骨小梁間隙(trabecular spacing，Tb.Sp)，以μm表示。

圖2 CPS和EPS周圍骨組織計量學分析Fig. 2 Histomorphometric analysis of bone tissue around CPS and EPSA. CPS; B. EPS. The yellow region is region of interest (ROI)

1.6 統計學處理 采用SPSS 16.0軟件進行數據分析。計量資料以表示，處理前后綿羊腰椎BMD的比較采用配對t檢驗，同組中兩時間點間及兩組間釘道周圍骨計量學參數的比較采用獨立樣本t檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 大體觀察 麻醉清醒后綿羊可站立，術后第2天可自行行走。術后飲食、雙下肢活動及切口情況均未見明顯異常。術后2周切口甲級愈合，予以拆線。術后未見脊髓、神經壓迫癥狀。

2.2 綿羊腰椎BMD 建模前后綿羊腰椎的BMD分別為1.14±0.10g/cm2和0.83±0.07g/cm2，差異有統計學意義(P<0.05)，建模后BMD平均下降27.2%，表明骨質疏松綿羊模型建立成功。

2.3 顯微CT三維重建 顯微CT三維重建清楚地顯示了各組中螺釘界面的情況。在術后6周和12周時，CPS組中骨小梁直接與螺釘表面接觸，釘骨之間形成了“釘-骨”界面(圖3A、圖4A)；PMMA-PS組中，螺釘被PMMA嚴密包裹，PMMA存在于釘骨之間及釘道周圍的骨髓腔內，阻礙了骨小梁與螺釘的直接接觸，釘骨之間形成了“釘-PMMA-骨”界面(圖3B、圖4B)；EPS組中，骨小梁直接與螺釘表面接觸形成了“釘-骨”界面，螺釘的前端明顯膨脹，擠壓并刺激局部骨小梁生長，使螺釘前段周圍骨質的質量較CPS組有顯著改善(圖3C、圖4C)。肉眼觀察，CPS組和PMMA-PS組中螺釘周圍的骨質質量(骨小梁數量和密度)在術后6周和12周時均未見明顯差異，PMMA-PS組螺釘周圍的PMMA未見明顯降解吸收，而術后12周時EPS膨脹部分周圍的骨質質量較術后6周有明顯改善。

圖3 術后6周釘道界面的micro-CT三維重建結果Fig. 3 3D micro-CT reconstruction of interface between bone and screw 6-week post-operationA, B and C. CPS group, PMMA-PS group and EPS group, respectively. Brown, green and white color represent bone trabecula, screw and PMMA, respectively. (Resolution 21μm, 2048×2048)

2.4 骨組織計量學分析 術后6周和12周時EPS組螺釘前段周圍骨小梁的TMD、BVF、Tb.Th和Tb.N均明顯高于CPS組，而BS/BV和Tb.Sp明顯低于CPS組，差異有統計學意義(P<0.05)。術后12周時CPS組的TMD、BVF、Tb.Th和Tb.N與術后6周比較有不同程度提高，而BS/BV和Tb.Sp與術后6周比較出現不同程度降低，但差異均無統計學意義(P>0.05)。術后12周時EPS組的TMD、BVF、Tb.Th和Tb.N均明顯高于術后6周時，Tb.Sp明顯低于術后6周時，差異有統計學意義(P<0.05)，而BS/BV與術后6周時比較差異無統計學意義(P>0.05，表1)。

圖4 術后12周釘道界面的micro-CT三維重建結果Fig. 4 3D micro-CT reconstruction of interface between bone and screw 12-week post-operationA, B and C. CPS group, PMMA-PS group and EPS group, respectively. Brown, green and white color represent bone trabecula, screw and PMMA, respectively. (Resolution 21μm, 2048×2048)

3 討 論

為了避免因增加螺釘直徑和長度導致的諸多風險，本課題組前期研制出了前段可膨脹的椎弓根螺釘(EPS)。體外生物力學實驗證實，與USS、Tenor、CDH等普通螺釘相比，EPS的穩定性分別提高48.4%、40.8%和25.3%[4]，且在骨質疏松尸體腰椎中的穩定性接近傳統的PMMA強化方法[5]。在骨質疏松綿羊體內進行的力學研究顯示，EPS可顯著提高骨質疏松綿羊腰椎椎弓根螺釘的穩定性，達到了與目前臨床上常用的PMMA強化方法近似的固定效果，且隨著時間延長，EPS的穩定性顯著提高[8]。然而，螺釘的穩定性取決于釘道界面的強度，體內釘道界面的動態變化直接影響螺釘在體內的穩定性，目前國內尚無有關動物體內EPS與PMMA-PS釘道界面情況的比較研究。因此，為了進一步探索螺釘穩定的微觀機制，本研究在骨質疏松綿羊體內比較了EPS與PMMA-PS釘道界面的微觀結構。

表1 釘道周圍骨小梁計量學分析(±s，n=8)Tab. 1 Histomorphometric analysis of bone tissue around screw (x±s, n=8)

表1 釘道周圍骨小梁計量學分析(±s，n=8)Tab. 1 Histomorphometric analysis of bone tissue around screw (x±s, n=8)

(1)P<0.05 compared with CPS group; (2)P<0.05 compared with 6-week

12-week CPS group EPS group CPS group EPS group TMD(mg/cm3) 387.46±40.74 447.83±43.13(1) 423.43±46.89 506.06±50.27(1)(2)BVF(%) 44.05±7.46 57.05±8.37(1) 51.92±8.24 67.55±9.40(1)(2)BS/BV(mm–1) 15.02±3.51 11.01±2.31(1) 12.05±2.71 8.90±1.82(1)Tb.Th(μm) 153.84±25.68 227.85±38.27(1) 184.57±36.96 276.24±48.19(1)(2)Tb.N(mm–1) 2.11±0.22 2.53±0.28(1) 2.35±0.29 2.90±0.34(1)(2)Tb.Sp(μm) 281.18±39.09 234.37±30.73(1) 257.18±34.45 201.25±25.61(1)(2)Parameters 6-week

顯微CT技術自問世以來，憑借較高的分辨率在骨組織微觀結構研究中得到了廣泛應用。顯微CT可對骨組織進行精細的三維平掃及立體重建，分辨率可達微米水平，同時它還能準確地測量骨組織形態計量學定量參數，如骨小梁厚度、骨小梁數量、骨小梁間隙、組織骨密度等[13]，從而可以更客觀、準確、全面地反映標本的骨質質量[14-15]。顯微CT還可根據不同材料的密度進行多種成分的三維重建疊加，進一步觀察多種成分物質之間的相互關系，也便于觀察內固定與周圍骨組織的整合情況。Aldini等[16]應用該技術對釘道周圍的骨質進行骨組織計量學分析發現，骨質疏松綿羊腰椎內螺釘周圍的骨小梁厚度和骨小梁體積分數明顯低于正常綿羊。本課題組在動物體內實驗中通過三維重建和骨計量學分析發現，硫酸鈣骨水泥可以促進釘道周圍的骨質生長，改善螺釘與周圍骨質的接觸，形成了更為優化的“釘-骨”界面[17]。

目前顯微CT技術已經成為內固定界面研究的主要方法之一。前期研究中本課題組設計出用于綿羊腰椎的小型EPS和CPS，并在離體綿羊腰椎標本中進行了實驗，結果顯示，EPS前段膨脹擠壓周圍的骨質，增加了局部的骨質密度，形成了早期的“機械性穩定”，顯著提高了螺釘的縱向和橫向穩定性，而在離體標本中EPS形成的“釘-骨”界面明顯優于PMMA-PS形成的“釘-PMMA-骨”界面[6-7]。基于上述研究，本實驗進一步在骨質疏松綿羊腰椎內動態觀察和比較了EPS和PMMA-PS的釘骨界面情況，結果顯示，EPS前段脹開的兩瓣擠壓局部骨質并刺激骨小梁生長，改善了螺釘局部的骨質質量(骨小梁數量和骨小梁密度)，在術后6周和12周兩個時間點均明顯優于CPS前段周圍的骨質質量。同時，由于EPS的前段持續擠壓周圍骨質，隨著時間延長，EPS膨脹部分周圍的骨小梁數量及骨小梁空間排列明顯改善，后期(術后12周時)EPS前段周圍的骨質質量和釘骨界面情況較術后早期(6周時)均有明顯提高。此外，術后12周EPS局部骨小梁的TMD、Tb.Th、Tb.N和BVF均明顯高于術后6周，而Tb.Sp明顯低于術后6周；術后12周EPS前段周圍骨組織的質量較術后6周明顯提高，這為螺釘的遠期穩定性提供了良好的骨質環境。CPS則不存在這方面的優勢，從術后6～12周螺釘局部的骨質質量并無明顯改變。EPS前段周圍骨質質量和微觀結構的變化，進一步解釋了前期力學實驗的結果，即EPS螺釘的穩定性在術后6周和12周時均明顯高于CPS，且隨著時間延長，EPS螺釘的穩定性也有進一步提高，而CPS螺釘無明顯變化。

PMMA-PS組中螺釘被PMMA嚴密包裹，PMMA存在于螺釘周圍的骨小梁間隙中，提高了局部的組織密度。然而，從術后6周到12周，螺釘周圍的PMMA未見明顯降解、吸收，PMMA存留于釘骨之間阻礙了骨小梁與螺釘的直接接觸，難以形成釘骨之間的生物性整合，形成了二次界面，為螺釘的遠期穩定性埋下了隱患。由于PMMA與周圍骨小梁呈犬牙交錯的狀態，很難用密度分割法將兩者完全單獨重建，這可能嚴重影響骨計量學分析，所以本研究未對PMMA-PS周圍的骨組織進行計量學分析和比較研究。另外，考慮到標本的非同一性，本研究未對螺釘穩定性與釘道骨組織計量學參數進行相關性分析。

綜上所述，本研究結果表明，在骨質疏松綿羊腰椎內，EPS通過膨脹擠壓刺激周圍骨質生長，在術后早期明顯提高了局部的骨質質量，隨著擠壓應力的持續存在，局部的骨質質量在后期進一步改善，形成了良好的生物性界面，為螺釘的遠期穩定提供了良好的骨質基礎。

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Comparison of interfaces of different pedicle screws with micro-CT technique in lumbar vertebrae with osteoporosis of sheep

LIU Da1, XIE Qing-yun1, ZHENG Wei1, KANG Xia1, ZHANG Bo1, QUAN Yi1, ZHOU Jiang-jun2, LEI Wei3*, PAN Xianming1*1Department of Orthopedics, General Hospital of Chengdu Command, Chengdu 610083, China
2Department of Orthopedics, 184 Hospital of PLA, Yingtan, Jiangxi 335000, China
3Department of Orthopedics, Xijing Hospital, Fourth Military Medical University, Xi’an 710032, China
*< class="emphasis_italic">Corresponding authors. PAN Xian-ming, E-mail: xianmingpan@163.com; LEI Wei, E-mail: leiweispine@163.com

s. PAN Xian-ming, E-mail: xianmingpan@163.com; LEI Wei, E-mail: leiweispine@163.com
This work was supported by the National Natural Science Foundation of China (81301606), and the Foundation of the General Hospital of Chengdu Command (2013YG-B015)

ObjectiveTo compare the changes in interfaces of expandable pedicle screw (EPS) and polymethylmethacrylateenhanced pedicle screw (PMMA-PS) after being used in osteoporotic sheep lumbar vertebrae with micro-CT technique.MethodsSix lumbar vertebrae (L1-L6) in each sheep were randomly divided into three different screw-insertion groups (two vertebrae with four pedicles in each group) after reproduction of osteoporosis in sheep. After making the pilot hole using the same method, CPS was inserted through the pilot hole into vertebral body in CPS group, while PMMA (1.0ml) was injected into the pilot hole prior to the insertion of CPS in PMMA-PS group, and EPS was inserted through pedicle into vertebral body in EPS group. All the sheep were sacrificed, and lumbar vertebrae (L1-L6) were harvested respectively at the 6- and 12-week postoperatively. The micro-CT three dimensional reconstruction and histomorphometric analysis were performed to evaluate the interfacial conditions.ResultsIt was clearly demonstrated that interface was formed where the bone trabeculae was directly in contact with the screw to form "screw-bone" interface in both CPS and EPS groups both 6 weeks and 12 weeks after the operation. The screw was fully surrounded by PMMA and formed "screw-PMMA-bone" interface in PMMA-PS group. The anterior part of EPS expanded in vertebral body to form a clawlike structure, pressing against the surrounding bone trabeculae, thus significantly improved the local bone quality(amount and density of bone trabeculae). From 6 weeks to 12 weeks after the operation, there was no visual difference in bone quality around the screw in both CPS and PMMA-PS groups. There was no degradation and absorption of PMMA, and it led to form the second non-biological interface in PMMA-PS group. Nevertheless, bone quality around expanding part of EPS at 12-week post-operation was significantly improved compared with that at 6-week post-operation, thus forming a good "screw-bone" interface.ConclusionsEPS can improve the bone quality around the anterior part of screw through expanding compression in early stage in lumbar vertebrae of osteoporotic sheep. With a continuous compression stress in anterior part of EPS, it may result in a significant improvement in the local bone quality in late stage by forming a good biological interface, thus providing a good osseous foundation for long-term stability.

osteoporosis; pedicle screw; polymethylmethacrylate; lumbar vertebrae; micro-CT

R681.4

A

0577-7402(2015)07-0535-05

10.11855/j.issn.0577-7402.2015.07.05

2014-11-25；

2015-06-08)

(責任編輯：胡全兵)

國家自然科學基金青年基金(81301606)；成都軍區總醫院院管課題(2013YG-B015)

劉達，醫學博士，主治醫師。主要從事脊柱外科的基礎與臨床研究

610083 成都 成都軍區總醫院骨科(劉達、謝慶云、鄭偉、康夏、張波、權毅、潘顯明)；335000 江西鷹潭 解放軍184醫院骨科(周江軍)；710032 西安 第四軍醫大學西京醫院骨科(雷偉)

潘顯明，E-mail：xianmingpan@163.com；雷偉，E-mail：leiweispine@163.com