真核起始因子(eIF6)對M2型巨噬細胞炎性介質表達的影響

文帥，胡曉紅，張小容，黃勇，賀偉峰，羅高興，吳軍

真核起始因子(eIF6)對M2型巨噬細胞炎性介質表達的影響

文帥，胡曉紅，張小容，黃勇，賀偉峰，羅高興，吳軍

目的探討真核細胞起始因子(eIF6)基因對M2型巨噬細胞纖維化相關因子分泌及重要蛋白酶表達的影響。方法采用eIF6野生型(eIF6+/+)及敲降型(eIF6+/-)C57BL/6雄性小鼠，腹腔灌洗獲得巨噬細胞，通過白介素4(IL-4)誘導形成M2型巨噬細胞。應用基因芯片比較eIF6+/+與eIF6+/-小鼠M2型巨噬細胞基因表達譜的差異，并通過RT-PCR及ELISA對芯片檢測結果進行驗證。結果基因芯片檢測結果顯示，與eIF6+/-小鼠組比，eIF6+/+小鼠M2型巨噬細胞中血管內皮生長因子(VEGF)及金屬蛋白酶抑制劑2(TIMP-2)基因表達顯著下調，基質金屬蛋白酶2(MMP-2)基因表達顯著上調。RT-PCR及ELISA檢測結果顯示，與eIF6+/-小鼠相比，eIF6+/+小鼠M2型巨噬細胞中VEGF、TIMP-2 mRNA及蛋白表達水平明顯下降(P<0.05)，而MMP-2 mRNA及蛋白表達水平明顯上升(P<0.05)。結論eIF6可能通過抑制VEGF生成而防止血管及肉芽組織過度增生，同時通過調節MMP-2/TIMP-2的比例以平衡細胞外基質的降解與沉積，從而緩解瘢痕形成。

真核細胞起始因子6；巨噬細胞；纖維化

瘢痕形成(纖維化)是傷口或創面自然愈合過程中的一種正常的、必然的生理反應，但它嚴重影響患者的生活質量，是臨床上急需解決的難題之一。在創面愈合及纖維化過程中，巨噬細胞發揮了重要作用[1]。Lucas等[2]研究發現，清除巨噬細胞后創面肉芽組織顯著減少，再上皮化過程受阻，創面愈合延遲。Sindrilaru等[3]將創面巨噬細胞分離后進行培養發現，在創面修復過程中巨噬細胞對創面局部不同的微環境刺激可產生不同的表型。巨噬細胞在整個創面愈合過程中均表達經典激活(classic activation)型(M1型)和選擇性激活(alternative activation)型(M2型)表面標記，其中在炎癥反應早期主要是M1型，在修復期主要是M2型[4-5]。M2型巨噬細胞被認為是一種促纖維化細胞，可分泌大量的細胞因子激活成纖維細胞向肌成纖維細胞轉化，導致肉芽組織增生、細胞外基質(ECM)沉積，進而促進瘢痕形成[6]。

真核細胞起始因子6(eukaryotic initiation factor-6，eIF6)可對真核生物的翻譯起始階段進行調控。在細胞核內，eIF6與核糖體60s亞基結合，抑制核糖體80s亞基形成[7]。蛋白翻譯起始階段，作為真核起始因子的eIF6在CK1-PKC作用下發生磷酸化，從核糖體60s亞基解聚下來，促進40s亞基和60s亞基結合形成80s亞基，從而啟動蛋白質的翻譯[8]。實驗室前期實驗比較了eIF6+/+與eIF6+/-小鼠創面愈合情況，結果發現eIF6+/-小鼠創面肉芽組織、膠原明顯增多，提示eIF6對皮膚纖維化具有抑制作用(結果尚未發表)。但eIF6通過何種機制對巨噬細胞產生作用，進而影響創面愈合及瘢痕形成目前尚未見報道。本研究通過基因芯片技術對eIF6+/+與eIF6+/-小鼠M2型巨噬細胞基因表達譜進行比較，尋找相關基因。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及主要試劑 eIF6野生型(eIF6+/+)及敲降型(eIF6+/-)C57BL/6雄性小鼠(8～10周齡，體重15～20g)。細胞培養基RPMI 1640、胎牛血清購于Gibco公司，小鼠重組白介素4(IL-4)購于R&D公司，anti-F4/80-Percp、anti-CD11b-FITC、anti-Cd11c-PE、anti-CD206 (MR)-FITC、anti-CD16/32購于三箭公司，RNeasy Mini kit購于Qiagen公司，反轉錄試劑盒AMV3.0購于大連TaKaRa公司，基因芯片(Affymetrix GeneChip Mouse Gene 1.0 ST Array)購于Affymetrix公司，檢測由英濰捷基(上海)貿易有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 腹腔巨噬細胞培養 小鼠引頸處死，75%乙醇消毒后打開腹腔，用10ml預冷的RPMI 1640培養基反復灌洗腹腔。收集灌洗液于無菌離心管中(置冰上)，4℃下1000r/min離心10min獲得細胞沉淀，用2ml RPMI 1640培養基(含10%胎牛血清)重懸，接種于6孔板中，每孔5×106個細胞。細胞培養箱中培養12h，洗去未貼壁細胞，獲得的貼壁細胞即為巨噬細胞[9]。流式細胞儀檢測顯示F4/80、CD11b雙陽性細胞比例達94%(圖1f)。刺激組加入IL-4(40ng/ml)刺激24h，獲得M2型巨噬細胞，未刺激組加等量PBS，余培養條件一致。

1.2.2 巨噬細胞純度檢測 將培養的巨噬細胞用0.5%胰酶消化計數，5×105個/管，PBS洗1次，100μl PBS重懸，加入1μl anti-CD16/32孵育10min，阻斷Fc受體，再加入1μl anti-F4/80-Percp和1μl anti-CD11b-FITC室溫孵育30min，1ml PBS洗去游離抗體后，用0.3ml PBS重懸，Attune流式細胞儀(ABI公司)檢測細胞表面F4/80、CD11b的表達。

1.2.3 M2型巨噬細胞表面標記檢測 將刺激后的巨噬細胞用0.5%胰酶消化計數，5×105個/管，PBS洗1次，100μl PBS重懸，加入1μl anti-CD16/32 孵育10min，阻斷Fc受體，再加入anti-F4/80-Percp、anti-CD11c-PE、anti-CD206(MR)-FITC各1μl室溫孵育30min，1ml PBS洗去游離抗體后，用0.3ml PBS重懸，Attune流式細胞儀(ABI公司)檢測細胞表面F4/80、CD11c、CD206的表達。

1.2.4 基因芯片檢測 分別取來自eIF6+/+與eIF6+/-小鼠的M2巨噬細胞，抽提RNA，行基因芯片檢測，重復3次。具體信息見http://www.affymetrix. com。

1.2.5 實時熒光定量PCR(RT-PCR)檢測 應用RNeasy Mini kit試劑盒提取巨噬細胞總RNA，進行反轉錄和RT-PCR反應，檢測轉化生長因子-β1(TGF-β1)、精氨酸酶1(arginase-1)、基質金屬蛋白酶2(MMP-2)、金屬蛋白酶抑制劑2(TIMP-2)、血管內皮生長因子(VEGF)。引物由上海生工生物有限公司合成，序列如下：GAPDH正義3'-GGGGAAGGTGAAGGTCGGAGTC-5'，反義3'-TCGCTCCTGGAAGATGGTGATG-5'；TGF-β1正義3'-TGGAAACCCACAACGAAATCTATGA-5'，反義3'-TGGAAACCCACAACGAAATCTATGA-5'；精氨酸酶1正義3'-CTCCAAGCCAAAGTCCTTAGAG-5'，反義3'-GGAGCTGTCATTAGGGACATCA-5'；MMP-2正義3'-ACCTGAACACTTTCTATGGCTG-5'，反義3'-CTTCCGCATGGTCTCGATG-5'；TIMP-2正義3'-GCAACCCCATCAAGAGGATTC-5'，反義3'-GGGGCCGTGTAGATAAACTCG-5'；VEGF正義3'-GCCAGACAGGGTTGCCATAC-5'，反義3'-GGAGTGGGATGGATGATGTCAG-5'。以GAPDH作為內參照，結果以2-ΔΔCt法表示。實驗均重復3次。

1.2.6 ELISA檢測 收集IL-4刺激24h后的巨噬細胞培養上清，采用VEGF、MMP-2、TIMP-2、ELISA試劑盒(武漢博士德公司)檢測VEGF、MMP-2、TIMP-2的表達，具體操作按試劑盒說明書進行。實驗均重復3次。

1.3 統計學處理 采用SPSS 13.0軟件進行統計分析，數據結果以表示，組間比較采用t檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 M2型巨噬細胞表面分子表達及純度檢測 巨噬細胞經IL-4刺激24h后，其形態發生明顯改變，樹枝狀分支減少，細胞逐漸變圓，且折光性下降。流式細胞儀檢測發現，與未刺激組比較，IL-4刺激組CD206表達明顯增強，而CD11c表達無明顯改變(圖1G、H)。所獲M2巨噬細胞純度為72.9%(圖1E)。

圖1 巨噬細胞純度及M2表面標志物檢測情況Fig. 1 Purity of macrophage and expression of M2 macrophage surface markers

2.2 M2型巨噬細胞功能檢測 在體外培養條件下，參照經典方法以IL-4刺激巨噬細胞24h誘導形成M2型巨噬細胞[10]。RT-PCR檢測顯示，經IL-4刺激后，eIF6+/+與eIF6+/-小鼠巨噬細胞精氨酸酶1、TGF-β1的表達均明顯上升(P<0.05，圖2)。

2.3 基因芯片檢測 通過基因芯片對eIF6+/+及eIF6+/-小鼠的M2巨噬細胞基因表達譜進行檢測，最終篩選出1716個差異表達基因，其中與eIF6+/+小鼠比較，在eIF6+/-小鼠M2巨噬細胞中下調的基因有851個，上調的基因有865個(圖3)。與eIF6+/-相比，eIF6野生型小鼠M2巨噬細胞中纖維化相關基因VEGF顯著下調(eIF6+/+/eIF6+/-=0.75，P<0.05)、MMP-2顯著上調(eIF6+/+/eIF6+/-=1.3，P<0.05)、TIMP-2顯著下調(eIF6+/+/eIF6+/-=0.65，P<0.05)，其他與創面愈合及纖維化相關的細胞因子如表皮生長因子(EGF)、TGF-β1、成纖維細胞生長因子(FGF)、血小板衍生因子(PDGF)等差異無統計學意義(數據未列出)。

2.4 RT-PCR驗證芯片檢測結果 RT-PCR檢測顯示，與eIF6+/-小鼠相比，eIF6+/+小鼠M2巨噬細胞中VEGF、TIMP-2表達下降(P<0.05)，MMP-2表達上升(P<0.05)，與基因芯片結果吻合(圖4)，而EGF、TGF-β1、FGF、PDGF等兩組之間表達差異無統計學意義(數據未列出)。

圖2 M2巨噬細胞中精氨酸酶1、TGF-β1的表達(RT-PCR)Fig. 2 Expression of arginase-1 and TGF-β1in M2 macrophages (RT-PCR)

圖3 芯片檢測色碼圖Fig. 3 The cluster of gene chip

圖4 M2巨噬細胞中TIMP-2、MMP-2和VEGF mRNA(RT-PCR)及蛋白(ELISA)的表達Fig. 4 Expression of TIMP-2, MMP-2 and VEGF mRNA (RT-PCR) and protein (ELISA) in M2 macrophages

2.5 ELISA驗證芯片檢測結果 分別收集eIF6+/+與eIF6+/-M2巨噬細胞培養上清。ELISA檢測結果顯示，與eIF6+/-小鼠相比，eIF6+/+小鼠M2巨噬細胞中VEGF、TIMP-2表達明顯下降(P<0.05)，MMP-2表達明顯上升(P<0.05，圖4)，與基因芯片結果吻合。

3 討 論

eIF6是一種具有抑制纖維化作用的基因，但其作用機制尚不明確，而巨噬細胞在創面愈合及纖維化過程中具有重要作用，為此本研究觀察了eIF6對巨噬細胞的作用，旨在探討其影響纖維化過程的具體機制。

巨噬細胞作為一種具有可塑性的多功能細胞群體，可分泌大量細胞因子激活成纖維細胞，同時能調節MMP-2/TIMP-2的平衡，參與ECM的代謝[11]。在體外培養條件下，采用Th2型細胞因子(IL-4、IL-13)可誘導產生M2型巨噬細胞[5-6]。細胞膜蛋白表達的差異是鑒定不同類型巨噬細胞的重要方法。文獻報道F4/80+CD11c–CD206+的巨噬細胞為M2型巨噬細胞[12-13]。M2巨噬細胞能表達精氨酸酶1，參與精氨酸酶代謝，介導其損傷修復功能，另外還能分泌抗炎因子(IL-10、TGF-β1等)[14]。本實驗通過分離腹腔巨噬細胞，加入IL-4(40ng/ml)刺激24h獲得M2型巨噬細胞，應用流式細胞技術及RT-PCR對其標志物進行檢測，發現CD206、精氨酸酶1、TGF-β1的表達與創面中M2型巨噬細胞一致[5]。

肉芽組織主要由成纖維細胞、炎性細胞、新生血管、ECM等組成[15]，在創面愈合前期可填補創面缺損并促進創面愈合，最終轉變為瘢痕組織，因此肉芽組織的多少決定了后期瘢痕的嚴重程度[16]。血管生成對肉芽組織的形成具有重要作用[17]。VEGF的一個重要功能就是促進血管內皮細胞的遷移和增殖，加快創面中血管的形成[18-19]，而巨噬細胞能夠分泌VEGF，啟動血管生成[20]。研究顯示，在增生性瘢痕中有大量微血管形成，同時VEGF的表達也明顯上升[21]。另外有研究發現抑制VEGF能通過PI3K-Akt信號通路阻斷TGF-β1產生，從而抑制肺纖維化的形成[22]。上述研究表明VEGF在瘢痕形成及纖維化過程發揮重要作用。本研究結果顯示，與eIF6+/-小鼠比較，eIF6+/+小鼠M2型巨噬細胞中VEGF的表達明顯下降，表明eIF6能抑制巨噬細胞中VEGF的產生，從而減少血管生成，影響瘢痕組織的形成。

瘢痕的另一個重要特征就是大量ECM沉積，ECM的代謝受基質金屬蛋白酶(MMPs)的調節。MMPs是一類能夠降解ECM的蛋白質，其中MMP-2又稱明膠酶，是MMPs家族成員之一，在ECM重塑中具有重要作用[23]，能水解Ⅰ/Ⅳ/Ⅴ型膠原、纖連蛋白、層粘連蛋白等ECM成分[24-25]。TIMPs為MMPs的特異性抑制因子，能與MMPs的鋅離子活性中心結合，形成MMP-TIMP復合物，從而阻斷MMP與底物結合，MMPs與TIMPs間的平衡是影響組織修復、新生表皮細胞爬行的重要影響因素。本研究觀察了MMP-2與TIMP-2之間的比例，結果顯示，與eIF6+/-小鼠相比，eIF6+/+小鼠M2巨噬細胞中MMP-2表達上升而TIMP-2表達下降，提示eIF6能調節MMP-2/TIMP-2之間的平衡，加快ECM的代謝，減少ECM沉積，減輕纖維化程度。

綜上所述，本研究結果顯示，eIF6能抑制VEGF產生，防止血管及肉芽組織過度增生，同時調節MMP-2/TIMP-2的平衡，促進ECM降解，減少ECM沉積，減輕纖維化(瘢痕)程度。eIF6作為一種新發現的抑纖維化基因，對其功能進行研究可能為減輕瘢痕形成及纖維化提供新的途徑。

[1] Ploeger DT, Hosper NA, Schipper M,et al. Cell plasticity in wound healing: paracrine factorsof M1/M2 polarized macrophages influence thephenotypical state of dermal fibroblasts[J]. Cell Commun Signal, 2013, 11(1): 29.

[2] Lucas T, Waisman A, Ranjan R,et al. Differential roles of macrophages in diverse phases of skin repair[J]. J Immunol, 2010, 184(7): 3964-3977.

[3] Sindrilaru A, Peters T, Wieschalka S,et al. An unrestrained proinflammatory M1 macrophage population induced by iron impairs wound healing in humans and mice[J]. J Clin Invest, 2011, 121(3): 985-987.

[4] Mantovani A, Biswas SK, Galdiero MR,et al. Macrophage plasticity and polarization in tissue repair and remodelling[J]. J Pathol, 2012, 229(2): 176-185.

[5] Daley JM, Brancato SK, Thomay AA,et al. The phenotype of murine wound macrophages[J]. J Leukoc Biol, 2010, 87(1): 59-67.

[6] Sindrilaru A, Scharffetter-Kochanek K. Disclosure of the culprits: macrophages-versatile regulators of wound healing[J]. Adv Wound Care (New Rochelle), 2013, 2(7): 357-368.

[7] Miluzio A, Beugnet A, Volta V,et al. Eukaryotic initiation factor 6 mediates a continuum between 60S ribosome biogenesis and translation[J]. EMBO Rep, 2009, 10(5): 459-465.

[8] Ceci M, Gaviraghi C, Gorrini C,et al. Release of eIF6 (p27BBP) from the 60S subunit allows 80S ribosome assembly[J]. Nature, 2003, 426(6966): 579-584.

[9] Ray A, Dittel BN. Isolation of mouse peritoneal cavity cells[J]. J Vis Exp, 2010, (35): 1488.

[10] Raes G, De Baetselier P, No?l W,et al. Differential expression of FIZZ1 and Ym1 in alternatively versus classically activated macrophages[J]. J Leukoc Biol, 2002, 71(4): 597-602.

[11] Nishimura S, Manabe I, Nagasaki M,et al. CD8+effector T cells contribute to macrophage recruitment and adipose tissue inflammation in obesity[J]. Nat Med, 2009, 15(8): 914-920.

[12] Lee S, Huen S, Nishio H,et al. Distinct macrophage phenotypes contribute to kidney injury and repair[J]. J Am Soc Nephrol, 2011, 22(2): 317-326.

[13] Gordon S. Alternative activation of macrophages[J]. Nat Rev Immunol, 2003, 3(1): 23-35.

[14] Wynn TA, Barron L. Macrophages: master regulators of inflammation and fibrosis[J]. Semin Liver Dis, 2010, 30(3):245-257.

[15] Gautam MK, Purohit V, Agarwal M,et al.In vivohealing potential of Aegle marmelos in excision, incision, and dead space wound models[J]. Sci World J, 2014, 2014: 740107.

[16] Li L, Lv KY, Wu GS,et al. Advances in research on mechanisms of the effect of negative pressure wound treatment in wound healing[J]. Med J Chin PLA, 2014, 39(8): 664-668. [李磊, 呂開陽, 伍國勝, 等. 負壓創傷治療促進創面修復的作用機制研究進展[J]. 解放軍醫學雜志, 2014, 39(8): 664-668.]

[17] Rajkumar VS, Shiwen X, Bostrom M,et al. Platelet-derived growth factor-beta receptor activation is essential for fibroblast and pericyte recruitment during cutaneous wound healing[J]. Am J Pathol, 2006, 169(6): 2254-2265.

[18] Mori R, Tanaka K, de Kerckhove M,et al. Reduced FOXO1 Accelerates skin wound healing and attenuates scarring[J]. Am J Pathol, 2014, 184(9): 2465-2479.

[19] Senger DR, Ledbetter SR, Claffey KP,et al. Stimulation of endothelial cell migration by vascular permeability factor/ vascular endothelial growth factor through cooperative mechanisms involving the alphavbeta3 integrin, osteopontin, and thrombin[J]. Am J Pathol, 1996, 149(1): 293-305.

[20] Goto F, Goto K, Weindel K,et al. Synergistic effects of vascular endothelial growth factor and basic fibroblast growth factor on the proliferation and cord formation of bovine capillary endothelial cells within collagen gels[J]. Lab Invest, 1993, 69(5): 508-517.

[21] Chun Q, Zhiyong W, Fei S,et al. Dynamic biological changes in fibroblasts during hypertrophic scar formation and regression[J]. Int Wound J, 2014 [Epub ahead of print].

[22] Shin IS, Shin HK, Kim JC,et al. Role of Klotho, an antiaging protein, in pulmonary fibrosis[J]. Arch Toxicol, 2014 [Epub ahead of print].

[23] Swiderski RE, Dencoff JE, Floerchinger CS,et al. Differential expression of extracellular matrix remodeling genes in a murine model of bleomycin-induced pulmonary fibrosis[J]. Am J Pathol, 1998, 152(3): 821-828.

[24] McCawley LJ, Matrisian LM. Matrix metalloproteinases: they're not just for matrix anymore[J]! Curr Opin Cell Biol, 2001, 13(5): 534-540.

[25] Shen W, Li LB, Lu JY. Role of TGF-β, MMPs and TIMPs in persistent atrial fibrillation associated with rheumatic mitral stenosis[J]. Med J Chin PLA, 2014, 39(8):614-617. [盛煒, 李力兵, 陸江陽. TGF-β、MMPs和TIMPs在風濕性心臟病二尖瓣狹窄合并持續性房顫中的作用[J]. 解放軍醫學雜志, 2014, 39(8): 614-617.]

Effects of eIF6 on the expression of pro-inflammatory mediators derived from M2 macrophages

WEN Shuai, HU Xiao-hong, ZHANG Xiao-rong, HUANG Yong, HE Wei-feng, LUO Gao-xing, WU Jun*
Institute of Burn Research, Southwest Hospital, Third Military Medical University, Chongqing, 400038, China

*Corresponding author, E-mail: junwupro@126.com

This work was supported by the National High Technology Research and Development Program of China (863 Program) (2012AA020504), and the National Natural Science Foundation of China (81372082)

ObjectiveTo explore the effects of eukaryotic translation initiation factor 6 (eIF6) on the expression of fibrotic cytokines and metabolic enzymes derived from M2 macrophages.MethodseIF6 wild type mice (eIF6+/+) and eIF6 knock out mice (eIF6+/-) were used. Macrophages were collected from peritoneal lavage fluid, and they were stimulated with IL-4 for enrichment of M2 macrophages. The differential gene expressions of eIF6+/+and eIF6+/-M2 macrophages were studied with gene chip. The differential expression of genes was further confirmed with both RT-PCR and ELISA.ResultsThe gene chip showed that the expressions of VEGF and TIMP-2 were down-regulated in eIF6+/+macrophages compared with those in eIF6+/-M2 macrophages, while the expression of MMP-2 was up-regulated in eIF6+/+M2 macrophages (P<0.05). The result of RT-PCR and ELISA had confirmed that the RNA and protein expressions of VEGF and TIMP-2 were decreased in eIF6+/+macrophages compared with those in eIF6+/-M2 macrophages, while the RNA and protein expressions of MMP-2 were up-regulated in eIF6+/+M2 macrophages (P<0.05).ConclusioneIF6 not only inhibits the expression of VEGF, reduces angiogenesis and granulation tissue formation, but also enhances the extracellular matrix degradation and deposition by regulating the balance of MMP2/TIMP2, and thus attenuating the degree of fibrosis (scar formation).

eukaryotic initiation factor-6; macrophages; fibrosis

R644

A

0577-7402(2015)02-0104-06

10.11855/j.issn.0577-7402.2015.02.04

2014-11-05；

2015-01-18)

(責任編輯：胡全兵)

國家高技術研究發展計劃(8 6 3計劃)項目(2012AA020504)；國家自然科學基金(81372082)

文帥，醫學碩士。主要從事燒傷創面愈合與瘢痕方面的研究

400038 重慶 第三軍醫大學西南醫院全軍燒傷研究所(文帥、胡曉紅、張小容、黃勇、賀偉峰、羅高興、吳軍)

吳軍，E-mail：junwupro@126.com