HBsAg陰性患者HBV隱匿性感染：110例臨床分析

袁琴，伍春霞，劉飛飛，羅旗，劉何蕾，李成敏，鄭潔，羅舒文，張聰，曾愛中

我國是乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)感染的高流行區，普通人群感染率高達75.8%[1-3]。多數HBV感染并無明顯臨床表現，血清乙型肝炎表面抗原(HBsAg)陽性是HBV感染的重要依據。一直以來，HBsAg轉陰及抗-HBs的出現被認為是HBV清除和乙肝痊愈的臨床標志。但隨著高靈敏PCR的應用，大量研究表明，血清HBsAg陰性個體，血清和(或)肝組織HBV DNA可持續低水平存在[4-5]。這種狀態被定義為隱匿性乙型肝炎病毒感染(occult hepatitis B virus infection，OBI)[6]，其血清學模式可表現為抗-HBs﹑抗-HBc和(或)抗-HBe陽性，也可表現為血清學標志物均為陰性。

OBI可見于一般健康人群﹑獻血員﹑血液透析患者及處于免疫抑制狀態的人群，也可見于HBV感染恢復人群及各種慢性肝病患者。OBI不僅可以潛在性地增加輸血﹑移植﹑透析等感染HBV的風險[4,7]，導致免疫抑制群體HBV再激活[8]，還可能引起慢性肝損傷﹑肝硬化﹑原發性肝癌等，尤其是在合并丙型肝炎的情況下[9-10]。我國是HBV高流行區，為避免上述情況發生，不可能將所有HBsAg陰性個體進行高靈敏PCR檢測。因此，了解OBI的流行狀況，探討HBV隱匿性感染的臨床特點，對臨床實踐有重要的指導意義。

1 資料與方法

1.1 研究對象 選取2012年3月－2014年1月于重慶醫科大學附屬第一醫院就診，并經酶聯免疫吸附劑測定(檢測值下限為0.04U/ml)為HBsAg陰性，熒光定量PCR檢測HBV DNA定量＜103U/ml的住院及門診患者110例。納入的患者既往均無急或慢性乙肝病毒感染。

1.2 方法

1.2.1 HBV DNA提取 留取入選患者清晨空腹靜脈血4ml，置于臺式離心機中離心(3000r/min×15min)，將上清置于－70℃冰箱中保存。采用高純度病毒核酸檢測試劑盒(德國Roche Diagnostics GmbH公司)提取血清HBV DNA，操作按說明書步驟進行。

1.2.2 引物設計及合成 參考國內外文獻[11-12]，在HBV基因組C﹑S及X區保守區段各設計1套巢式引物(表1)，引物由華大基因合成。

1.2.3 巢式PCR擴增 50μl PCR反應體系：雙蒸水18μl，上下游引物各1μl，模板DNA 5μl，Prime STARTMHS(Premix，大連寶生物工程有限公司)25μl。PCR反應條件：94℃ 5min；94℃ 45s﹑55℃ 1min﹑72℃ 90s，循環10次；94℃ 45s﹑53℃1min﹑72℃ 90s，循環15次；72℃ 7min。以第1輪PCR產物為第2輪PCR模板，反應條件：94℃5min；94℃ 45s﹑57℃ 1min﹑72℃ 90s，循環10次；94℃ 45s﹑55℃ 1min﹑72℃ 90s，循環25次；72℃7min。以雙蒸水及血清HBV DNA定量＞103U/ml的慢性乙肝患者血清分別作為陰性和陽性對照。第2次PCR反應結束后，行2%瓊脂糖凝膠電泳，采用凝膠成像分析系統成像。以2個或以上區段同時陽性判定為OBI。

表1 HBV基因組C﹑S﹑X區巢式PCR引物Tab.1 Nested PCR primers of HBV C, S, X

1.3 OBI發生率比較 將入選病例分成≤40﹑41～60﹑≥61歲3個年齡段，比較不同性別﹑年齡段﹑血清學模式[單獨抗-HBc(+)及抗-HBs(+)/抗-HBc(±)]患者，以及不同病因肝損害患者的OBI發生率。

1.4 統計學處理 采用SPSS 19.0軟件進行分析，計量資料兩個獨立樣本的均數比較采用t檢驗，計數資料的構成比比較采用c2檢驗及Fisher精確檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 巢式PCR擴增結果 部分患者C區﹑B區及X區擴增結果如圖1所示，C﹑S﹑X區擴增產物電泳條帶大小分別為693﹑439和108bp。

2.2 入選患者基本特征比較 入選患者110例，男女構成比3:2，年齡50.2±13.8歲，其中男性48.9±13.2歲，女性52.2±14.5歲，二者差異無統計學意義(P=0.217)。將入選病例分成≤40﹑41～60﹑≥61歲3個年齡段，各年齡段分別占總人數的21.8%﹑54.6%和23.6%，差異亦無統計學意義(P=0.450)。

2.3 OBI發生率比較 110例入選者共檢測出26例OBI，發生率23.6%。不同性別﹑年齡段﹑血清學模式[單獨抗-HBc(+)及抗-HBs(+)/抗-HBc(±)]患者的OBI發生率差異無統計學意義。肝功能異常患者OBI發生率明顯高于肝功能正常者，兩者之間差異有統計學意義(P=0.003，表2)。

2.4 不同病因所致肝損害的OBI發生率比較 57例肝功能異常者中，29例為不明原因肝損害，其OBI發生率為31.0%(9/29)。其余28例肝損害患者包括丙肝病毒感染6例，戊肝病毒感染3例，飲酒者6例，使用藥物者7例，自身免疫疾病患者6例，OBI檢出例數分別為3﹑1﹑3﹑2﹑2例，OBI發生率為39.3%(11/28)。原因不明的肝損害與不同病因所致肝損害之間OBI發生率差異無統計學意義(P=0.585)。

圖1 部分患者PCR電泳圖Fig.1 The electropherogram of PCR in part of cases

表2 不同組間OBI發生率比較Tab.2 Distribution of OBI in different groups

3 討 論

我國普通人群乙肝病毒感染率高達75.8%，是OBI流行的基礎。自1978年首次報道OBI[13]后，有關OBI的報道屢見不鮮。所報道的HBsAg陰性獻血員﹑隱源性慢性肝炎﹑原發性肝細胞癌﹑慢性丙型肝炎患者中，OBI的發生率分別為1%～10%﹑11%～19%﹑12%～61%﹑1%～95%[14-15]。本研究運用針對HBV DNA C﹑S﹑X 3個區段的巢式PCR對110例血清標本進行擴增，最終檢出26例OBI，陽性率23.6%。本研究的OBI陽性率明顯高于獻血人群，其主要原因可能與本研究大多數研究對象有肝臟疾病有關，另外，HBV流行性的差異，人口學特征的不同，敏感性及特異性的檢測方法也會造成結果的不同。本研究經對數據進一步分析發現，不同性別及不同年齡段OBI檢出率差異無統計學意義，即OBI檢出率與性別﹑年齡無關，性別及年齡不能作為預測隱匿性感染的因素。

文獻報道單獨抗-HBc(+)可能是隱匿性感染存在的標志[16]，Raimondo等[6]也建議將抗-HBc作為鑒別血清學陽性OBI的一個替代指標。但我們的研究發現，單獨抗-HBc陽性組與其他組OBI的檢出率并無明顯差異。這一結論與國內吳蓓穎等[16]及國外Fatemeh等[5]的研究一致。若將單獨抗-HBc陽性作為隱匿性感染存在的一個預測指標，一方面會導致假陽性率增高，另一方面也會造成抗-HBs﹑抗-HBc陽性這類血清學模式隱匿性感染的漏檢。因此，在不同人群中單獨抗-HBc能否作為血清學陽性隱匿性乙肝感染的一個替代指標有待商榷。

在本研究中，肝功能異常的OBI檢出率明顯高于肝功能正常者，其中合并明確致肝損害因素的OBI發生率高達39.3%，提示OBI更易發生在有基礎肝臟疾病的人群。這可能與合并肝臟損害的個體本身存在免疫功能紊亂而影響了病毒的復制和表達有關；另一方面，有文獻報道，存在嗜肝病毒重疊感染(如HCV)時也可能抑制HBV的復制，導致隱匿性感染更易感[9]。此外，OBI患者肝組織內可長期持續存在低水平HBV DNA復制，肝組織學可表現為持續的輕微炎癥壞死。若在此基礎上合并其他致肝病因子，則可能加重肝臟損害，出現肝炎活動。OBI可能與多種不同的肝臟疾病相關，由于我們的研究樣本量有限，且目前相關臨床資料尚缺乏，有待更多資料予以證實。

值得注意的是，在本研究中不明原因肝損害患者中OBI的發生率為31.0%(9/29)，這與一些研究中不明原因肝損害的OBI檢出率相近，提示盡管HBsAg陰性，但仍存在HBV相關性肝損害的風險，同時也提示在中國這樣的HBV高流行地區，僅通過HBsAg篩查不能除外OBI。目前認為血清或肝組織中HBV DNA是OBI唯一可靠的診斷標志物，但由于肝組織標本難以獲得，血清中提取出HBV DNA也可作為診斷OBI的標準。推薦的HBV DNA提取方法為巢式PCR或實時PCR，但由于其操作過程復雜﹑費用較高，目前尚不能在臨床實踐中普及。因此，一方面需要更多的研究積極尋找不同群體隱匿性感染的相關因素，另一方面有待發掘更簡便有效的HBV檢測方法。

本研究還發現，HBsAg陰性患者OBI檢出率為23.64%，與性別﹑年齡段﹑血清學模式無明顯相關性，存在肝損害的個體更易合并OBI，同時OBI也是不明原因肝損害的病因之一。因此，在不明原因肝病，尤其是病情較重時，可采用高靈敏巢式PCR排除OBI。目前國內外大樣本OBI流行病學報道主要針對獻血人群，但關于不明原因肝病(肝炎﹑肝硬化﹑肝癌)的研究僅限于小樣本﹑回顧性研究，研究結果也大相徑庭，因此有待于更多大樣本﹑隊列研究來證實。OBI涉及臨床多個方面，改進分子生物學檢測技術及方法，提高OBI檢出率具有重要的臨床意義。

[1] Hui CK, Sun J, Au WY. Occult hepatitis B virus infection in hematopoietic stem cell donors in a hepatitis B virus endemic area[J]. J Hepatol, 2005, 42(6): 813-819.

[2] Wang SY, Huang HH, Xu RN, et al. Analysis of cause of death in patients with liver diseases: report of 1890 cases[J]. Med J Chin PLA, 2014, 39(5): 392-395. [王嗣予, 黃輝煌, 徐若男, 等. 肝病患者死亡原因分析:1890例報告[J]. 解放軍醫學雜志,2014, 39(5): 392-395.]

[3] Li XD, Li QH, Li J, et al. Characteristics of HBV subgenotypes in North China and their relationship with the mutation of anti-HBV nucleoside resistant analogs[J]. Med J Chin PLA, 2010,35(6): 629-631+634. [李曉東, 李慶虹, 李進, 等. 華北地區HBV基因亞型特點及其與核苷(酸)類抗HBV藥物耐藥突變的關系[J]. 解放軍醫學雜志, 2010, 35(6): 629-631+634.]

[4] Ghisetti V, Marzano A, Zamboni F, et al. Occult hepatitis B virus infection in HBsAg negative patients undergoing liver transplantation: clinical significance[J]. Liver Transpl, 2004,10(3): 356-362.

[5] Fatemeh AA, Seyed MA, Mehdi N, et al. Prevalence and molecular analysis of occult hepatitis B virus infection isolated in a sample of cryptogenic cirrhosis patients in Iran[J]. Oman Med J, 2014, 29(2): 92-96.

[6] Raimondo G, Allain JP, Brunetto MR, et al. Statements from the Taormina expert meeting on occult hepatitis B virus infection[J]. J Hepatol, 2008, 49(4): 652-657.

[7] Di Stefano M, Volpe A, Stallone G, et al. Occult HBV infection in hemodialysis setting is marked by presence of isolated antibodies to HBcAg and HCV[J]. J Nephrol, 2009, 22(3): 381-386.

[8] Liu HL, Zhao Z, Yang H, et al. The effects of nucleoside analogue prophylactic treatment on HBV activation in HBcAb+patients undergoing immunosuppressive therapy[J]. J Viral Hepat, 2013,20(9): 645-649.

[9] Giovanni S, Rosaria S, Giovanni R. The clinical significance of occult HBV infection[J]. Annal Gastroenterol, 2014, 27(1): 15-19.

[10] Shi Y, Wu YH, Wu W, et al. Association between occult hepatitis B infection and the risk of hepatocellular carcinoma: a metaanalysis[J]. Liver Int, 2012, 32(2): 231-240.

[11] Hassan ZK, Hafez MM, Mansor TM, et al. Occult HBV infection among Egyptian hepatocellular carcinoma patients[J]. Virol J,2011, 8: 90.

[12] Hoofnagh JH, Seef LB, Bales ZB, et al. The type B hepatitis after transfusion with blood containing antibody to hepatitis B core antigen[J]. N Engl J Med, 1978, 298(25): 1379-1383.

[13] Bréchot C, Thiers V, Kremsdorf D, et al. Persistent hepatitis B virus infection in subjects without hepatitis B surface antigen clinically significant or purely "occult"[J]? Hepatology, 2001,34(1): 194-203.

[14] Said ZN. An overview of occult hepatitis B virus infection[J].World J Gastroenterol, 2011, 17(15): 1927-1938.

[15] Ramezani A, Banifazl M, Eslamifar A, et al. Serological pattern of anti-HBc alone infers occult hepatitis B virus infection in highrisk individuals in Iran[J]. Infect Dev Ctries, 2010, 4(10): 658-661.

[16] Wu BY, Cai G, Lin JF, et al. A study on sequence variations in preS/S regions of hepatitis B virus in occult infective patients[J].Chin J Microbiol Immunol, 2011, 31(8): 724-728. [吳蓓穎, 蔡剛, 林佳菲, 等. 隱匿性乙型肝炎患者乙肝病毒preS/S基因突變分析[J]. 中華微生物學和免疫學雜志, 2011, 31(8): 724-728.]