間充質干細胞培養上清輸注對糖尿病大鼠治療作用的機制研究

龐雅平，程愈，郝好杰，劉杰杰，申晶

·基礎研究·

間充質干細胞培養上清輸注對糖尿病大鼠治療作用的機制研究

龐雅平，程愈，郝好杰，劉杰杰，申晶

目的 觀察間充質干細胞(MSCs)培養上清輸注對糖尿病大鼠高血糖紊亂的治療效果，探討MSCs分泌產物促進胰島再生的作用機制。方法 SD大鼠腹腔單次注射大劑量鏈脲佐菌素(STZ，65mg/kg)建立糖尿病大鼠模型，將誘導成功的30只糖尿病大鼠隨機分為MSCs培養上清治療組(CM，n=15)、培養基治療組(M，n=15)，分別輸注MSCs培養上清、培養基。另將15只正常大鼠作為對照組。連續治療3d后每日測血糖，于治療第7天測定血清胰島素及C肽，并行腹腔糖耐量檢查(IPGTT)。對動物胰腺組織標本行多重免疫熒光染色，觀察MSCs上清治療后胰島β細胞再生情況，并進一步探究胰島細胞再生的可能機制。結果 與M組比較，治療早期(<7d)CM組糖尿病大鼠血糖降低，血清胰島素及C肽含量明顯增加(P<0.05)。IPGTT結果顯示，CM組較M組糖尿病大鼠胰島功能明顯增強。胰腺組織多重免疫熒光染色提示，CM組糖尿病大鼠的胰島內β細胞數量較M組明顯增加(P<0.05)，但仍少于對照組；β細胞增殖率較M組及對照組均顯著提高(P<0.01)。結論 MSCs分泌產物通過促進胰島β細胞增殖，促進胰腺再生，恢復胰島功能，可用于早期糖尿病的控制與治療。

間質干細胞；胰島；再生；胰島素分泌細胞

間充質干細胞(MSCs)是一類具有自我復制和多向分化潛能的成體干細胞，在多種疾病中參與受損組織的修復與再生，如心肌梗死[1]、急性腎損傷[2]、創傷[3]等。臨床數據顯示[4]，MSCs輸注能降低糖尿病患者的血糖水平，顯著減少外源性胰島素用量。此外，在糖尿病動物模型中，MSCs的系統輸注可明顯提高β細胞質量，升高體內胰島素水平，有效改善高血糖狀態[5-6]。盡管MSCs治療為治愈糖尿病帶來了希望，但關于細胞治療的安全性尚存在很大爭議，制約了干細胞治療的推廣應用。與此同時越來越多的學者發現，MSCs的分泌效應在其促進組織損傷再生修復的過程中發揮了重要作用[7-10]。本課題組前期研究發現，輸注MSCs上清在一定程度上可起到類似干細胞本身輸注的作用，達到促進糖尿病大鼠胰島再生、改善高糖狀態的效果，但與細胞本身輸注治療相比在療效上仍存在很大差距，且其促β細胞再生的具體機制尚未明確[6]。本實驗旨在對MSCs上清液進行濃縮以增強治療效應，同時對MSCs分泌產物促進胰島β細胞再生的機制進行初步研究。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、主要試劑及儀器 8周齡雄性SD大鼠(SPF級)50只，體重200～220g，購自解放軍總醫院醫學實驗動物中心(動物合格證號：11400700074794)。L-DMEM、FBS(Hyclone，美國)；KO血清、熒光二抗(Invitrogen，美國)；0.25%胰蛋白酶(Gibco，美國)；Glucagon抗體(1/1500)、Insulin抗體(1/150)、Ki-67(1/30)、H33342核染料(1/2000)、STZ(Sigma，美國)。細胞培養孵箱(Heraeus Sepatech，德國)；臺式小型高速離心機(Eppendorf，德國)；低溫冰凍切片機(Leica，德國)；激光共聚焦顯微鏡(Olympus，日本)；血糖儀(強生，美國)。

1.2 方法

1.2.1 SD大鼠骨髓間充質干細胞(BM-MSCs)分離、培養及培養上清的獲取 雄性，體重100g的正常SD大鼠麻醉后脫頸處死，用含胎牛血清的LDMEM培養基沖出股骨、脛骨的骨髓接種至培養皿，37℃、5% CO2進行原代培養。通過密度梯度離心法和貼壁培養法分離、擴增MSCs，待細胞達90%以上融合時使用胰蛋白酶消化傳代。傳至第3代時更換為KO血清培養基，孵育48h后取培養上清，4℃離心，10倍濃縮待用。

1.2.2 糖尿病模型的制備及分組 35只SD大鼠禁食12h后稱重并經尾靜脈采血測基礎血糖，用檸檬酸緩沖液溶解鏈脲佐菌素(STZ)，按照65mg/kg的劑量單次腹腔注射。第3天起每日9:00-10:00尾靜脈采血測血糖，連續3d血糖值>28mmol/L的大鼠判定為造模成功。將30只成模大鼠隨機分為MSCs培養上清治療組(CM，n=15)、培養基輸注組(M，n=15)。另將15只正常大鼠作為對照組。

1.2.3 MSCs培養上清輸注及血清學指標測定 CM組的糖尿病大鼠經尾靜脈緩慢注入MSCs培養上清濃縮液，2ml/d，連續3d，M組輸注等量MSCs培養基。然后每日尾靜脈采血測血糖，于治療第7天尾靜脈采血檢測血清胰島素及C肽水平，并進行腹腔糖耐量實驗(IPGTT)檢測：各組大鼠在空腹狀態下經腹腔注射葡萄糖(2g/kg)，分別于注射后30、60、90、120min檢測血糖。

1.2.4 胰腺組織標本的制備、切片及免疫熒光染色各組大鼠分別于治療后2、7、15、30d經戊巴比妥鈉麻醉成功后迅速打開胸腔，PBS經主動脈快速灌流，再以4%多聚甲醛固定1.5～2.0h，取胰腺組織放入30%PB蔗糖溶液中脫水，至組織沉底后用包埋劑包埋保存于–80℃。取胰腺(中尾部)組織以5μm厚度連續切片，進行insulin/glucagon、insulin/Ki-67免疫熒光染色。激光共聚焦顯微鏡下觀察并采集圖像。

1.3 統計學處理 采用SPSS 18.0軟件進行分析，所有數據以±s表示，多組間比較采用方差分析，進一步比較采用LSD-t檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 MSCs濃縮上清輸注對STZ誘導的糖尿病大鼠高血糖的改善作用 CM組糖尿病大鼠在治療早期(<7d)血糖水平明顯降低，從30.64±1.99mmol/L降至20.98±1.46mmol/L。M組的糖尿病大鼠為持續高糖狀態，血糖始終維持在30.28±0.75mmol/L，治療前后差異無統計學意義。IPGTT結果顯示，CM組糖尿病大鼠在治療后7d受損胰腺的糖代謝能力明顯改善，且血清胰島素水平及C肽含量較M組明顯增加。但在治療晚期(>7d)大鼠隨機血糖出現逐漸上升趨勢，治療后15d血糖升高至治療前水平(圖1)。

2.2 MSCs濃縮上清輸注對胰島內β細胞數量的影響 insulin/glucagon免疫熒光染色觀察發現，STZ注射后大鼠胰腺內β細胞毀損達95%以上。在治療早期(<7d)，與M組相比，CM組大鼠受損胰島中β細胞數量明顯增多，以治療后2d增加最為明顯，增加約3～5倍，β細胞數于治療后7d開始逐漸減少，至15d時與M組比較差異無統計學意義(圖2)。

2.3 MSCs濃縮上清輸注對胰島β細胞增殖的影響 為明確糖尿病大鼠體內新生β細胞的來源，我們對胰島細胞進行insulin/Ki-67免疫熒光染色，結果顯示：在對照組和M組糖尿病大鼠胰島內幾乎觀察不到Ki-67染色陽性的β細胞，提示成年大鼠胰島內β細胞很少出現增殖，而CM組在治療早期(<7d)胰島β細胞中Ki-67陽性細胞比例(4.0%)與對照組、M組(分別為0.5%、0.14%)相比明顯增加，治療后2d后Ki-67陽性的細胞數量最多，但治療晚期(>7d)Ki-67陽性細胞明顯減少(圖3)。

圖1 MSCs培養上清輸注對STZ誘導的糖尿病大鼠高血糖的改善作用Fig. 1 MSC supernatant infusion ameliorate the STZ-induced hyperglycemia in DM rats

圖2 MSCs濃縮上清輸注對胰島內β細胞的數量的影響(Insulin/glucagon免疫熒光染色)Fig. 2 Effect of infusion of concentrated MSCs supernatant on the number of islet β cells (Insulin/glucagon immunofluorescent staining) Red represents insulin, green represents glucagon; (1)P<0.05, (2)P<0.01

3 討 論

近年來隨著研究深入，MSCs治療糖尿病在臨床試驗和動物研究中均表現出令人興奮的療效，接受干細胞治療的糖尿病個體血糖水平明顯下降，糖耐量異常明顯改善，外源胰島素需要量顯著減少。但細胞治療的具體作用機制極為復雜，回顧文獻，目前已知的機制有：①免疫調節和抗炎作用。MSCs具有特殊的免疫調節功能，通過分泌一系列細胞因子，作用于抗原呈遞細胞、T細胞和自然殺傷細胞等免疫細胞產生免疫抑制[11]。MSCs還可分泌抗炎因子，參與免疫抑制，進而防止炎癥和自身免疫病的發生[12]。②促進胰腺再生。MSCs治療糖尿病的體內外實驗提示，MSCs可活化內源性干、祖細胞向胰島素生成細胞分化[13]，促進非β細胞向β細胞重編程[14]，促進胰島β細胞增殖[15]，以及抑制細胞凋亡[7]，進而實現胰腺再生。而其中MSCs分泌的生長因子，如血管內皮生長因子(VEGF)[16]、胰島素樣生長因子-1(IGF-1)[17]、肝細胞生長因子(HGF)[18]等在促進胰島內血管生成、保護β細胞存活、抗凋亡等多種機制中發揮重要作用。③改善胰島素抵抗。最新研究發現，MSCs輸注可有效改善2型糖尿病大鼠周圍靶組織對胰島素的敏感性[19]。而MSCs分泌的效應因子成纖維細胞生長因子-1(FGF-1)在改善胰島素抵抗中發揮重要作用[20]。綜上所述，雖然MSCs通過多種途徑促進胰腺再生，但究其根本均與其分泌效應密切關聯。

圖3 MSCs培養上清輸注對胰島β細胞增殖的影響(Insulin/Ki-67免疫熒光染色)Fig. 3 Effect of infusion of MSCs supernatant on islet β cell proliferation (Insulin/Ki-67 immunofluorescent staining) Red represents Ki-67, green represents insulin; the arrows indicate the insulin+Ki-67+cells. (1)P<0.01, (2)P<0.01

我們的前期研究證實，對糖尿病大鼠進行直接MSCs上清輸注在一定程度上確實可以促進糖尿病大鼠的胰島再生，但對高血糖的改善并不明顯，推測可能與上清液中有效活性分子的濃度太低，上清去細胞后缺乏持續的因子分泌有關。因此，本實驗對MSCs上清進行適度濃縮結果顯示，MSCs濃縮上清于治療早期可明顯降低糖尿病大鼠的血糖水平，并且給予糖負荷后可刺激胰島素分泌，而對照組無明顯變化，表明MSCs濃縮上清治療使受損的胰島功能得到恢復，盡管這一效應僅僅出現于治療早期(<7d)。此外，單次大劑量STZ腹腔注射可導致胰腺β細胞重度毀損，體內β細胞嚴重不足，而治療早期胰島內β細胞數量較對照組明顯增多，同時伴隨β細胞的顯著增殖，其增殖率達4%～8%，遠遠高于健康成年大鼠的β細胞增殖率(0.5%)[21]。由此推斷MSCs分泌效應可能通過提高胰島β細胞增殖率，從而實現胰島再生，在治療早期可有效改善高血糖狀態。

遺憾的是，本研究發現上述療效僅僅發生于治療早期，隨著時間的推移，糖尿病大鼠血糖逐漸升高至治療前的高糖狀態，且伴隨β細胞數量的顯著減少，β細胞增殖明顯降低。可能原因為：①MSCs上清中效應因子含量有限，且存在一定的半衰期，僅能維持短期療效，長期效果不顯著；②新生β細胞無力抵抗高糖環境的刺激，致新生細胞凋亡[22]；③持續的高糖環境抑制細胞增殖[23]。

總之，MSCs上清于治療早期可促進受損胰島再生，至少部分是通過促進β細胞增殖來實現的。如何提高MSCs上清的療效，延長作用時間，以及對發揮主要療效的細胞因子的鑒別均有待進一步研究。

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Infusion of mesenchymal stem cells culture supernatant ameliorates hyperglycemia disorders in STZ-induced diabetes mellitus rats

PANG Ya-ping1, CHENG Yu2, HAO Hao-jie2, LIU Jie-jie2, SHEN Jing3*1Graduate School of Hebei North University, Zhangjiakou, Hebei 075000, China
2School of Life Science, General Hospital of Chinese PLA, Beijing 100039, China
3Department of Endocrinology, 309 Hospital of Chinese PLA, Beijing 100091, China
*

, E-mail: shenjingshenhua@126.com
This work was supported by the National Natural Science Foundation of China (81200615)

ObjectiveTo evaluate the therapeutic effect of systemic infusion of MSC culture supernatant in STZ-induced diabetic rats, and explore the mechanism of effect of MSC secretion on promoting regeneration of the islet tissues.MethodsThe diabetic animal model was reproduced in 35 SD rats by intraperitoneal injection of a single large dose of streptozotocin (STZ, 65mg/ kg). The 30 successfully induced diabetic rats were randomly divided into MSC culture supernatant infusion group (CM, n=15) and medium infusion group (M, n=15), and in addition, 15 normal rats were used as control. Animals were intravenously transfused with MSC supernatant (CM group) or raw medium (M group), then the contents of blood glucose were determined 3 days after infusion. The serum insulin and C-peptide levels were monitored and the intraperitoneal glucose tolerance test (IPGTT) was performed on the 7th day of infusion to evaluate the therapeutic effect of MSCs supernatant infusion in diabetic rats. Finally, all the experimental animals were sacrificed at indicated time points and the pancreatic tissues were collected for multiple immunofluorescence staining (MIFS), in order to observe the β-cell regeneration after MSCs supernatant infusion, and to further explore the possible mechanism involved in the experiment.ResultsAt the early stage after infusion (<7 days), the blood glucose level declined and the contents of serum insulin and C-peptide increased obviously in CM group as compared with that of M group (P<0.05). IPGTT showed that the islet function was significantly enhanced in CM group compared with M group. MIFS showed that the number of β cells in thedestroyed islets in CM group rats was significantly increased as compared with that of M group rats. In addition, the proliferation rate of β cells was obviously higher in CM group (4%) than in control group (0.5%, P<0.01). ConclusionTreatment with MSCs culture supernatant obviously prompted β cell proliferation in the destroyed islets, resulting in regeneration of the islets with islet function recovery, thus it effectively controls the advance of diabetes.

mesenchymal stem cells; islets of Langerhans; regeneration; insulin-secreting cells

R587.1

A

0577-7402(2015)06-0449-05

10.11855/j.issn.0577-7402.2015.06.05

2015-01-15；

2015-03-23)

(責任編輯：張小利)

國家自然科學基金(81200615)

龐雅平，碩士研究生。主要從事間充質干細胞與糖尿病治療方面的研究

075000 河北張家口 河北北方學院研究生院(龐雅平)；100039 北京 解放軍總醫院生命科學院(程愈、郝好杰、劉杰杰)；100091 北京 解放軍309醫院內分泌科(申晶)

申晶，E-mail：shenjingshenhua@126.com