低劑量γ射線對人淋巴母細(xì)胞CCNG1基因表達(dá)的影響

何穎，沈先榮，錢甜甜，王慶蓉，侯登勇，蔣定文，劉玉明，李珂嫻，陳偉

3 討 論

低劑量γ射線對人淋巴母細(xì)胞CCNG1基因表達(dá)的影響

何穎，沈先榮，錢甜甜，王慶蓉，侯登勇，蔣定文，劉玉明，李珂嫻，陳偉

目的 觀察低劑量γ射線對人淋巴母細(xì)胞(AHH1)細(xì)胞周期蛋白G1(CCNG1)基因表達(dá)的影響，探討CCNG1基因用作低劑量范圍輻射生物劑量計的可能性。方法 采用0、0.1、0.2、0.5、0.8、1.0Gy γ射線照射AHH-1，分別于照射后4、24、48、72、168h提取細(xì)胞總RNA，采用實時熒光定量PCR法檢測AHH-1中CCNG1基因的表達(dá)變化，分析該基因表達(dá)的時間及劑量效應(yīng)關(guān)系。結(jié)果 γ射線照射后AHH-1中CCNG1基因表達(dá)呈劑量依賴性上調(diào)，具有較好的劑量效應(yīng)關(guān)系。時間效應(yīng)曲線表明，CCNG1基因表達(dá)在照射后24h達(dá)峰值，之后開始下降，至168h恢復(fù)至照射前水平。結(jié)論 CCNG1基因在低劑量范圍(0～1.0Gy)具有較好的劑量效應(yīng)和時間效應(yīng)關(guān)系，是一種潛在的低劑量電離輻射生物劑量計。

輻射，電離；輻射劑量；AHH-1細(xì)胞；細(xì)胞周期蛋白G1；基因表達(dá)；生物劑量計

人們在空中旅行、室內(nèi)有氡的居室、太空飛行或低水平的污染區(qū)域均會暴露于低水平的電離輻射[1]。國內(nèi)外放射生物學(xué)家數(shù)十年來一直致力于低水平電離輻射暴露后的生物學(xué)效應(yīng)研究，但目前低劑量電離輻射的危險評估依然是建立在線性無閾假說基礎(chǔ)上的，該假說由高劑量照射外推而來，認(rèn)為低劑量電離輻射的生物效應(yīng)是對健康有害的[2]。但是，職業(yè)和環(huán)境低劑量電離輻射的生物效應(yīng)遠(yuǎn)較線性無閾模型預(yù)測的復(fù)雜[3]，其原因主要與DNA修復(fù)的細(xì)胞反應(yīng)、旁效應(yīng)的細(xì)胞敏感性和延遲的基因組不穩(wěn)定性有關(guān)[4]。目前，關(guān)于低水平電離輻射暴露對人體健康的影響研究較少[5]，低劑量電離輻射的風(fēng)險評估具有重要的社會意義[6]，而深入了解低劑量電離輻射誘導(dǎo)的細(xì)胞反應(yīng)、尋找低劑量電離輻射的生物標(biāo)志物是進(jìn)行正確評估的關(guān)鍵。筆者在前期研究中，采用全基因組表達(dá)譜芯片檢測分析了0、0.1、0.5、1.0Gy γ射線照射4h后，人淋巴母細(xì)胞(AHH-1)基因表達(dá)變化情況，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞周期蛋白G1(cyclin G1，CCNG1)基因表達(dá)隨輻射劑量的增加而上調(diào)[7]。CCNG1是細(xì)胞周期蛋白家族的重要成員，是唯一受腫瘤抑制基因p53調(diào)控的細(xì)胞周期蛋白，對細(xì)胞周期進(jìn)程起負(fù)調(diào)控作用，在細(xì)胞增殖、DNA修復(fù)中發(fā)揮作用，參與細(xì)胞DNA損傷后的G2/M期阻滯及細(xì)胞凋亡[8-10]。本研究選用AHH-1為研究對象，采用實時熒光定量PCR法檢測CCNG1基因在不同低劑量γ射線照射后的表達(dá)水平以及劑量效應(yīng)關(guān)系和時間效應(yīng)關(guān)系，探討其變化規(guī)律及作為低劑量電離輻射生物劑量計的可能性。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株和試劑 AHH-1由第二軍醫(yī)大學(xué)防原醫(yī)學(xué)教研室惠贈，加入含10%胎牛血清的RPMI 1640(Gibco公司)培養(yǎng)基，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。Trizol試劑、M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶為Invitrogen公司產(chǎn)品。SYBR Premix Ex Taq為TaKaRa公司產(chǎn)品。

1.2 照射條件 在復(fù)旦大學(xué)放射醫(yī)學(xué)研究所進(jìn)行照射，照射源為Gamma cell 40，137Cs(NORDION International Inc. Canada)，單次照射，照射劑量分別為0、0.1、0.2、0.5、0.8、1.0Gy(照射劑量率0.162Gy/min)，每個劑量設(shè)3個平行樣品。

1.3 總RNA抽提及cDNA合成 照射后細(xì)胞置于37℃、5%CO2孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)0、4、24、48、72、168h，隨后每組樣品取1×106個細(xì)胞，加1ml Trizol裂解細(xì)胞，提取總RNA，測定RNA濃度和純度，然后行變性瓊脂糖凝膠電泳，檢測RNA純度及完整性。采用Invitrogen公司的M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶對抽提的AHH-1總RNA進(jìn)行cDNA反轉(zhuǎn)錄合成，反轉(zhuǎn)錄總體積為20μl，總RNA為1μg，引物為Oligo(dT)18，具體操作按照產(chǎn)品說明書進(jìn)行。

1.4 引物設(shè)計 根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中的β-actin和CCNG1基因序列，采用Primer Premier 5軟件設(shè)計實時熒光定量PCR的相應(yīng)引物，具體序列見表1。引物由上海捷瑞生物工程有限公司(GENEray)合成。

表1 擴增基因的引物序列Tab. 1 Primer sequence of amplifiable genes

1.5 實時熒光定量PCR 采用SYBR實時熒光定量PCR法，PCR反應(yīng)程序為：95℃ 3min，95℃ 10s，60℃ 30s，共40個循環(huán)。每個樣品重復(fù)做3個平行樣，每次反應(yīng)結(jié)束后進(jìn)行熔解曲線分析，排除非特異性PCR產(chǎn)物的影響。以β-actin為內(nèi)參，同時設(shè)置空白對照組。結(jié)果以2–ΔΔCt表示，變化倍數(shù)2倍以上認(rèn)為有顯著差異。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理 采用MJ Option Monitor Analysis Software V3.1和Excel軟件的線性回歸分析法對結(jié)果進(jìn)行分析。

2 結(jié) 果

2.1 PCR擴增產(chǎn)物特異性驗證 2%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，β-actin和CCNG1基因的PCR擴增產(chǎn)物特異性好，大小與理論值吻合(圖1A)。熔解曲線分析顯示β-actin和CCNG1基因均為單峰(圖1B)。表明上述基因擴增均為特異性擴增。

2.2 低劑量γ射線照射后AHH-1中CCNG1 mRNA表達(dá)的時間效應(yīng) PCR結(jié)果顯示，不同劑量137Cs γ射線照射后，AHH-1細(xì)胞中CCNG1 mRNA的表達(dá)變化趨勢一致，即隨時間推移，CCNG1 mRNA表達(dá)水平不斷增高，在24h時達(dá)到峰值，隨后開始逐漸降低，72h時已接近照射前水平。時間效應(yīng)曲線見圖2。

圖1 PCR反應(yīng)特異性擴增Fig. 1 Specific amplification of PCR reaction

2.3 低劑量γ射線照射后AHH-1中CCNG1 mRNA表達(dá)的劑量效應(yīng) 不同劑量137Cs γ射線照射后，AHH-1中CCNG1 mRNA的表達(dá)水平隨劑量的增加而增加。照射后24h，0.1Gy照射組表達(dá)水平為0Gy組的2.01倍，而0.2Gy照射組為2.35倍，0.5Gy照射組為3.16倍，0.8Gy照射組為3.51倍，1.0Gy照射組為4.32倍，擬合量效關(guān)系回歸曲線方程為y=2.8205x+1.5028，R2=0.9274(圖3)。照射后48h，0.1Gy照射組表達(dá)水平為0Gy組的1.66倍，而0.2Gy照射組為2.11倍，0.5Gy照射組為2.41倍，0.8Gy照射組為2.78倍，1.0Gy照射組為3.32倍，擬合量效關(guān)系回歸曲線方程為y=1.941x+1.373，R2=0.911(圖4)。

圖2 不同劑量γ射線照射后CCNG1 mRNA表達(dá)變化的時間效應(yīng)曲線Fig. 2 Time-effect curve of CCNG1 mRNA expression after irradiation with 0-1.0 Gy γ-rays

圖3 照射后24h時CCNG1 mRNA表達(dá)的劑量-效應(yīng)曲線Fig. 3 The dose-effect curve of CCNG1 mRNA expression at 24h post-irradiation

圖4 照射后48h時CCNG1 mRNA表達(dá)的劑量-效應(yīng)曲線Fig. 4 The dose-effect curve of CCNG1 mRNA expression at 48h post-irradiation

3 討 論

某些基因的表達(dá)水平在電離輻射后會發(fā)生改變，有可能作為生物標(biāo)志物用于受照劑量的估算。目前國內(nèi)外已有眾多相關(guān)研究，但關(guān)于低劑量電離輻射后的轉(zhuǎn)錄水平呈劑量依賴性改變的基因鮮見報道。

CCNG1是最早發(fā)現(xiàn)的p53靶基因之一，是p53-Mdm2網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵調(diào)控因子。有研究報道CCNG1在毛細(xì)血管擴張性共濟失調(diào)癥突變(ataxiatelangiectasia mutated，ATM)依賴的p53調(diào)控和DNA損傷時的細(xì)胞周期調(diào)節(jié)中具有重要作用，認(rèn)為CCNG1缺乏可增加p53的聚集，使p53在Ser-15位點發(fā)生磷酸化，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞周期阻滯，而CCNG1介導(dǎo)的p53調(diào)控依賴于ATM蛋白的狀態(tài)，CCNG1異位表達(dá)可顯著減少DNA損傷時含有ATM的正常人皮膚成纖維細(xì)胞穩(wěn)定態(tài)p53和Ser-15位點的p53磷酸化[11]。Seo等[12]報道CCNG1可通過上調(diào)細(xì)胞周期蛋白B1(cyclin B1)對抗電離輻射誘導(dǎo)的G2期阻滯，進(jìn)而增加細(xì)胞的輻射敏感性。常公民等[13]采用3.0Gy中子照射小鼠，發(fā)現(xiàn)小鼠骨髓細(xì)胞CCNG1基因表達(dá)明顯上調(diào)，認(rèn)為CCNG1可能是中子輻射致骨髓損傷的敏感靶基因之一。

本研究采用實時熒光定量PCR法定量分析0.1～1.0Gy低劑量γ射線照射后CCNG1 mRNA表達(dá)水平的劑量效應(yīng)關(guān)系以及時間效應(yīng)關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，AHH-1中CCNG1 mRNA表達(dá)水平隨劑量的增加而增加，不同劑量照射后CCNG1 mRNA表達(dá)水平隨時間變化的趨勢一致，即照射后24h表達(dá)最高，隨后逐漸下降，72h時恢復(fù)正常。在照射后24h和48h，CCNG1 mRNA表達(dá)水平與受照劑量呈線性關(guān)系，并具有較好的重復(fù)性。

Kabacik等[14]為了尋找一組適合用于生物劑量計的基因，采用芯片技術(shù)、多重實時定量PCR(multiplex quantitative real-time polymerase chain reaction，MQRT-PCR)和nCounter分析系統(tǒng)，對2.0Gy或4.0Gy X線照射后的離體人淋巴細(xì)胞和外周血白細(xì)胞的輻射反應(yīng)基因進(jìn)行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)數(shù)個基因適合用作生物劑量計，其中包括了CCNG1基因。Filiano等[15]檢測了0～8Gy劑量照射后CCNG1基因表達(dá)隨劑量和時間變化的規(guī)律，認(rèn)為CCNG1基因與其他基因可以聯(lián)合應(yīng)用于電離輻射的生物劑量定量評估。Manning等[16]對受p53介導(dǎo)的DNA損傷反應(yīng)調(diào)節(jié)的13個生物標(biāo)志物在高劑量(0.5～4Gy)和低劑量(5～100mGy)照射2h和24h后的轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行了檢測，結(jié)果顯示低劑量電離輻射反應(yīng)基因CCNG1與其他2個基因(FDXR和DDB2)聯(lián)合應(yīng)用于100mGy暴露時的劑量評估值為98mGy，認(rèn)為這些基因可用作低劑量電離輻射暴露的生物標(biāo)記物。結(jié)合本研究結(jié)果，我們認(rèn)為CCNG1基因?qū)﹄婋x輻射敏感，在低劑量范圍內(nèi)存在較好的劑量效應(yīng)關(guān)系和重復(fù)性，有可能作為一個新的生物標(biāo)志物，單獨或與其他基因聯(lián)合應(yīng)用于低劑量電離輻射暴露人員的受照劑量估算。

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Effects of low-dose γ-ray on the expression of CCNG1 gene in human lymphoblasts

HE Ying, SHEN Xian-rong*, QIAN Tian-tian, WANG Qing-rong, HOU Deng-yong, JIANG Ding-wen, LIU Yu-ming, LI Ke-xian, CHEN Wei

Naval Medical Research Institute of PLA, Shanghai 200433, China

*Corresponding author, E-mail: xianrong_sh@163.com
This work was supported by the Science Technology Program of the General Logistics Department of PLA (AHJ09J012)

ObjectiveTo investigate the effects of low dose γ-ray on the gene expression of cyclin G1 (CCNG1) in human lymphoblasts AHH-1 line and the probability of CCNG1 as bio-dosimeter for low-dose radiation.MethodsLymphoblasts of AHH-1 line were irradiated with γ-ray in the doses of 0, 0.1, 0.2, 0.5, 0.8 or 1.0 Gy. Total RNA of cells was extracted at 0, 4, 24, 48, 72 and 168h after irradiation, and real-time Q-PCR was used to detect the expression of CCNG1 gene in AHH-1 cells. The relationship between the irradiation dosage or duration and the gene expression was analyzed.ResultsThe gene expression of CCNG1 in AHH-1 cells increased in a dose-dependent manner after irradiation, presenting a better dose-effect relationship. Time-effect curve indicated that the peak expression of CCNG1 appeared at 24h after irradiation, and then the expression decreased gradually with time, and it recovered to the level before irradiation at 168h after irradiation.ConclusionsCCNG1 gene is sensitive to low dose irradiation (0-1.0Gy) with a better dose and time-effect relationship, and it may be used as a potential efficient biological dosimetry in low dose exposure risk assessment.

radiation, ionizing; radiation dosage; AHH-1 cells; cyclin G1; gene expression; biological dosimeter

R811.5；R148

A

0577-7402(2015)06-0498-04

10.11855/j.issn.0577-7402.2015.06.16

2014-11-29；

2015-01-23)

(責(zé)任編輯：李恩江)

全軍后勤科研計劃項目(AHJ09J012)

何穎，理學(xué)博士。主要從事輻射生物效應(yīng)與醫(yī)學(xué)防護方面的研究

200433 上海 海軍醫(yī)學(xué)研究所(何穎、沈先榮、錢甜甜、王慶蓉、侯登勇、蔣定文、劉玉明、李珂嫻、陳偉)

沈先榮，E-mail：xianrong_sh@163.com