結核感染T細胞斑點試驗對塵肺結核的診斷價值

李林陽，廖江榮

結核感染T細胞斑點試驗對塵肺結核的診斷價值

李林陽，廖江榮

塵肺；結核

塵肺是由于在職業活動中長期吸入生產性粉塵并在肺內潴留而引起的以肺組織彌漫性纖維化為主的全身性疾病，是我國現階段最主要、最嚴重的職業病病種[1-2]。肺結核是由結核分枝桿菌引起的慢性傳染病，是塵肺常見的嚴重合并癥。臨床上把這兩種病變復合共存的特殊類型單列為塵肺結核[3]。塵肺結核患者體內的矽塵與結核菌協同作用引起復雜的組織反應，使其病理改變、臨床表現與影像學特點均不同于單純的塵肺或結核[4]。塵肺結核在臨床上常被漏診或誤診。傳統的結核病輔助診斷方法如痰涂片抗酸染色(AFB)、結核菌素試驗(TST)、結核抗體檢測等均存在敏感性或特異性方面的不足，而“結核分枝桿菌培養”作為診斷結核的金標準，特異性雖高但敏感性低，且培養時間一般為2～8周。結核感染T細胞斑點試驗(T-SPOT.TB)為近年來發展起來的一種診斷結核性疾病的新方法[5]。本研究將T-SPOT.TB與PPD試驗、TB-Ab檢測、痰AFB等方法進行比較，探討其在塵肺結核診斷中的價值。

1 資料與方法

1.1 研究對象 納入2014年4月－2015年2月入住我院呼吸科、臨床診斷疑似塵肺結核(SCTB)的患者為研究對象。所有患者均進行詳細病史采集，并平行進行T-SPOT.TB、TB-Ab、AFB、TST等檢測。

1.2 診斷標準 根據臨床癥狀、實驗室檢查結果及隨訪后最終診斷，將疑似病例分為塵肺結核組與塵肺組。塵肺診斷標準：依據中華人民共和國衛生部塵肺病診斷標準(GBZ70-2009)，由專門的塵肺病診斷專家小組進行確診，并發放塵肺病鑒定證書。塵肺結核的診斷標準：(1)臨床診斷：①有結核接觸病史，近期出現低熱、盜汗、乏力、消瘦等結核中毒表現；②合并有結核性胸膜炎；③高千伏X線提示：肺尖或鎖骨下出現不對稱小片狀或斑片狀密度不均陰影，或上肺野迅速出現浸潤病灶；動態胸片可見原已確診為塵肺的融合團塊短期多變，形成形態不規則的較大空洞，伴同側或對側播散者病變進展快，毀損、破壞等改變嚴重；④常規抗感染治療2周無效，經抗結核治療后好轉，跟蹤隨訪半年，胸片提示病灶明顯吸收，最終確診；(2)實驗室檢查：痰、支氣管鏡刷片、灌洗液結核分枝桿菌涂片陽性，病理檢查可見結核典型改變(如干酪樣壞死)。患者HIV抗體均呈陰性，近期無嚴重病毒感染史，無嚴重肝腎衰竭，近期無輸血及PET-CT檢測，無免疫抑制劑用藥史及放化療治療。

1.3 實驗室檢測項目

1.3.1 AFB檢測及結果判定 按照說明書進行。

1.3.2 PPD試驗 所有入選患者左前臂曲側中上部1/3處皮下注射5U(0.1ml)人型純蛋白衍生物(purified prote in derivatives，PPD)試劑，實驗后48～72h觀察并記錄結果，硬結直徑≥5mm判定為陽性。

1.3.3 結核抗體檢測 按照試劑盒說明書進行。

1.3.4 T-SPOT.TB檢測 (1)操作步驟：①采集肝素鋰抗凝的外周血5ml行外周血單個核細胞(PBMC)分離，采用全血模式進行細胞計數，配制成終濃度為25萬個單個核細胞/100μl的細胞懸液。②在每個樣本的板條上按順序設置陰性對照、抗原A(早期分泌性靶抗原6，ESAT-6)、抗原B(濾液培養蛋白10，CFP-10)、陽性對照，再按上述順序，在4個孔中分別加入已制備好的終濃度細胞懸液100μl，將培養板放入37℃、5%CO2濃度培養箱中培養16～20h，PBS洗4次。③每孔加入50μl新鮮配制的酶標二抗工作液，2～8℃孵育1h，PBS洗4次。④每孔加入50μl顯色液，避光顯色7～12min，蒸餾水終止顯色3～4次，使用濾紙拍板，自然干燥后進行結果判讀，干燥后的板條可在干燥避光條件下長期保存。(2)結果判讀：①陰性對照孔斑點數為0～5個，且(抗原A孔或抗原B孔斑點數)－(陰性對照孔斑點數)≥6，為“陽性”；②陰性對照孔斑點數為6～10個，且(抗原A孔或抗原B孔斑點數)≥2×(陰性對照孔斑點數)，為“陽性”；③如不符合上述標準，且陽性對照孔正常時檢測結果為“陰性”。

1.4 統計學處理 采用SPSS 18.0軟件進行統計分析，計算靈敏度、特異度、假陽性率、假陰性率、陽性預測值、陰性預測值、陽性似然比、陰性似然比、Youden指數等，使用U檢驗比較不同檢測方法靈敏度、特異度等診斷效果評價指標的差異性。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

共納入疑似塵肺結核患者94例，其中男66例，女28例，年齡21～79(48.6)歲。塵肺結核65例，男43例，女22例，年齡26～79(50.2)歲。支氣管肺泡灌洗液檢出抗酸桿菌者8例，支氣管刷檢檢出抗酸桿菌者6例，痰涂片發現抗酸桿菌者4例，經皮肺活檢組織病理證實為結核病者5例，抗結核治療后臨床癥狀明顯改善且胸片顯示病灶明顯吸收者42例。塵肺29例，男23例，女6例，年齡21～73(48.9)歲，均符合SC診斷標準，經抗感染治療后胸片提示病灶吸收。

4種檢測方法對肺結核的單項檢測結果見表1，診斷效果見表2。T-SPOT.TB檢測肺結核的靈敏度顯著高于TB-Ab、PPD試驗和AFB(u=4.925，P<0.001；u=6.156，P<0.001；u=11.637，P<0.001)。T-SPOT.TB檢測肺結核的特異度顯著高于PPD試驗(u=2.169，P<0.05)，T-SPOT.TB的特異度與TB-Ab、AFB比較差異無統計學意義(u=1.867，P>0.05；u=1.466，P>0.05)。T-SPOT.TB檢測肺結核的Youden指數顯著高于TB-Ab、PPD 和AFB(u=4.306，P<0.001；u=5.130，P<0.001；u=8.218，P<0.001)。T-SPOT.TB對肺結核的檢出效果明顯優于TB-Ab、PPD試驗和AFB。

表1 4種檢測方法結果比較Tab.1 Comparison of the results of 4 test methods

表2 4種檢測方法診斷效果比較Tab.2 Comparison of the diagnostic effects of 4 test methods

3 討 論

塵肺患者肺內沉積著大量難溶性矽塵，使肺部毛細血管床和淋巴系統嚴重受損，肺纖維化破壞了大批巨噬細胞，削弱了巨噬細胞吞噬、消化、殺菌的能力。同時結核免疫的效應細胞也受到影響，使入侵的結核菌不能被及時消滅而繼續繁殖、生長、播散，阻礙了結核獲得性免疫的建立，因此塵肺患者易于合并肺結核。已知塵肺結核可促進塵肺病發展，塵肺又可促進結核病病情惡化，使塵肺結核的死亡發生率顯著增高[6]。因此，盡早確診塵肺結核對降低患者病死率、延長塵肺患者生命具有重要意義。

PPD是從結核分枝桿菌中粗提的抗原混合物，含有超過200種抗原成分，其中很多是非結核分枝桿菌及卡介苗(bacillus calmette-gurin，BCG)的共同抗原成分，易發生交叉反應，造成較高“假陽性”率。其次，TST對于感染結核菌2周之內、近期免疫受抑制者、重癥患者、年幼兒童及營養不良、器官移植者缺乏足夠靈敏度。本研究PPD試驗敏感性為58.5%，特異性為72.4%。Meta分析指出PPD試驗的診斷敏感性為78.7%～81.6%，特異性為52.4%～57.9%[7]。與本研究數據差異較大，主要可能是塵肺患者免疫功能低、全身反應弱所致。本研究T-SPOT.TB敏感性為96.9%，特異性為93.1%，與Cho等[8]及高愛忠等[9-11]的研究結果相近。Piana等[12]認為T-SPOT.TB在免疫抑制患者中有穩定的靈敏度和性能。本研究中T-SPOT.TB假陰性率僅為3.08%，而PPD試驗假陰性率41.54%，也說明T-SPOT.TB檢測穩定性好，準確率高，受免疫功能影響小。

血清TB-Ab是由機體感染結核桿菌后針對結核菌素混合抗原所產生的一組免疫球蛋白。一項Meta分析顯示，抗結核抗體檢查具有較大的不穩定性，各種測試之間差異較大[13]。儲新民等[14]報道TB-Ab對結核類疾病診斷的敏感性和特異性都遠低于T-SPOT.TB等其他結核檢測方法。本研究中結核抗體敏感性66.2%，特異性75.9%，均低于本研究中T-SPOT.TB的敏感性(96.9%)及特異性(93.1%)。

盡管痰涂片抗酸染色簡便、快捷，特異性高，但敏感性較低。大量資料顯示，當痰液中分枝桿菌含量為(1000～10 000)/ml時，其痰涂片陽性率為40%～50%，表明大量涂陰結核患者未檢出，漏診率較高。本研究中抗酸桿菌試驗敏感性為27.7%，與敏感性為93.1%的T-SPOT.TB比較不具優勢。

T-SPOT.TB結合了酶聯免疫斑點技術(即ELISPOT技術)與γ-干擾素釋放試驗，通過檢測受結核分枝桿菌抗原刺激而活化的效應T細胞來診斷結核感染。結核感染后體內長期存在抗原特異性T細胞，當再次遇到抗原刺激時，能迅速活化增殖，釋放γ-干擾素。本實驗利用ESAT6和CFP10兩種結核特異性抗原刺激外周血中結核特異性T淋巴細胞分泌γ-干擾素，通過ELISPOT方法檢測γ-干擾素的釋放水平(即斑點多少)，從而判斷機體是否感染結核桿菌。ESAT6和CFP10均來自結核分枝桿菌基因組RD1區域，且僅結核分枝桿菌復合群存在RD1區，因此，該檢測不受卡介苗接種、環境分枝桿菌感染的影響，特異性強，是目前早期發現結核病最有效的檢測手段。本研究中T-SPOT.TB敏感性96.92%，特異性93.10%，與文獻報告相近[8-11]，高于PPD試驗、AFP及TB-Ab檢測。Meier等[15]認為血T-SPOT.TB高陰性預測值對于排除結核病有重要價值。有文獻報告免疫抑制狀態也不影響T-SPOT.TB敏感性，適用于免疫低下、接受免疫抑制劑治療患者結核感染的檢測[16]。本研究T-SPOT.TB假陽性率為6.9%，低于PPD試驗(27.6%)和TB-Ab(24.1%)，盡管AFP假陽性率為0，但敏感性遠低于T-SPOT.TB。T-SPOT.TB假陰性率3.1%，低于PPD試驗(41.5%)、結核抗體檢測(33.8%)和AFP(72.3%)。

綜上所述，T-SPOT.TB對診斷塵肺結核顯示出較好的敏感性、特異性，且假陽性率、假陰性率較低，有臨床診斷價值。但T-SPOT.TB檢測尚不能完全鑒別診斷潛伏性結核感染與活動性結核感染，這在結核發病率高，潛伏性結核多的我國，削弱了T-SPOT.TB診斷活動性結核感染的特異性。盡管如此，T-SPOT.TB還是展現了較好的應用前景。

[1]The ministry of heslth said the occupational-disease-prevention work situation in 2010 and 2011, the key work. http://www. moh.gov.cn/publicfiles/business/htmlfiles/mohwsjdj/ s5854/201105/51676.htm.[衛生部通報2010年職業病防治工作情況和2011年重點工作.]

[2]Ma L, Chen YL. 130 cases of coal workers' pneumoconiosis lung function analysis[J]. Chin J Pract Intern Med, 2013, 33(S1): 66-67. [馬蘭, 陳彥龍. 130例煤工塵肺肺功能分析[J]. 中國實用內科雜志, 2013, 33(S1): 66-67.]

[3]Deng XJ, Shuai JX. Summary of pneumoconiosis tuberculosis[J]. Chin J Coal Ind Med, 2007, 10(10): 1121-1123. [鄧小娟, 衰聚祥. 塵肺結核概述[J]. 中國煤炭工業醫學雜志, 2007, 10(10): 1121-1123.]

[4]Lu C. Pneumoconiosis is empty, pneumoconiosis tuberculosis cavity with tuberculosis cavity imaging analysis[J]. China Prac Med, 2009, 4(32): 64-65. [陸聰. 塵肺空洞、塵肺結核空洞與肺結核空洞的影像學分析[J]. 中國實用醫藥, 2009, 4(32): 64-65.]

[5]Liang DM, Liu DL, Wu XP,et al. Diagnostic value of T-SPOT. TB in intestinal tuberculosis[J]. Chin J Pract Intern Med, 2014, 34(11): 1106-1108. [梁瓞綿, 劉德良, 吳小平, 等. 結核感染T細胞斑點試驗診斷腸結核價值研究[J]. 中國實用內科雜志, 2014, 34(11): 1106-1108.]

[6]Huang DH, Zhang SC, Ma JS. Clinical and imaging analysis on 377 cases of pneumoconiosis and pulmonary tuberculosis[J]. Occup Health, 2010, 26(3): 267-268. [黃登花, 張守才, 馬建設. 塵肺合并肺結核377例臨床和影像學分析[J]. 職業與健康, 2010, 26(3): 267-268.]

[7]Menzies D, Pai M, Comstock G. Meta-analysis: new tests for the diagnosis of latent tuberculosis infection: areas of uncertainty and recommendations for research[J]. Ann Intern Med, 2007, 146(5): 340-354.

[8]Cho OH, Park KH, Park SJ,et al. Rapid diagnosis of tubercμlous peritonitis by T cell-based assays on peripheral blood and peritoneal fluid mononuclear cells[J]. J Infect, 2011, 62(6): 462-471.

[9]Gao AZ. Comparative assay of T-SPOT.TB and PPD in the diagnosis of smear-negative pulmonary tuberculosis[J]. J Clin Pulmonary Med, 2015, 20(3): 432-434. [高愛忠. 兩種試驗對菌陰肺結核診斷價值的比較[J]. 臨床肺科雜志, 2015, 20(3): 432-434.]

[10] Liu Y. The diagnostic value of T-SPOT.TB in tuberculosis[J]. Contemp Med, 2013, 19(8): 12-13.[劉艷．T 細胞斑點試驗在結核病中的診斷價值[J]. 當代醫學, 2013, 19(8): 12-13.]

[11] Rong LX, Ma SH, Ai Q,et al. T. SPOT-TB test with PPD test for TB diagnosis value relevance[J]. Chin J Lab Diagn, 2013, 17(8): 1475-1476. [榮蘭香, 馬淑紅, 艾清, 等. T. SPOT-TB試驗與PPD試驗對結核病患者診斷價值相關性比較[J]. 中國實驗診斷學, 2013, 17(8): 1475-1476.]

[12] Piana F, Codecasa LR, Cavallerio P,et al. Use of a T-cell-based test for detection of tuberculosis infection among immunocompromised patients[J]. Eur Respir J, 2006, 28: 31-34.

[13] Steingart KR, Henry M, Laal S,et al. Commercial serological antibody detection tests for the diagnosis of pulmonary tuberculosis: a systematic review[J]. PLoS Med, 2007, 4(6): e202.

[14] Chu XM, Kong JX. Sensitivity and specificity of T-SPOT.TB in diagnosing tuberculosis infection[J]. Acta Univ Med Anhui, 2012, 47(5): 613-615. [儲新民, 孔建新. 酶聯免疫斑點試驗診斷結核的敏感性和特異性研究[J]. 安徽醫科大學學報, 2012, 47(5): 613-615.]

[15] Meier T, Eulenbruch HP, Wrighton-Smith P,et al. Sensitivity of a new commercial enzyme-linked immunospot assay (T SPOTTB) for diagnosis of tuberculosis in clinical practice. Eur J Clin Microbiol Infect Dis[J]. 2005, 24(8): 529-536.

[16] Kim SH, Song KH, Choi SJ,et al. Diagnostic usefulness of a T-Cell-based assay for extrapulmonary tuberculosis in immunocom-Promised patientis[J]. Am J Med, 2009, 122(2): 189-195.

R598

A

0577-7402(2015)08-0683-03

10.11855/j.issn.0577-7402.2015.08.17

2015-03-14；

2014-06-29)

(責任編輯：沈寧)

遵義市科技局資助項目(201329)

563000 貴州遵義 貴州航天醫院肺科(李林陽、廖江榮)

廖江榮，E-mail: ljr3409@sina.com