小鼠小腸干細胞譜系追蹤方法的建立及其在放射損傷中的應用

徐鐵柱，崔宇，楊超，王麗梅，李中堂，王俊可，趙致維，善亞君，柳曉蘭，從玉文

小鼠小腸干細胞譜系追蹤方法的建立及其在放射損傷中的應用

徐鐵柱，崔宇，楊超，王麗梅，李中堂，王俊可，趙致維，善亞君，柳曉蘭，從玉文

目的 利用Lgr5-EGFP-CreERT2/ROSA26-stop-EYFP小鼠建立譜系追蹤方法，用于觀察Lgr5+小腸干細胞在小腸組織更新中的作用，并研究輻射對小腸干細胞組織重建的影響。方法 通過基因型分析鑒定Lgr5-EGFP-CreERT2/ ROSA26-stop-EYFP小鼠。他莫西芬誘導小鼠體內(nèi)的熒光蛋白表達，激光共聚焦顯微鏡觀察誘導后小腸干細胞的分化。采用60Coγ射線(15Gy)照射Lgr5-EGFP-CreERT2/ROSA26-stop-EYFP小鼠，觀察輻射對小腸干細胞組織重建的影響。結果 提取鼠尾DNA通過PCR方法鑒定Lgr5基因(174bp)，獲得雙陽性小鼠。他莫西芬(100mg/kg)單次誘導后，激光共聚焦觀察到Lgr5+小腸干細胞在誘導后5d開始分裂，7d已到達絨毛頂端，14d少量絨毛全部帶有熒光，45d更多的小腸絨毛中存在熒光細胞，而且更加稠密。但在15Gy照射后小鼠小腸絨毛脫落嚴重，隱窩處沒有熒光出現(xiàn)。結論 成功建立了小腸干細胞譜系追蹤模型，并初步觀察了輻射對小腸干細胞損傷的影響。

小腸干細胞；譜系追蹤；輻射損傷

在哺乳動物體內(nèi)，小腸組織是自我更新速度最快的組織之一。整個小腸黏膜大概每3～5d更新一次，主要依賴于小腸干細胞的增殖與分化[1]。成體干細胞具有高度自我更新及多向分化能力[2]。以往對小腸干細胞的認識手段僅局限于使用多元同位素成像質(zhì)譜分析法來研究DNA標記保留細胞[3]以及使用Musashi-1[4]和Prominin1[5]來研究隱窩柱狀上皮細胞。由于缺乏相應的技術手段直接證明干細胞的特性以及有效的干細胞分析方法，干細胞表面標志的研究一直進展緩慢[6]。直到譜系追蹤方法的出現(xiàn)，小腸干細胞表面標志的研究才有突破性的進展。

譜系追蹤系統(tǒng)可以示蹤來源于同一細胞的所有子代細胞，是在成體哺乳類組織中研究干細胞特性的一種重要工具，通常使用Cre-LoxP系統(tǒng)，需要兩種品系小鼠：一種是具有組織或細胞特異性的Cre重組酶小鼠，另一種是帶有l(wèi)oxP-STOP-loxP(錨定STOP)序列的報告基因小鼠。通過他莫西芬誘導可在兩種品系雜交后的雙陽性子代小鼠特定細胞內(nèi)表達Cre重組酶，以此剪切STOP序列，從而使報告基因得以表達，獲得遺傳基因改變的細胞，進而達到示蹤的目的[7]。譜系追蹤系統(tǒng)已被公認為研究干細胞群體的一種重要手段[8]。國外有研究利用譜系追蹤相繼證實Ascl2、Olfm4、Bmi-1、Hopx等為小腸干細胞的標志基因[9-11]。在這些標記基因中，Lgr5被認為是最重要的。從功能上分析，Lgr5編碼G蛋白偶聯(lián)受體，在Wnt信號通路中起著重要的作用。從數(shù)量上看，Lgr5+干細胞增殖活躍，具有自我更新的潛能，在所有隱窩的底部均大量存在，以維持小腸上皮的穩(wěn)態(tài)[12-13]。本研究引進Lgr5-EGFPCreERT2小鼠和ROSA26-stop-EYFP報告基因小鼠，建立小鼠小腸干細胞譜系追蹤方法，并應用該方法觀察大劑量照射對小腸干細胞損傷的影響。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器 他莫西芬購于Sigma公司；甲醛溶液購自天津市福晨化學試劑有限公司；2xPCR Master Mix購于北京博邁德生物科技有限公司。震蕩切片機(MA752，美國Campden Instruments公司)；激光共聚焦顯微鏡(FV1000公司)；PCR擴增儀購于北京友華生物科技有限公司。

1.2 實驗動物 B6.129P2-Lgr5tm1(cre/ERT2)Cle/J小鼠購于美國Jackson實驗室，品系編號為J008875，屬基因敲入小鼠，純合子致死。ROSA26-stop-EYFP報告基因小鼠購于南京大學模型動物中心，屬基因敲入小鼠，EYFP前面有一個LoxP錨定的STOP序列，純合子可存活。Lgr5-EGFP-CreERT2/ROSA26-stop-EYFP雜交小鼠注射抗雌激素，如4-羥基他莫西芬來激活Cre，可剪切EYFP序列前的STOP序列，從而使EYFP基因得以表達。小鼠飼養(yǎng)于軍事醫(yī)學科學院實驗動物中心SPF級動物房。

1.3 雙陽性小鼠基因型鑒定 在小鼠4周齡時，提取雜交小鼠鼠尾DNA，通過凝膠電泳檢測小鼠基因型。Lgr5基因PCR引物序列如下(擴增目的片段長174bp)。Common 8060：5'-CTGCTCTCTGCTCCCA GTCT-3'；Wild Type 8061：5'-ATACCCCATCCCTT TTGAGC-3'；Mutant 9402：5'-GAACTTCAGGGTC AGCTTGC-3'。PCR條件：預變性94℃ 3min；94℃變性30s，66℃復性1min，72℃延伸30s，35個循環(huán)；72℃延伸5min。

1.460Co γ線照射 選取經(jīng)PCR鑒定Lgr5基因為雜合子的小鼠3只，6～8周齡，體重20～22g。將小鼠置于鉛屏后面接受劑量率約為55cGy/min(總劑量15Gy)的全身屏蔽照射。照射后1h，每只小鼠按100mg/kg腹腔注射他莫西芬進行誘導。照射后4.5h取空腸組織，制作震蕩切片。

1.5 他莫西芬誘導 選取5只Lgr5基因為雜合子的小鼠，6～8周齡，體重20～22g。按每只小鼠100mg/ kg腹腔注射他莫西芬誘導。誘導后3、5、7、14、45d各處死1只小鼠，取空腸組織，制作震蕩切片。

1.6 震蕩切片機切片 安樂處死小鼠后，取3段1cm空腸組織，縱向剖開平鋪于濾紙上，置于4%多聚甲醛中30min后取出，1×PBS溶液里浸泡5min。將空腸組織平鋪在包埋盒中，60℃下用4%的瓊脂糖固定，待凝固后，取出切成1cm2大小，并將3個瓊脂糖塊立起并列放在包埋盒中，60℃下用4%的瓊脂糖固定。用膠水將組織塊固定到震蕩切片機托盤上，在切片槽內(nèi)倒入適量PBS溶液，浸沒刀片，將切片厚度設置為180μm，然后根據(jù)瓊脂糖的硬度及小腸組織包埋的位置調(diào)整刀片適宜的前進速度和震蕩幅度，將切好的片子從PBS溶液中撈出，置于含有預冷PBS溶液的培養(yǎng)皿里，4℃保存?zhèn)溆糜诩す夤簿劢癸@微鏡觀察。

1.7 激光共聚焦顯微鏡觀察誘導后小腸干細胞的分化情況 采用FV1000激光共聚焦顯微鏡觀察，通過掃描程序?qū)φ麖埱衅M行掃描，以FV10-ASW2.1軟件進行圖像提取和分析。根據(jù)文獻報道[6]，在熒光顯微鏡下觀察Lgr5-EGFP-CreERT2小鼠小腸干細胞Lgr5+細胞帶有綠色熒光，分布在隱窩底部0－+4位。

2 結 果

2.1 雙陽性小鼠基因型鑒定 Lgr5目的基因條帶大小為174bp的小鼠即為所需的雜交小鼠(圖1)。

2.2 激光共聚焦顯微鏡觀察小腸隱窩底部Lgr5+干細胞 應用激光共聚焦顯微鏡可以清晰地看到在小腸隱窩底部有綠色熒光產(chǎn)生，呈間隔分布，集中在0－+4位之間，嵌合在潘氏細胞之間。Lgr5+的隱窩基底柱狀干細胞(CBC)細胞呈楔形，朝向腸腔。縱觀小腸絨毛，熒光的產(chǎn)生呈鑲嵌式分布，并不是每個絨毛底部都有熒光產(chǎn)生(圖2)。

圖1 Lgr5基因凝膠電泳鑒定結果Fig.1 Gel electrophoresis appraisal result of Lgr5 gene

圖2 隱窩底部Lgr5+干細胞Fig.2 Lgr5+stem cells exist in the bottom of the crypt

2.3 小腸干細胞譜系追蹤模型的建立 在激光共聚焦顯微鏡下觀察誘導后不同時間點小腸干細胞的變化，發(fā)現(xiàn)誘導后3d隱窩底部已經(jīng)開始出現(xiàn)熒光，并有向上移動的趨勢；誘導后5d熒光細胞已經(jīng)移動到隱窩的快速增殖細胞(TA)部；誘導后7d可看到有少量從隱窩分裂分化的細胞已經(jīng)移動到絨毛頂端；誘導后14d有更多的熒光細胞到達小腸絨毛頂端，少量絨毛從隱窩基底到絨毛頂尖則全部帶有熒光；誘導后45d可見整個小腸絨毛中熒光細胞更多、更密實。提示分化的細胞系來源于Lgr5+干細胞，小鼠小腸干細胞譜系追蹤模型成功建立(圖3)。

2.4 15Gy照射對小鼠小腸干細胞組織更新的影響在照射后4.5d(108h)用激光共聚焦顯微鏡觀察小鼠小腸干細胞的變化，發(fā)現(xiàn)15Gy照射后的小鼠小腸絨毛嚴重脫落，隱窩基底部也沒有熒光出現(xiàn)，而未經(jīng)照射的正常小鼠在誘導后4.5d隱窩處熒光已經(jīng)開始沿著隱窩-絨毛中軸線向上移動。說明15Gy照射可導致隱窩處小腸干細胞死亡，在照后4.5d也沒有恢復(圖4)。

圖3 譜系追蹤系統(tǒng)的建立Fig.3 The establishment of the lineage tracking system

圖4 15Gy照射對小腸組織重建的影響Fig.4 Effects of 15Gy irradiation (IR) on small intestinal tissue reconstruction

3 討 論

小腸隱窩內(nèi)的快速增殖細胞會分化為成熟的小腸絨毛上皮細胞。小腸隱窩由兩種不同的細胞系(吸收系和分泌系)和四種不同類型的成熟細胞(腸上皮吸收細胞、杯狀細胞、腸分泌細胞、潘氏細胞)組成。20世紀末期，Bach等[14]用帶有同位素3H的胸腺嘧啶和BrdU等DNA摻入法以及Ki67等增殖性的標志抗體來研究隱窩部位的增殖，初步證實增殖細胞在隱窩的下部2/3部位，并將之稱為快速增殖細胞即TA細胞。

由于小腸干細胞比TA細胞有著更長的細胞周期，基于這種假說，Booth等[15]用同位素3H的胸腺嘧啶和BrdU在輻射后進行脈沖標記來區(qū)分這兩種細胞。這種標記會在一段時間后大量聚集在TA細胞中，在向絨毛部位移動后，標記會被隱藏，或者在大量的細胞分裂后標記被稀釋。在這個模型中，他們認為緩慢循環(huán)、標記長期保留的細胞(LRC)不僅是長壽細胞而且也可以代表小腸干細胞，但未對小腸干細胞的功能進行證實。

不同類型的干細胞表面標志如Musashi-1[4]、BMPR1α、phospho-PTEN、DCAMKL1、Eph受體和整合素都曾被提出來作為研究小腸干細胞表面標志的基因，但這些受體只是為研究小腸干細胞提供了一個更好的工具，而是否是小腸干細胞表面標志還需要功能上的進一步檢測[16-19]。

2007年Barker等[8]利用可誘導的Cre基因敲入小鼠和Rosa26-lacZ報告基因小鼠建立了譜系追蹤的方法，證實了Lgr5基因為小腸和結腸干細胞的表面標志。隨后相繼報道Bmi1和Hopx、Mtert、Lrig1基因分別是+4位小腸干細胞的特征標志，Bmi1陽性細胞主要分布于小腸上1/3處，而Hopx陽性細胞分布在全部小腸，應用體內(nèi)譜系示蹤以及體外培養(yǎng)均證實這些細胞為小腸隱窩多功能干細胞，在損傷修復中起著重要作用[9-11]。

小腸是目前干細胞生物學研究最主要的模型之一，而小腸干細胞的表面標志基因也是目前研究的重點方向。小鼠小腸干細胞譜系追蹤系統(tǒng)可以直觀地展現(xiàn)小腸的更新情況，更加真實地反映體內(nèi)組織重建的狀況，是目前國際干細胞研究領域一種前沿的研究手段。本研究采用的Rosa26-stop-EYFP報告基因小鼠較其他報告基因小鼠如Rosa26-lacZ操作更加簡單，只需制作震蕩切片；觀察更加直接，不需要其他額外的染色手段，可以更加真實直接的反映組織和細胞原有的狀況。利用震蕩切片可以切出厚度150～200μm的最佳組織，能最大程度地保留熒光蛋白的活性以及細胞的完整性，從而在各種組織中具備高分辨率的三維立體結構[20]。不足的是切片中熒光保存時間較短，4℃下只能保存一周左右。

本研究觀察了大劑量照射下小腸組織的更新情況。照射后4.5d，小腸絨毛嚴重脫落，幾乎沒有熒光出現(xiàn)，但隱窩數(shù)目表明此時隱窩有增殖現(xiàn)象，說明大劑量照射可使增殖活躍的Lgr5+干細胞凋亡，隱窩的增殖細胞可能是由+4位小腸干細胞轉化而來。Lgr5+的小腸干細胞的作用主要在于維護腸黏膜穩(wěn)態(tài)重建，而Bmi1等標記的靜態(tài)小腸干細胞則主要參與放射等損傷后的腸黏膜重建[21]。

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Establishment of lineage tracing method of mice small intestinal stem cell and application in radiation injury

XU Tie-zhu1, CUI Yu2, Yang Chao2, WANG Li-mei2, LI Zhong-tang2, WANG Jun-ke2, ZHAO Zhi-wei2, SHAN Ya-jun2, LIU Xiao-lan2, CONG Yu-wen2*1Graduate School, Guangxi Medical University, Nanning 530000, China
2Institute of Radiation Medicine, Academy of Military Medical Sciences, Beijing 100850, China
*

, E-mail: congyw01@163.com
This work was supported by the National Drug Discovery of Major Projects (2013ZX09J13102-02C) and the National Natural Science Foundation of China (81272997)

ObjectiveTo establish a lineage tracing method with Lgr5-EGFP-CreERT2/ROSA26-stop-EYFP mouse for observing the role of Lgr5+intestinal stem cells in the renovation of small intestine tissue, and investigate the effects of radiation on the reconstruction of small intestinal stem cell tissue.MethodsLgr5-EGFP-CreERT2/ROSA26-stop-EYFP mice were identified by genotype analysis. Tamoxifen was used to induce the expression of fluorescent protein in mice. The differentiation of intestinal stem cells induced by Tamoxifen was observed by laser confocal microscopy. Lgr5-EGFP-CreERT2/ROSA26-stop-EYFP mice were irradiated with60Co γ-rays, and the effects of irradiation on the reconstruction of small intestinal stem cell tissue were examined.ResultsDouble positive mice were obtained by identification of Lgr5 gene (174bp) in DNA extraction from the mice tail with PCR method. In mice treated with single injection of Tamoxifen (100mg/kg), it was observed by laser confocal scanning microscopy that the Lgr5+intestinal stem cells started dividing at the 5th day after inducement, reached the top of the villi at the 7th day, fluorescence appeared in a few of whole intestinal villi at the 14th day, and spread over more intestinal villi with dense fluorescence at the 45th day. However, in mice exposed to 15Gy irradiation, the intestinal villi fell off seriously without fluorescence in crypts.ConclusionThe lineage tracing model of intestinal stem cell has been successfully established and then used to evaluate the irradiation injuries to intestinal stem cells.

intestinal stem cells; lineage tracing; radiation injuries

R818.04

A

0577-7402(2015)05-0349-05

10.11855/j.issn.0577-7402.2015.05.03

2015-01-11；

2015-03-19)

(責任編輯：李恩江)

國家重大新藥創(chuàng)制專項課題(2013ZX09J13102-02C)；國家自然科學基金面上項目(81272997)

徐鐵柱，碩士研究生。主要從事輻射防護藥物的研究工作

530000 南寧 廣西醫(yī)科大學研究生院(徐鐵柱)；100850 北京 軍事醫(yī)學科學院放射與輻射醫(yī)學研究所(崔宇、楊超、王麗梅、李中堂、王俊可、趙致維、善亞君、柳曉蘭、從玉文)

從玉文，E-mail：congyw01@163.com