氫氣對大鼠離體心肌缺血再灌注損傷的保護作用及機制

劉雪聰 ，劉福林，李志林，周曉東，申文增，周程

(1河北大學附屬醫院，河北保定071000；2河北大學化學院；3河北大學生理教研室)

·論著·

氫氣對大鼠離體心肌缺血再灌注損傷的保護作用及機制

劉雪聰1，劉福林1，李志林2，周曉東1，申文增3，周程1

(1河北大學附屬醫院，河北保定071000；2河北大學化學院；3河北大學生理教研室)

目的 探討氫氣對心肌缺血再灌注(I/R)損傷的保護作用。方法 將48只大鼠隨機分為實驗組和對照組各24只。取兩組大鼠心臟，按逆灌注10 min，常溫曠置20 min、再灌注20 min的方法建立心肌缺血再灌注模型。對照組灌注液用K-R液，實驗組灌注液用K-R液+氫氣飽和生理鹽水。監測兩組大鼠心臟缺血前期、缺血期、再灌注期心肌組織丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)水平及左室舒張末期壓力(LVEDP)。結果 對照組缺血期心肌MDA水平高于缺血前期(P<0.05)，再灌注期心肌MDA水平低于缺血期(P<0.05)，但仍高于缺血前期(P<0.05)。實驗組各期心肌MDA水平無統計學差異；缺血期、再灌注期心肌MDA水平較對照組同期下降(P均<0.05)。兩組缺血期與缺血前期心肌SOD水平無統計學差異，缺血再灌注期心肌SOD水平低于缺血前期和缺血期(P均<0.05)。實驗組缺血期與再灌注期心肌SOD水平較對照組同期升高(P均<0.05)。對照組再灌注期LVEDP高于缺血前期(P<0.05)；實驗組再灌注期與缺血前期LVEDP無統計學差異，但與對照組同期比較下降明顯(P<0.05)。結論 氫氣對大鼠離體心臟心肌I/R損傷有明顯的保護作用。其機制可能為抑制心肌組織MDA表達，提高心肌組織SOD水平。

心肌缺血再灌注損傷；氫氣飽和生理鹽水；丙二醛；超氧化物歧化酶

體外循環下心臟直視手術時心臟會經歷缺血再灌注(I/R)的過程，而I/R損傷會引起心肌頓抑、心律失常等[1]。研究證實，自由基、鈣超載、心肌纖維能量代謝障礙、細胞凋亡等均可參與心肌I/R損傷。氫氣對羥自由基及過氧亞硝基等陰離子有中和作用[3]，可作為抗氧化劑用于腦缺血所致的I/R損傷[4]。2014年6～10月，我們觀察了氫氣飽和鹽水對大鼠離體心臟I/R損傷的保護作用，現分析結果并探討其作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料 實驗動物為 Wistar大鼠48只，雌雄不限，體質量200～350 g，由中國人民解放軍軍事醫學科學院衛生學環境醫學研究所動物實驗中心提供，合格證號：SCXK-(軍)2009-003。實驗用氫氣為自制，由河北大學化學院李志林老師提供(制備技術已獲得國家專利，專利號ZL102557227B)，氫氣飽和生理鹽水(pH值為7.3)；丙二醛(SOD)、超氧化物歧化酶(MDA)檢測試劑盒和考馬斯亮藍蛋白試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。

1.2 實驗方法

1.2.1 模型制備及干預 將48只大鼠隨機分為對照組與實驗組，每組24只。 按大鼠體質量注射戊巴比妥鈉(30 mg/kg)麻醉、肝素(250 U/kg)抗凝。待麻醉起效后，迅速沿劍突下肋緣剪開腹壁并打開膈肌，同時將兩側腋前線剪開胸壁并將其上翻至頭側，在不影響主動脈的情況下，摘取心臟，立即放入4 ℃冰鹽水中，并輕壓心臟，洗去血跡。將離體心臟按逆灌注10 min、常溫曠置20 min、再灌注20 min的順序進行I/R。行主動脈插管并將離體心臟固定于Langendorff裝置，將預先用氧平衡的37 ℃灌注液以7.85 kPa灌注壓進行心臟灌注，同時在左心耳處剪一小口，并經二尖瓣處將帶有乳膠氣囊的測壓管插入左心室，同時連接BL-420生物技能實驗系統，將氣囊內壓力調至7 mmHg 。對照組采用K-R液灌注，實驗組采用K-R液+氫氣飽和生理鹽水(5 mL/kg，pH值為7.3)灌注。

1.2.2 相關指標觀察 兩組均于缺血前期、缺血期和再灌注期各取8個離體心臟，將心肌組織剪下，并經生理鹽水漂洗后勻漿。采用721型分光光度計比色測定心肌組織MDA、SOD水平，嚴格按試劑盒說明書操作；采用BL-420生物技能實驗系統記錄缺血前期及再灌注期左室舒張末期壓力(LVEDP)。

2 結果

兩組各期LVEDP及心肌組織MDA、SOD水平見表1。由表1可見，對照組缺血期心肌MDA水平高于缺血前期(P<0.05)，再灌注期心肌MDA水平低于缺血期(P<0.05)，但仍高于缺血前期(P<0.05)。實驗組各期心肌MDA水平無統計學差異；缺血期、再灌注期心肌MDA水平較對照組同期下降(P均<0.05)。兩組缺血期與缺血前期心肌SOD水平無統計學差異，缺血再灌注期心肌SOD水平低于缺血前期和缺血期(P均<0.05)。實驗組缺血期與缺血再灌注期心肌SOD水平較對照組同期升高(P均<0.05)。對照組再灌注期LVEDP高于缺血前期(P<0.05)；實驗組再灌注期與缺血前期LVEDP無統計學差異，但與對照組同期比較下降明顯(P<0.05)。

表1 兩組I/R過程中心肌MDA、SOD水平及LVEDP比較

3 討論

本研究結果顯示，氫氣可降低心肌中MDA，提高SOD活性，改善缺血再灌注大鼠的心功能。此種心肌保護作用可能與之前報導的大腦損傷模型中分子氫選擇性清除活性氧簇(ROS)有關[5]。I/R過程中心肌細胞可產生一系列活性氧簇(ROS)，其中羥自由基(·OH)和過氧化亞硝酸陰離子(ONOO-)是有害自由基，可與不飽和脂肪酸作用引發脂質過氧化反應，其產物可破壞具有重要功能的生物大分子(如DNA、蛋白質、脂類等)的結構和功能。導致致死性的再灌注損傷[6～8]。線粒體是產生ROS的主要部位，而一些大分子進入線粒體困難[9]。研究發現，氫氣可清除氧自由基[5]。氫氣分子是電中性的，分子量小于氧氣分子，可穿過細胞膜進入細胞核和細胞器如細胞核及線粒體中。氫分子能夠通過細胞膜進入胞內清除自由基，這一特性是其他抗氧化劑所不具備的[5]。本研究實驗組心肌組織MDA水平低于對照組，SOD活性高于對照組，證實氫氣飽和生理鹽水對離體心臟心肌I/R損傷有保護作用，其機制可能為迅速使心肌細胞氫氣濃度上升，氫氣減少了ROS的產生、穩定線粒體膜電位、維持ATP穩定的合成、避免了DNA損傷、降低了脂質過氧化物MDA生成，從而保護了心肌。其中發揮保護作用的最根本機制可能是抑制線粒體通透性轉換孔開放[10，11]。

心肌缺血后心功能的變化表現為靜止張力(如LVEDP)隨缺血時間的延長逐漸增高(表現為LVEDP升高)，再灌注時繼續增高；缺血心肌在恢復血液灌注后一段時間內出現可逆性收縮功能減低現象，稱之為心肌頓抑。本研究結果顯示，實驗組再灌注期LVEDP低于缺血前期和對照組再灌注期，表明氫氣可以降低I/R導致的心肌頓抑程度，促進患者心功能恢復。氧化應激是引起心肌I/R損傷的首要因素。減輕氧化應激被認為是保護心肌細胞的重要措施。氫氣的易擴散性可以使其與羥自由基反應產生成水[12]，所以可以清除ROS。在以前的醫學應用中氫氣僅限于檢測抗菌治療的效果[13]。雖然也有動物實驗研究證明其他的給氫方式可以有效清除活性氧，但進入臨床研究后幾乎都失敗了[14]。近年來，隨著氫氣在生物體內功能的深入研究，人們發現其在減輕心肌I/R損傷中具有明顯的作用[15]。基于以上理論基礎，本研究通過建立離體Langendorff模型，對氫氣飽和生理鹽水在心肌I/R損傷中的作用做進一步研究，為找尋體外循環中所造成的心肌I/R的保護方法，將為氫氣飽和生理鹽水用于體外循環心臟直視手術的心肌保護提供實驗資料。本研究結果顯示，氫氣飽和生理鹽水可減輕心肌I/R損傷，提高左心室舒張壓及收縮壓，但由于實驗仍處于基礎研究水平，還需進一步研究明確其臨床應用效果。

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Protective effects of hydrogen saturated saline alleviating myocardial ischemia reperfusion injury in rats

LIUXue-cong1,LIUFu-lin,LIZhi-lin,ZHOUXiao-dong,SHENWen-zeng,ZHOUCheng

(AffiliatedHospitalofHebeiUniversity,Baoding071000,China)

Objective To explore the protective effects of hydrogen saturated saline in induced myocardial ischemia reperfusion injury in rats. Methods Forty-eight rats were divided randomly into the experimental group (24) and the control group (24). The rats of experimental group were treated with K-R solution combined with hydrogen saturated saline, the controls were given K-R solution only. After the treatment, the hearts were excised rats and Langendorff model. And the heart of the in vitro by inverse perfusion for 10 minutes, normal temperature place for 20 minutes, 20 minutes of reperfusion.The solution of the cardiac muscle tissue of the rats were treated with saline and then the accounts of malondialdehyde (MDA)and the activity of superoxide dismutase(SOD) , and the changes of left ventricular end-diastolic pressure (LVEDP) were determined to compare the different protective effects. Results The accounts of MDA in the control group were the highest, there was a significant difference between the experimental group and the controls concerning with the results of ischemia period and reperfusion period (P<0.01,P<0.05). There were differences among the ischemia period and reperfusion period and preischemia period in the control group(P<0.05). In the experimental group, there was not significant difference among the ischemia period and reperfusion period and the preischemia period. There was a significant difference between the experimental group and the controls considering the activity of SOD (P<0.01). The accounts of LVEDP of the control group was obviously high (P<0.05). The level of LVEDP in experimental group was obviously lower than in the control group (P<0.05),but had no significant difference to ischemia period. Conclusion Hydrogen rich saline is quite effective in alleviating myocardial ischemia reperfusion injury.

myocardial ischemia reperfusion injury；hydrogen-rich saline; malondialdehgde; superoxide dismutase

河北省2013年醫學科學研究重點課題計劃項目(20130369)。

劉雪聰(1987-)，男，在讀碩士，研究方向為心肌缺血再灌注損傷、冠狀動脈粥樣斑塊易損性和冠心病的外科治療。E-mail：314678161@qq.com

劉福林(1966-)，男，主任醫師，教授，碩士生導師，研究方向為心肌缺血再灌注損傷、冠狀動脈粥樣斑塊易損性和冠心病的外科治療。E-mail：lful666@sina.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2015.06.001

R34

A

1002-266X(2015)06-0001-03

2014-12-13)