辛伐他汀對耐紫杉醇人肺腺癌細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期的影響

蘇克莉，郭亮，李靜

(1山東大學(xué)醫(yī)學(xué)院，濟(jì)南250013；2濟(jì)南市第四人民醫(yī)院)

·臨床研究·

辛伐他汀對耐紫杉醇人肺腺癌細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期的影響

蘇克莉1,2，郭亮2，李靜2

(1山東大學(xué)醫(yī)學(xué)院，濟(jì)南250013；2濟(jì)南市第四人民醫(yī)院)

目的 探討辛伐他汀聯(lián)合紫杉醇對人肺腺癌耐紫杉醇細(xì)胞株增殖的影響。方法 用0、10、20、40、80 μmol/L的辛伐他汀處理耐紫杉醇A549細(xì)胞(A549/Taxol)24、36、48 h，用四甲基偶氮唑鹽(MTT)法測算各組細(xì)胞增殖率。用含有20 μmol/L的辛伐他汀(辛伐他汀組)、10-7mol/L紫杉醇(紫杉醇組)及20 μmol/L的辛伐他汀+10-7mol/L紫杉醇(聯(lián)合組)培養(yǎng)A549/Taxol細(xì)胞，24、48 h后用MTT法測算各組細(xì)胞增殖率，24、36、48 h后用流式細(xì)胞術(shù)檢測各組細(xì)胞周期。結(jié)果 辛伐他汀能濃度依賴性(10 ～40 μmol/L)地抑制耐紫杉醇A549/Taxol細(xì)胞增殖，而且抑制作用呈時間依賴性(P均<0.05)。相同時點(diǎn)比較聯(lián)合組細(xì)胞增殖抑制率和G1期細(xì)胞比例高于辛伐他汀組、紫杉醇組和空白對照組。結(jié)論 辛伐他汀可抑制A549/Taxol增殖，辛伐他汀聯(lián)合紫杉醇對A549/Taxol增殖有協(xié)同抑制作用。

辛伐他汀；紫杉醇；非小細(xì)胞肺癌；細(xì)胞增殖；細(xì)胞周期

非小細(xì)胞肺癌(NSCLC) 患者確診時約2/3已屬晚期或發(fā)生轉(zhuǎn)移，失去手術(shù)機(jī)會，需要化學(xué)藥物治療，但復(fù)發(fā)率高，且對大多數(shù)化療藥物不敏感 ，預(yù)后很差[1]。紫杉醇是NSCLC臨床治療的一線藥物，近年來其耐藥率逐漸升高，嚴(yán)重影響了化療效果[2]。研究發(fā)現(xiàn)，他汀類降血脂藥辛伐他汀能顯著抑制乳腺癌、前列腺癌、膠質(zhì)瘤等多種腫瘤細(xì)胞增殖，具有較好的抗腫瘤能力[3]。服用他汀類藥物6個月以上在不同年齡及種族中肺癌發(fā)生的風(fēng)險可下降55%[4]。2013年6月～2013年10月，我們觀察了辛伐他汀聯(lián)合紫杉醇對耐紫杉醇A549細(xì)胞(A549/Taxol)增殖的影響。現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 人肺腺癌耐紫杉醇A549細(xì)胞株(A549/Taxol)由山東省腫瘤醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室惠贈，A549/Taxol細(xì)胞可在10-7mol/L的紫杉醇中正常生長。辛伐他汀、紫杉醇購自中國藥監(jiān)所，溶解稀釋后-20 ℃凍存，使用前用培養(yǎng)液稀釋成所需的濃度。其他主要儀器和試劑有DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶、胎牛血清(美國Gibco公司)，四甲基偶氮唑鹽(MTT，美國Sigma)、二甲基亞砜(DMSO，美國Sigma)、流式細(xì)胞儀(德國PARTEC公司 )

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) A549/Taxol細(xì)胞株用含10%胎牛血清及0.1%青霉素/鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基，于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)、傳代。

1.2.2 辛伐他汀對A549/Taxol細(xì)胞增殖的影響的觀察 將A549/Taxol細(xì)胞制成細(xì)胞懸液，以每孔4×103個細(xì)胞接種于96孔平底培養(yǎng)板中，37 ℃、5%CO2孵箱內(nèi)培養(yǎng)，每孔培養(yǎng)液為100 μL。細(xì)胞培養(yǎng)過夜貼壁后，用0、10、 20、 40、 80 μmol/L辛伐他汀分別處理細(xì)胞24、36、48 h，倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化。培養(yǎng)結(jié)束前每孔加入以磷酸鹽緩沖液(PBS)稀釋的5 mg/mL噻唑藍(lán)溶液15 μL，繼續(xù)孵育4 h后，終止培養(yǎng)，吸棄孔內(nèi)上清液，每孔加入150 μL二甲基亞砜，靜置10 min待結(jié)晶物充分溶解，用酶標(biāo)儀在波長492 nm處測量各孔的吸光值(A)。同時設(shè)置陰性對照組(僅加DMSO，不加藥物處理) 和空白對照組(無細(xì)胞，僅加無血清DMEM) ，各組均設(shè)5個復(fù)孔。計(jì)算細(xì)胞抑制率和辛伐他汀的IC50值。取IC50附近的濃度(20 μmol/L)進(jìn)行下面的實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 辛伐他汀聯(lián)合紫杉醇對A549/Taxol細(xì)胞增殖的影響的觀察 將A549/Taxol細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，以每孔4×103細(xì)胞接種于96孔平底培養(yǎng)板中，37 ℃、5%CO2孵箱內(nèi)培養(yǎng)，每孔培養(yǎng)液體積為100 μL。細(xì)胞培養(yǎng)過夜貼壁后，用含有20 μmol/L的辛伐他汀(辛伐他汀組)、10-7mol/L紫杉醇(紫杉醇組)及含兩藥的培養(yǎng)液(聯(lián)合組)各100 μL培養(yǎng)細(xì)胞24、48 h后用MTT法測吸光度值A(chǔ)，計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率。增殖抑制率=[1-(處理組A值-空白組A值)/(陰性組A組-空白組A組)]×100%。

12.4 辛伐他汀聯(lián)合紫杉醇對A549/Taxol細(xì)胞周期的影響的觀察 將A549/Taxol細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，以每孔1×105個細(xì)胞接種6孔平底培養(yǎng)板中，細(xì)胞培養(yǎng)過夜貼壁后分別用20 μmol/L的辛伐他汀(辛伐他汀組)、10-7mol/L紫杉醇(紫杉醇組)及20 μmol/L辛伐他汀+10-7mol/L紫杉醇(聯(lián)合組)各100 μL處理細(xì)胞24、36、48 h。收集各組細(xì)胞及正常培養(yǎng)的A549/Taxol細(xì)胞(正常對照組)，調(diào)細(xì)胞密度為l×106/mL，PBS漂洗細(xì)胞2次，加入含RNA酶的碘化丙啶(PI)150 μL避光染色30 min，用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期，計(jì)算每個階段細(xì)胞所占的比例。

2 結(jié)果

2.1 辛伐他汀對A549/Taxol細(xì)胞增殖的影響 不同濃度的辛伐他汀處理后A549/Taxol細(xì)胞增殖抑制率見表1。隨辛伐他汀濃度的升高，增殖抑制率逐漸升高(P均<0.05)。相同濃度辛伐他汀分別處理A549/Taxol細(xì)胞24、36、48 h后，抑制率隨時間延長逐漸升高(P<0.01)。辛伐他汀對細(xì)胞株有明顯的抑制增殖作用，且呈劑量依賴性和時間依賴性。

表1 不同濃度辛伐他汀對A549/Taxol細(xì)胞增殖的影響

2.2 辛伐他汀聯(lián)合紫杉醇對A549/Taxol細(xì)胞增殖的影響 各組細(xì)胞培養(yǎng)24、48 h后細(xì)胞增殖抑制率見表2。紫杉醇組細(xì)胞培養(yǎng)48 h后細(xì)胞增殖更加活躍，證實(shí)A549/Taxol對紫杉醇耐藥。聯(lián)合組培養(yǎng)24、48 h后細(xì)胞增殖抑制率明顯高于紫杉醇組和辛伐他汀組(P均<0.05)。

表2 辛伐他汀聯(lián)合紫杉醇對A549/Taxol細(xì)胞增殖的影響

2.3 辛伐他汀聯(lián)合紫杉醇對A549/Taxol細(xì)胞細(xì)胞周期的影響 各組細(xì)胞培養(yǎng)24、36、48 h后細(xì)胞周期分布見表3。由表3可見，辛伐他汀組各時點(diǎn)G1期細(xì)胞比例較空白對照組升高、S期細(xì)胞比例較空白對照組降低(P均<0.05)，且隨培養(yǎng)時間延長G1期細(xì)胞比例逐漸升高、S期細(xì)胞比例逐漸降低(P均<0.05)。紫杉醇組各時點(diǎn)G1細(xì)胞比例與空白對照組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，S期細(xì)胞比例高于空白對照組(P均<0.05)。聯(lián)合組各時點(diǎn)G1期細(xì)胞比例較辛伐他汀組、紫杉醇組、空白對照組均升高、S期細(xì)胞比例較辛伐他汀組、紫杉醇組、空白對照組均下降(P均<0.05)。

表3 各組細(xì)胞培養(yǎng)24、36、48 h后細(xì)胞周期分布比較

3 討論

紫杉醇是NSCLC臨床治療的一線用藥。紫杉醇作用靶點(diǎn)是構(gòu)成細(xì)胞骨架的微管，主要通過促進(jìn)蛋白質(zhì)組裝成微管及阻止其解聚，將腫瘤細(xì)胞阻遏在G2期和M期，抑制有絲分裂，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞死亡。辛伐他汀結(jié)構(gòu)中具有羥甲基戊二酸的活性結(jié)構(gòu)，其作用靶點(diǎn)是羥甲基戊二酸單酰輔酶A(HMG-CoA)還原酶，是HMG-CoA還原酶抑制劑。HMG-CoA還原酶是膽固醇生物合成的主要限速酶，通過催化HMG-CoA合成甲羥戊酸(MVA)。Martinez等[5]證實(shí)洛伐他汀通過降低膽固醇合成抑制MVA途徑，誘導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞停滯于G1期而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。此效應(yīng)可因MVA和低密度脂蛋白(LDL)的加入而恢復(fù)細(xì)胞G1→S期的轉(zhuǎn)換。

本研究結(jié)果顯示，辛伐他汀具有抑制A549/Taxol腫瘤細(xì)胞增殖的作用，且呈濃度、時間依賴效應(yīng)。10-7mol/L紫杉醇A549/Taxol腫瘤細(xì)胞增殖無明顯影響。 20 μmol/L辛伐他汀聯(lián)合10-7mol/L紫杉醇組對A549/Taxol細(xì)胞增殖的抑制作用，較紫杉醇、辛伐他汀單藥抑制作用明顯。辛伐他汀可以阻滯耐紫杉醇A549細(xì)胞于G1期并且隨培養(yǎng)時間延長G1期細(xì)胞比例增加，提示辛伐他汀能夠克服紫杉醇耐藥。

Maksimova等[6]研究表明，他汀類藥物阻滯細(xì)胞于G1/S期的抗增殖作用，可能是通過提高細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑如p21及p27水平發(fā)揮作用的。Cemeus等[7]研究發(fā)他汀類藥物和吉非替尼兩藥聯(lián)用能夠克服NSCLC吉非替尼耐藥，其機(jī)制可能是減少甲羥戊酸產(chǎn)物，抑制腫瘤細(xì)胞增殖。Park等[8]發(fā)現(xiàn)他汀類藥物可增加伊立替康對NSCLC細(xì)胞A549和H460的細(xì)胞毒作用，通過提高細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑p21水平使細(xì)胞周期阻滯于G1期。辛伐他汀與培美曲塞聯(lián)用，可以進(jìn)一步激活惡性間皮瘤細(xì)胞和肺癌細(xì)胞Caspase-3、8、9的表達(dá)，增強(qiáng)Caspase家族介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，還可以通過提高促凋亡基因Bim、Puma，降低抑制凋亡基因Mcl-1、Bcl-xL的表達(dá)發(fā)揮促凋亡作用。兩者聯(lián)用還可以協(xié)同導(dǎo)致線粒體功能障礙[9]。本研究結(jié)果顯示，辛伐他汀聯(lián)合紫杉醇能克服人肺腺癌紫杉醇耐藥，但其具體作用機(jī)制及信號途徑仍需進(jìn)一步探討。我們將進(jìn)一步研究達(dá)到相同的腫瘤抑制作用時辛伐他汀能否降低紫杉醇的用量，以降低治療不良反應(yīng)，提高治療有效率。

[1] Ettinger DS． Ten years of progress in non-small cell lung cancer[J]. J Natl Compr Compr Cancnetw, 2012,10(3):292-295.

[2] Seve P, Dumontet C． Chemoresistance in non-small cell Lung cancer [J]． Curt Med ChemAntieancer Agents， 2005，5(1)：73-88.

[3] Boudreau DM， Yu O， Johnson J． Statin use and cancer risk: acomprehensive review[J]． Expert Opin Drug Saf， 2010，9(4):603-621.

[4] Khurana V， Bejjanki HR，Caldito G，et al． Statins reduce the risk of lung cancer in humans：a large case-control study of US veterans[J]. Chest，2007，131(5)：1282-1288．

[5] Martinez BJ， Ferruel AJ，Suarez Y， et al． Dose-dependent effects of lovastatin on cell cycle progression： distinct requirement of cholesterol and non-sterol mevalonate derivatives[J]．Biochim Biovhys Acta， 2001，1532(3)：185-194.

[6] Maksimova E, Yie TA, Rom WN. In vitro mechanisms of lovastatin on lung cancer cell lines as a potentialchemopreventive agent[J]. Lung, 2008,186(1):45-54.

[7] Cemeus C, Zhao TT, Barrett GM, et al. Lovastatin enhances gefitinib activity in glioblastoma cells irrespective of EGFRvⅢ and PTEN status[J]. Neurooncol, 2008,90(1):9-17.

[8] Park IH, Kim JY, Choi JY, et al. Simvastatin enhances irinotecan-induced apoptosis in human non-small cell lung cancer cells by inhibition of proteasome activity[J]. Invest New Drugs, 2011,29(5):883-890.

[9] Hwang KE, Kim YS, Hwang YR，et al. Enhanced apoptosis by pemetrexed and simvastatin in malignant mesothelioma and lung cancer cells by reactive oxygen species-dependent mitochondrial dysfunction and Bim induction[J]. Int J Oncol， 2014，45(4):1769-1777.

濟(jì)南市科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目( 2013022)。

10.3969/j.issn.1002-266X.2015.06.012

R734.2

B

1002-266X(2015)06-0034-03

2014-12-17)