急性期川崎病患兒外周血單個核細胞NF-κB、MMP-9表達變化及意義

談誠，韓勍，朱純亮，李喆倩，劉麗莎

(南京醫科大學附屬南京兒童醫院,南京 210008)

急性期川崎病患兒外周血單個核細胞NF-κB、MMP-9表達變化及意義

談誠，韓勍，朱純亮，李喆倩，劉麗莎

(南京醫科大學附屬南京兒童醫院,南京 210008)

目的 探討核細胞核因子-κB(NF-κB)和基質金屬蛋白酶9 (MMP-9) 在川崎病發生、發展中的作用及其機制。方法 研究對象為川崎病患兒21例(川崎病組)、呼吸道感染患者18例(陽性對照組)、正常查體者17例(正常對照組)。采用密度梯度離心法無菌分離各組外周血PBMCs自然培養，采用RT-PCR法和Westen blot法測定細胞中NF-κB p65 mRNA和蛋白，采用ELISA方法測定細胞上清液中MMP-9蛋白。將川崎病組外周血PBMCs體外培養并分為川崎病1、2、3組，川崎病1組繼續自然培養，川崎病2組加入終濃度為20 nmol/L的NF-κB激動劑PMA，川崎病3組同時加入PMA(濃度同上)及終濃度為100 μmol/L的NF-κB抑制劑 PDTC，孵育2 h后收集上清液和細胞，分別采用RT-PCR法和Westen blot法測定NF-κB p65 mRNA和蛋白表達，采用ELISA法測定細胞上清液中MMP-9蛋白水平。結果 川崎病組PBMCs中NF-κB p65 mRNA、蛋白及上清液MMP-9表達均高于陽性對照組和健康對照組(P均<0.05)。川崎病1、3組PBMCs中NF-κB p65蛋白及上清液中MMP-9表達水平均低于川崎病2組(P均<0.05)。結論 急性期川崎病患兒外周血PBMCs 中NF-κB和細胞上清液中MMP-9表達增強；二者可能參與了川崎病的發生發展過程。。

川崎病；核因子-κB；基質金屬蛋白酶9；外周血單個核細胞

川崎病又稱皮膚黏膜淋巴結綜合征(MCLS)，是一種好發于5歲以下兒童和嬰幼兒的急性全身性血管炎性疾病，是小兒后天性心臟病的主要病因[1]。目前川崎病的發病機理尚不清楚。文獻報道，多種因素參與其中，如單核巨噬細胞參與的免疫激活、一氧化氮參與的血管損傷、金屬基質蛋白酶的作用以及血管內皮功能紊亂和損傷等[2]。2013年1～6月，我們觀察了急性期川崎病患兒外周血單個核細胞(PBMCs) 中核因子κB(NF-κB)和細胞上清液中基質金屬蛋白酶9 (MMP-9)的表達及NF-κB抑制劑對二者表達的調節作用，現分析結果，探討NF-κB和MMP-9在川崎病發生發展中的作用及可能機制。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 研究對象為2013年1～6月收治的急性期川崎病患兒21例(川崎病組)，其中男13例、女8例，年齡3～6歲。均符合日本川崎病委員會修訂的診斷標準(1984年修訂第4版) ：①持續發熱5 d以上，抗生素治療無效；②四肢末端改變：初期手足硬性水腫，掌跖、指趾端發紅，后期指趾端甲床皮膚移行處出現膜樣蛻皮；③多形性皮疹；④雙眼球結膜充血；⑤口唇及口腔改變：口唇潮紅、楊梅舌、口腔及咽部彌漫潮紅；⑥急性非化膿性頸部淋巴結腫大。患兒就診前均未使用過免疫抑制劑或免疫調節劑, 并除外先天性或遺傳性疾病。選取同期上呼吸道感染患兒18例為陽性對照組，其中男11例、女7例，年齡3～6歲；另選取健康體檢正常兒童17例為健康對照組，其中男10例、女7例，年齡3～6歲。三組性別、年齡分布差異無統計學意義。本研究均取得患兒監護人書面知情同意。

1.2 PBMCs中NF-κB p65 mRNA、蛋白表達及細胞上清液MMP-9水平檢測 無菌采集各組外周靜脈血5 mL，采用密度梯度離心法分離PBMCs。用含10%胎牛血清的RPMI1640培養基調細胞濃度為106/mL，接種于24孔培養板內，每孔1 mL。采用RT-PCR法檢測NF-κB p65 mRNA，具體方法為：采用Trizol一步法抽提PBMCs的總RNA。具體步驟參照試劑盒說明書。用核酸定量儀測定總RNA含量和純度，分光光度計上測定A260/A280值為2.0～2.2。RNA行瓊脂糖電泳鑒定RNA完整性后應用于逆轉錄試驗。采用Westen blot法檢測NF-κB p65蛋白表達：收集各組PBMCs，取70 mL蛋白裂解液RIPA進行裂解。收集裂解產物12 000 g/min離心10 min，取上清并分裝，于-80 ℃保存。每組蛋白取20 g上樣于10%的SDS-PAGE膠，電泳2 h。用濕轉移的方法轉印到0.22 mm孔徑的PVDF膜上。室溫下置于5%BSA中封閉1 h；加入特異性的一抗，4 ℃過夜；TBST液漂洗3次，每次15 min，加入HRP標記的二抗，室溫孵育1 h。再用TBST漂洗3次，用ECL化學發光檢測。用移液槍吸取培養細胞上清液，采用ELISA 雙抗體夾心法檢測MMP-9 水平。步驟嚴格按說明書操作。

1.3 NF-κB抑制劑對川崎病患兒PBMCs中NF-κB及細胞上清液MMP-9表達影響的觀察 取川崎病組PBMCs接種于24孔板并分為川崎病1、2、3組。川崎病1組為空白對照組，常規培養；川崎病2組加入終濃度為20 nmol/L的NF-κB激動劑PMA；川崎病3組加入PMA(濃度同上)及終濃度為100 μmol/L的NF-κB抑制劑PDTC。培養2 h后采用1.2方法檢測各組PBMCs中NF-κB p65表達和MMP-9水平。

2 結果

川崎病組PBMCs中NF-κB p65 mRNA、蛋白及上清液MMP-9表達均高于陽性對照組和健康對照組，P均<0.05。見表1。川崎病2組PBMCs中NF-κB p65蛋白及上清液中MMP-9表達水平均高于川崎病1組(P均<0.05)；川崎病1、3組PBMCs中NF-κB p65蛋白及上清液中MMP-9表達水平均低于2組(P均<0.05)。見表2。

表1 各組PBMCs中NF-κB p65 mRNA、蛋白表達及細胞上清液MMP-9水平比較

注：與陽性對照組相比，*P<0.05；與健康對照組相比，#P<0.05。

表2 川崎病1、2、3組PBMCs中NF-κB p65和上清液中MMP-9表達比較

注：與川崎病1組相比，*P<0.05；與川崎病2組相比，#P<0.05。

3 討論

NF-κB是一種廣泛存在的轉錄因子，可在多種細胞中被激活，通過調節多種前炎性因子/趨化因子、黏附分子、生長因子等的表達，在應激反應、炎癥和免疫反應、細胞凋亡等過程中發揮重要的作用[3]。NF-κB是由兩種Rel家族蛋白組成的能與DNA結合的二聚體蛋白質，p65/p50異源二聚體是其最主要的組合形式。在靜息狀態下，NF-κB與其抑制因子IκB結合在一起，以無活性的NF-κB/IκB形式存在于細胞質中，在氧化劑(PMA等)、炎癥細胞因子等各種激動因素的作用下，IκB被磷酸化并水解，暴露出p50亞基的易位信號和p65亞基的DNA位點，從而使p50/p65異二聚體表現出NF-κB活性，NF-κB從細胞質中移入細胞核內，發揮基因轉錄的作用[4]。

MMPs是一組鋅離子(Zn2+)依賴性的內源性蛋白水解酶家族，可降解大部分細胞外基質成分，并參與炎性反應、缺血缺氧損傷、心血管和癌癥等的生理和病理過程[5]。MMP-9是MMPs 家族主要成員之一，來源于中性粒細胞、巨噬細胞、T淋巴細胞、B淋巴細胞、成纖維細胞、血管平滑肌細胞及心肌細胞等，可降解明膠、Ⅳ型膠原、Ⅴ型膠原、Ⅵ型膠原、纖維連接蛋白和彈性蛋白，在細胞外基質的降解和組織重建中起非常重要的作用[6]。

研究證實，NF-κB活化可能通過調節炎性因子、黏附分子等的表達參與川崎病血管炎性損傷的病理過程[7]。Ichiyama等[8]報道，急性期川崎病患兒外周血CD4陽性單核巨噬細胞和CD3陽性T細胞中均有NF-κB表達，在給予大劑量的丙種球蛋白治療后NF-κB表達明顯減弱。表明NF-κB作為始發炎癥反應的上游，活化后與相應靶基因結合，調控一系列炎性因子表達。 Gavin等[9]觀察了川崎病急性期死亡患兒的冠狀動脈瘤，發現受損冠狀動脈的組織結構完整性被破壞，彈力纖維層片狀斷裂，同時伴有炎細胞大量增殖浸潤，如中性粒細胞、血管平滑肌細胞等，MMP-9 在受損冠狀動脈全層及浸潤的炎細胞中高表達，而在無冠狀動脈病變的對照組未觀察到上述現象。另有研究表明急性期川崎病患兒血清中MMP-9表達上調[10]，其表達水平的動態變化對于冠狀動脈病變的早期診斷具有重要意義。

本研究結果顯示，川崎病患兒PBMCs在自然培養條件下有一定量NF-κB和MMP-9的表達，加入NF-κB激動劑PMA 后NF-κB表達和細胞培養上清液中MMP-9水平顯著增加；而同時加入NF-κB特異性抑制劑PDTC和PMA后NF-κB活化被顯著抑制，相應的MMP-9水平明顯降低。鑒于MMP-9基因的啟動子調控區有NF-κB 特異的結合位點[11]，筆者推測急性期川崎病的病理損傷可能由NF-κB的活化所介導，同時啟動和調節MMP-9的轉錄，最終導致炎性病理損傷。NF-κB可能作為始發炎癥反應的上游環節在介導川崎病血管免疫炎性損傷中起重要作用。

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Experimental study on the NF-κB-mediated matrix metalloproteinase-9 expression in peripheral blood mononuclear cells in patients with Kawasaki disease

TANCheng,HANQin,ZHUChun-liang,LIZhe-qian,LIULi-sha

(Children′sHospitalofNanjingMedicalUniversity,Nanjing210008,China)

Objective To explore the activation of nuclear factor-kappaB (NF-κB) and matrix metalloproteases 9(MMP-9) in peripheral blood mononuclear cells(PBMCs)in children with Kawasaki disease and the relationship between NF-κB and MMP-9. Methods PBMCs were isolated and purified from blood of fifty-six children including 21children with KD, 18 children with general inflammatory and 17 normal ones by density gradient centrifugation，and were cultured for one hour after cell concentration adjusted to 106/mL. Then both KD group and Control group were divided into three groups，the first group was cultured naturally, the second one was stimulated by phorbol 12-myristate 13-acetate(PMA), and the third one was stimulated by PMA and pyrrolidine dithiocarbamate (PDTC). PBMCs were cultured for 2 h. The mRNA and protein levels of NF-κB p65 in PBMCs in each groups were measured by RT-PCR and Western blot, and the protein levels of MMP-9 were measured by ELISA. Results The mRNA and protein levels of NF-κB p65 and MMP-9 in KD group were much higher than that in other groups; Stimulating PBMCs by PMA，the mRNA and protein levels of NF-κB p65 and MMP-9 were markedly increased in each group, and there was a significant difference in each group (P<0.05); Using PDTC can reduce the activation of NF-κB in PBMCs, and the protein levels of MMP-9 were significantly reduced by using PDTC in KD group. Conclusions The activity of NF-κB and MMP-9 in PBMCs in patients with acute KD is distinctly increased; The specific inhibitor of NF-κB can inhibit it's activation and the expression of MMP-9 obviously. It suggested that the NF-κB pathway can lead to the activation of MMP-9 in acute KD, and proper application of specific inhibitor of NF-κB may be a new choice for treating KD.

Kawasaki disease； nuclear factor-kappaB；matrix metalloproteases 9； peripheral blood mononuclear cells

談誠(1989-)，男，本科，住院醫師，研究方向為自身免疫病病理機制。E-mail:781769659@qq.com。

劉麗莎(1984-)，女，醫學碩士，住院醫師，研究方向為自身免疫病病理機制。E-mail:58065421@qq.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2015.06.004

R392.7；R34

A

1002-266X(2015)06-0011-03

2014-08-11)