異位子宮內膜組織間質細胞培養液中VEGF、sflt-1表達及意義

武生梅，史淑紅，李艷芳，李榮霞，李潔

(1赤城縣人民醫院，河北張家口075500；2河北醫科大學第二醫院；3河北中醫學院)

異位子宮內膜組織間質細胞培養液中VEGF、sflt-1表達及意義

武生梅1，史淑紅2，李艷芳2，李榮霞2，李潔3

(1赤城縣人民醫院，河北張家口075500；2河北醫科大學第二醫院；3河北中醫學院)

目的 探討VEGF及其受體在子宮內膜異位癥(EMs)發生中的作用。方法 采用細胞原代培養技術培養48例子宮內膜異位癥患者(異位癥組)在位、異位子宮內膜細胞及30例無子宮內膜異位癥患者(對照組)子宮內膜細胞，檢測其細胞培養液中VEGF及其可溶性受體sflt-1表達；計算VEGF活性指數(VEGF/ sflt-1)。結果 異位癥組在位、異位細胞培養液VEGF、sflt-1水平及VEGF活性指數均高于對照組(P均<0.05)，在位及異位細胞培養液中VEGF、sflt-1水平及VEGF活性指數相比差異無統計學意義。結論 EMs患者子宮內膜組織sflt-1表達相對不足；此可能為EMs發生的原因之一。

子宮內膜異位癥；子宮內膜細胞原代培養；血管內皮生長因子；血管內皮生長因子可溶性受體

子宮內膜異位癥(EMs)是婦科最常見的疾病之一，其為良性疾病，但有惡性腫瘤的侵襲、轉移等行為，且發病機制復雜[1]。研究證實，EMs的發生發展離不開新生血管的形成，而VEGF為有強力的促血管生成因子。sflt-1(sVEGFR-1)為VEGF的受體之一，與VEGF有高度的親和力，其不具有酪氨酸激酶活性，為天然的VEGF抑制劑[2]。為探討其在EMs發生中的作用，我們于2013年5月～2014年2月進行了如下研究。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2011年6月～2012年6月在河北醫科大學第二醫院因EMs行腹腔鏡手術治療的48例患者，年齡20～48歲，術后病理證實為EMs，根據美國生育協會(R-AFs)分期標準，Ⅰ～Ⅱ期15例，Ⅲ～Ⅳ期33例。取得異位病灶48份，在位內膜32份，分別為異位組和在位組。選擇同期因卵巢良性腫瘤、宮頸病變、漿膜下肌瘤、輸卵管疾病等非內異癥原因接受子宮切除的患者以及接受宮腔鏡檢查的非EMs患者30例，為對照組，年齡32～48歲(子宮內膜為增生期18例、分泌期12例)，術后病理證實為正常的子宮內膜。兩組均月經規律(28～32 d)，未合并其他外科疾病，術前6個月未接受過激素類藥物治療，6個月內無妊娠及哺乳史。各組受試者年齡、BMI、孕次、產次、月經周期、經期天數差異均無統計學意義。

1.2 細胞原代培養 術中取得在位及異位子宮內膜組織標本后，迅速用無菌冰生理鹽水沖洗3遍，置入含有冰DMEM液無菌瓶中，30 min內送至實驗室。依照文獻[3～5]方法行間質細胞分離培養：將內膜組織剪碎，組織大小1 mm3，無菌生理鹽水沖洗2次，置入燒杯，加入胰蛋白酶液。于5%CO2、37 ℃、飽和濕度培養箱中消化。2～3 h后加入含15%的小牛血清培養液終止消化。將細胞懸液吹打均勻，加入緩沖液PBS 5 mL，550 r/min離心4 min，取上清，800 r/min離心4 min，去上清，PBS吹打清洗2～3次，800 r/min，離心4 min，去上清，加入細胞培養液，吹打為均勻的細胞懸液，置細胞培養瓶中，于5%CO2、37 ℃、飽和濕度培養箱中培養。24 h以后更換細胞培養液，倒置顯微鏡每天觀察細胞生長情況，隔日更換細胞培養液1次。在位組、異位組各有26、20例細胞原代培養成功。

1.3 細胞培養液中VEGF與sflt-1水平檢測 各組換液過程中收集細胞培養液及2次沖洗液，800 r/min離心4 min，取上清，記錄總體積，分別取3 mL，采用ELISA法測定游離VEGF和sflt-1水平，最終反應板在Bio-Rad 2250酶標檢測儀于450 nm處讀取光密度值，所測值按照標準曲線換算成VEGF及sflt-1水平。依據各組細胞液的體積及血細胞數(血細胞計數器測得)計算每105個細胞表達VEGF及sflt-1水平。VEGF/ sflt-1為VEGF活性指數。

2 結果

異位組在位、異位內膜細胞培養液中VEGF、sflt-1水平及VEGF活性指數均高于對照組(P均<0.05)，在位、異位內膜細胞培養液VEGF、sflt-1水平及VEGF活性指數相比差異無統計學意義。見表1。

表1 各組細胞培養液中VEGF、sflt-1表達比較

注：與對照組相比，*P<0.01。

3 討論

EMs是一種婦科常見病，可以導致不孕、性交痛，是多年來婦科領域中的研究熱點。子宮內膜細胞原代體外培養是目前研究EMs的常用方法，細胞離開機體時間較短，可以更好的反映疾病的特點，且無倫理問題。子宮內膜細胞分為腺細胞和間質細胞，其中腺細胞的體外培養較困難，幾乎不能完成傳代，故傳代后的子宮內膜細胞大多為子宮內膜間質細胞。

有報道，EMs患者的在位子宮內膜血管形成活性明顯增強，存在血管異常增生現象[6]；EMs是一種血管依賴性疾病，VEGF在血管發生和形成中起著中樞性的調節作用，是最關鍵的血管形成刺激因子[7～9]。子宮內膜的血管形成受到促血管生成因子和抗血管生成因子共同調控，其平衡被打破會導致疾病的發生，例如月經過多和EMs[10]。本課題組前期研究證實VEGF及sflt-1在在位子宮內膜及異位子宮內膜中表達與對照組相比存在顯著差異。本研究結果顯示，EMs患者在位內膜及異位內膜細胞培養液中VEGF及sflt-1的表達及VEGF活性指數均較對照組升高。表明EMs患者在位及異位子宮內膜組織sflt-1表達相對不足，使血管生成調節平衡中抑制血管生成的作用降低，促血管生成作用相對占優勢，促進了EMs疾病發生發展中的血管生成，為異位子宮內膜細胞黏附后的種植、病灶形成提供了條件。

sflt-1為VEGF的天然抗體之一，其抗血管生成作用已被臨床證實，且在腫瘤[11]、子癇前期[12～16]、習慣性流產[17]等疾病診治的相關研究中取得一定進展。EMs為一種血管依賴性疾病，抗血管形成為其治療思路。本研究結果及我們的前期研究均證實，sflt-1在EMs患者血液、腹腔液、組織、細胞培養液中表達均相對不足，因此用sflt-1作為抗血管形成治療靶點治療EMs應該是有臨床價值的。但確切效果尚需進一步研究證實。

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河北省科技計劃項目(12277740)。

史淑紅

10.3969/j.issn.1002-266X.2015.06.014

R711.5

B

1002-266X(2015)06-0040-02

2014-11-16)