黃酮類化合物對耐藥金黃葡萄球菌mecA基因的影響①

劉立新，高月林，張羽男，張楠楠

(1.黑龍江省教育廳生物藥制劑重點實驗室，佳木斯大學藥學院，黑龍江 佳木斯 154007；2.黑龍江農業職業技術學院，黑龍江 佳木斯 154007)

黃酮類化合物對耐藥金黃葡萄球菌mecA基因的影響①

劉立新1，高月林2，張羽男1，張楠楠1

(1.黑龍江省教育廳生物藥制劑重點實驗室，佳木斯大學藥學院，黑龍江 佳木斯 154007；2.黑龍江農業職業技術學院，黑龍江 佳木斯 154007)

目的:研究黃酮類化合物對人工誘導的耐藥金黃葡萄球菌的耐藥基因mecA的mRNA表達水平的影響。方法:采用紙片法測定黃酮類化合物對耐藥金黃葡萄球菌的逆轉作用；利用RT-PCR法測定耐藥基因mecA的相對表達量。結果:耐藥金黃葡萄球菌分別被蘆丁、姜黃素、木犀草素、槲皮素和芹菜素作用后，耐藥基因mecA的相對表達量分別為0.55，0.79，0.76，0.92，和0.84。結論:黃酮類化合物能降低金黃葡萄球菌的耐藥基因mecA的表達，能對抗金黃葡萄球菌的耐藥性。

黃酮類化合物；金黃葡萄球菌；耐藥基因

近年來，由于抗生素的廣泛應用及不合理使用，導致臨床上常見的一些病原菌產生嚴重的耐藥性，且其耐藥水平不斷提高，并出現了多重耐藥菌株，這給人類和動物的健康帶來極大的危脅，耐藥菌感染已成為目前醫學領域面臨的一大挑戰。因此，研制和發現逆轉細菌耐藥性的藥物成為醫藥學研究領域刻不容緩的問題之一。 許多研究發現[1]，一些中藥能不同程度地逆轉細菌的耐藥性，提高細菌對抗生素的敏感性。目前，對于中藥耐藥抑制劑的研究主要集中于復方制劑或單方中藥上，而對于中藥有效成分逆轉細菌耐藥性機制方面研究的較少。在本實驗中，主要應用體外抑菌試驗篩選對耐藥金黃色葡萄球菌有抑菌作用的黃酮類化合物，通過測定其耐藥基因相對表達量的多少，從而探討黃酮類化合物逆轉金黃葡萄球菌耐藥性的分子機制，為研究開發作用效果好，毒副作用小的新型細菌耐藥抑制劑提供科學的理論依據。

1 材料、試劑和方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

質控菌株：金黃葡萄球菌ATCC2592，由佳木斯大學生命學院饋贈。

1.1.2 藥物

蘆丁、姜黃素、槲皮素、木犀草素、芹菜素購自佳木斯市廣源化玻批發部。克拉維酸(北京華業寰宇化工有限公司)。

1.1.3 試劑

瓊脂糖粉、水解酪蛋白、牛肉浸膏、胰蛋白胨和MH培養基均購自北京奧博星生物技術責任有限公司。TRIzol(Invitrogen公司)，Prime ScriptTM RT reagent Kit(TaKaRa公司)。

1.1.4 儀器

SW-CJ-2DD單人雙面凈化工作臺(蘇州凈化設備有限公司)，PYX-DH450電熱恒溫培養箱(上海璽恒實業有限公司)，HZQ-A恒溫培養搖床(HZQ-A恒溫培養搖床)，Applied Biosystems 7300 Real-Time PCR System(Applied Biosystems，USA)。

1.2 方法

1.2.1 耐藥菌株的誘導及鑒定

1.2.1.1 細菌的培養及最小抑菌濃度(MIC值)的測定

將細菌接種于平板培養基上，待長出菌落后，挑出單個菌落接種于2mL M-H培養液，37℃恒溫震蕩培養4～6h，使其生長濁度達9×108個mL-1。放入4 ℃冰箱備用。MIC值的測定采用試管二倍稀釋法[2]。

1.2.1.2 耐藥菌株的誘導

耐藥菌株的誘導方法參考文獻[3]：將過夜生長的細菌培養液接種于含1/2MIC青霉素的M-H瓊脂培養基，37℃恒溫培養12～16h，挑取單個菌落接種于M-H培養液，恒溫培養12～16h，然后將菌液接種于含1×MIC青霉素的M-H瓊脂培養基，恒溫培養12～16h，依此類推，逐漸將M-H瓊脂培養液中的藥物濃度提高，直至細菌的MIC值提高至≥256倍。

1.2.1.3 耐藥菌株鑒定

將自行誘導的耐藥菌株均接種于平板培養基上，24h后，挑取單個菌落接種于M-H培養液，37℃恒溫震蕩培養4～6h，使其生長濁度達9×108個mL-1。將菌液接種到M-H瓊脂培養平板上，然后貼上1μg青霉素紙片，37℃恒溫培養24h后觀察結果。

1.2.1.4 生物學鑒定

按全國臨床檢驗操作規程進行[4]。

1.2.2 逆轉耐藥性實驗

1.2.2.1 最低抑菌濃度(MIC值)的測定

測定方法參考文獻[2]。

1.2.2.2 藥敏試驗

分別將蘆丁、姜黃素、槲皮素、木犀草素、芹菜素配制成低于MIC值的藥液，挑取耐藥金黃葡萄球菌菌株于各濃度藥液中，37℃恒溫培養時間12～18h后，將菌液接種于平板培養基上，繼續37℃恒溫培養時間12～18h后，挑取單個菌落制成菌液，用無菌棉簽蘸取菌液均勻地涂布在M-H平板培養基上，待菌液稍干貼上青霉素藥敏紙片，同時設立不加藥物的耐藥金黃葡萄球菌組，敏感菌組和，經克拉維酸處理的耐藥金黃葡萄球菌組。

1.2.3 qRT-PCR法檢測mecA的mRNA水平

1.2.3.1 RNA的提取

按1.2.2.2方法將受試菌液處理后，將所有實驗菌株按照經典的TRIZOL法提取總RNA[5]。

1.2.3.2 RNA的反轉錄成cDNA

采用Fermentas公司的反轉錄酶進行反轉錄，反轉錄體系見表1。

表1 反轉錄反應體系

體系中最后加入M-MuLV，先混勻其他的反應物，37℃水浴5～10min，然后加入反轉錄酶，再混勻后，40℃水浴1h，75℃ 10min，最后放置冰浴3min,即為模板cDNA。

1.2.3.3 mRNA檢測

應用7300 Real-Time PCR System 和SYBR Premix Ex TaqTM試劑盒進行熒光定量RT-PCR反應。反應體系為20μL，冰上配制反應液，反應液組成見表2，所用引物序列為：上游引物mecAF：5’ GTAGAAATGACTGAACGTCCGATAA 3’；下游引物mecAR：5’ CCAATTCCACATTGTTTCCGTCTAA 3’。

表2 實時熒光定量PCR反應液組成

PCR反應條件為：95℃，30s；預變性，95℃，5s；60℃，31s；循環40次。

實時熒光定量RT-PCR所測得各基因的CT值同內參基因β-actin的CT值相比較， 計算該基因的相對表達量，所用計算公式為：相對表達量=2-ΔΔCT其中 ΔCT=ΔCTNΔCTβ-actin(N為目的基因)

2 結果

2.1 耐藥菌株的體外誘導及鑒定結果

經不濃度的青霉素梯度處理經過88次傳代，成功地獲得了大于256×MIC耐藥菌株。體外誘導的耐藥菌株的鑒定結果見表3，表4。

表3 耐藥菌的藥敏實驗結果

表4 不同菌株生化鑒定結果

藥敏實驗表明體外誘導的耐藥菌株的菌株抑菌環結果都小于10mm，生物學鑒定血漿凝固酶陽性，V-P陽性，麥芽糖、甘露醇產酸，DNA酶陽性，鑒定結果為具有耐藥性的金黃葡萄球菌菌株。

2.2 藥敏試驗結果

將各黃酮類化合物配制成低于MIC值濃度，分別為：蘆丁0.2 mg·mL-1，姜黃素0.2mg·mL-1，槲皮素0.45mg·mL-1，木犀草素0.45mg·mL-1，芹菜素0.35mg·mL-1，分別和耐藥金黃葡萄球菌作用24h后藥敏試驗結果見，圖1。結果可見，蘆丁、姜黃素和槲皮素組與耐藥菌對照組相比抑菌環直徑差異顯著(*P<0.05)；并且蘆丁與耐藥菌對照組相比，差異極顯著(**P<0.01)，說明逆轉金黃葡萄球菌耐藥性效果較好；與其他各黃酮類化合物組別效果不顯著(P>0.05)。

圖1 黃酮類化合物對耐藥菌的影響 表5 藥敏實驗結果

組別抑菌環直(mm)組別抑菌環直徑(mm)耐藥金黃葡萄球菌組9.12±1.03蘆 丁16.32±1.12*敏感菌組22.38±1.25**姜黃素12.9±2.10*經克拉維酸組18.29±1.09**木犀草素10.2±1.10槲皮素13.22±1.06*芹菜素9.37±1.53

注：*P<0.05，**P<0.01與耐藥菌對照組相比。

2.3 mecA的mRNA的表達

將蘆丁、姜黃素、槲皮素、木犀草素和芹菜素分別配制成低于MIC值的藥液，取2mL藥液分別盛于5個試管中，并取挑取耐藥金黃葡萄球菌接種于各試管中，37℃恒溫培養時間24h后，提取總RNA，熒光定量RT-PCR分析耐藥基因mRNA的表達變化。如圖2所示，經黃酮類化合物培養的耐藥金黃葡萄球菌耐藥基因mecA的mRNA的相對表達量降低，蘆丁、姜黃素、槲皮素分別將與對照組相比差異顯著(P<0.05)，且蘆丁與對照組相比差異極顯著(P<0.01)。

圖2 黃酮類化合物對mecA的mRNA的表達的影響 表6 mecA的mRNA的表達

組別mRNA的相對水平組別mRNA的相對水平耐藥金黃葡萄球菌組1.00±0.03姜黃素0.76±0.12經克拉維酸組0.32±0.05**木犀草素0.92±0.10槲皮素0.79±0.09芹菜素0.84±0.11蘆 丁0.55±0.06**

注：*P<0.05，**P<0.01與耐藥菌對照組相比。

3 結論

金黃色葡萄球菌是臨床上常見的致病性較強的細菌，自從青霉素問世后，金黃色葡萄球菌引起的感染性疾病受到較大的控制，但隨著青霉素的大量和廣泛使用，一些金黃色葡萄球菌產生了耐藥性。耐藥的金黃色葡萄球菌已成醫院感染的重要病原菌之一[6]。我國中藥資源豐富，有著很大的潛力和廣闊的應用前景。中藥由于具有有效成分多，毒副作用小，殘留少、作用靶位多、作用范圍廣以及不易產生耐藥性等優點，已成為研究者們篩選耐藥抑制劑的最佳選擇，為解決細菌耐藥性難題開辟了捷徑。本課題選取不同的黃酮類化合物為受試對象進行研究。結果發現將耐藥金黃葡萄球菌經過黃酮類化合物處理陪養24h后，耐藥基因mecA的相對表達量降低了，并且對抗生素的敏感性提高了，尤其以蘆丁的效果更明顯。結果表明黃酮類化合物能對抗細菌的耐藥性。

[1]秦睿嶺,徐占云,李春紅,等.抗耐藥菌中藥的研究進展[J].養禽與禽病防治,2010,3:3-4

[2]劉立新,高月林,王朝興,等. 黃酮化合物對金黃葡萄球菌β-內酰胺酶活性的影響[J].東北農業大學學報，2013,44(3):119-122

[3]曲鵬.AcrAB外輸泵介導的雞沙門氏菌耐藥性研究[D]. 2008,東北農業大學

[4]李春玲,丁永坤,王懷兵. 醫院內感染耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的鑒定及耐藥性調查[J]. 職業與健康,2003,29(5):42

[5]Gomez MI,Lee A,Reddy B，et al.Staphylococcus aureus Protein A induces airway epithelial inflammatory responses by activating T NFR1 Nat[J].Med，2004，10：842-848

[6]李宏,郭麗曼,姜振環,等.我院多重耐藥菌感染監測與預防控制措施[J].黑龍江醫藥科學，2012,35(2)：90-91

The effects of flavonoids on mecA gene of Drug-resistant staphylococcus aureus

LIULi-xin1,GAOYue-lin2,ZHANGYu-nan1,ZHANGNan-nan1

(1.The Key Laboratory for Biological Drug of the Education Department Heilongjiang, College of Pharmacy, Jiamusi University, Jiamusi 154007, China; 2. Heilongjiang Agricultural Vocational and Technical College, Jiamusi 154007, China)

Objective: To study the effects of flavonoids on the expression levels of mecA of Drug-resistant staphylococcus aureus. Methods: The reversal effects of drug-resistant staphylococcus aureus were determined by K-B paper methods. The expression levels of mecA were determined by RT-PCR method. Results: Rutin, curcumin,luteolin, quercetin and celery were acted on staphylococcus aureus, respectively which showed that the expression levels of mecA were 0.55，0.79，0.76 ，0.92 and 0.84. Conclusion: Flavonoids can reduce the meca gene expression of drug-resistance Staphylococcus aureus, and it can compete against drug resistance of Staphylococcus aureus.

flavonoids;staphylococcus aureus; Drug-resistant gene

黑龍江省教育廳科學技術研究項目，編號：12521560。

劉立新(1978～)女，黑龍江佳木斯人，在讀博士研究生，講師。

R378.1+1

A

1008-0104(2015)01-0004-03

2014-09-09)