骨髓單個(gè)核細(xì)胞移植對(duì)大鼠脊髓全橫斷損傷后髓鞘堿性蛋白表達(dá)影響①

季慶輝，申福國(guó)，孔維麗，楊建華，崔宏宇，喬建民

(佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 佳木斯 154003)

骨髓單個(gè)核細(xì)胞移植對(duì)大鼠脊髓全橫斷損傷后髓鞘堿性蛋白表達(dá)影響①

季慶輝，申福國(guó)，孔維麗，楊建華，崔宏宇，喬建民

(佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 佳木斯 154003)

目的：探討同種異體骨髓單個(gè)核細(xì)胞(BMMNCs)移植對(duì)脊髓全橫斷損傷區(qū)局部微環(huán)境中髓鞘堿性蛋白表達(dá)的影響。方法：取8 周齡Wistar大鼠45只，雌雄不限、每只體重200～220g，隨機(jī)分為3組:實(shí)驗(yàn)組(n=15)、對(duì)照組(n=15)、假手術(shù)組(n=15)。對(duì)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組大鼠建立脊髓全橫斷損傷動(dòng)物模型。實(shí)驗(yàn)組造模后對(duì)脊髓橫斷處上下兩端立即注入骨髓單個(gè)核細(xì)胞；對(duì)照組對(duì)脊髓橫斷處上下兩端注入磷酸鹽緩沖液(PBS)；假手術(shù)組不損傷脊髓，僅剪除T8～10棘突和椎板后逐層縫合。于細(xì)胞移植后的1d，5d,1w,2w，4w 和6w分別行BBB大鼠后肢功能評(píng)估來(lái)判斷脊髓神經(jīng)功能恢復(fù)情況，并采用免疫組織化學(xué)檢測(cè)觀察大鼠脊髓髓鞘堿性蛋白的表達(dá)。結(jié)果：(1)BBB評(píng)分結(jié)果顯示各時(shí)間點(diǎn)假手術(shù)組均為正常范圍，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組分值隨時(shí)間均逐漸增加，且實(shí)驗(yàn)組較對(duì)照組高(P<0.05)，但均未達(dá)到正常組水平，術(shù)后4周實(shí)驗(yàn)組BBB評(píng)分較對(duì)照組增加顯著，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；(2)免疫組織染色結(jié)果顯示各時(shí)間點(diǎn)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組大鼠脊髓中髓鞘堿性蛋白的表達(dá)量高于假手術(shù)組，且實(shí)驗(yàn)組高于對(duì)照組(P<0.05)。結(jié)論：同種異體的骨髓單個(gè)核細(xì)胞移植可能改變了局部的微環(huán)境并上調(diào)了脊髓內(nèi)髓鞘堿性蛋白的表達(dá)。

骨髓單個(gè)核細(xì)胞；細(xì)胞移植；脊髓橫斷損傷；髓鞘堿性蛋白

脊髓損傷(spinal cord injury,SCI)是全球公認(rèn)的給患者及家庭帶來(lái)巨大傷害的疾病之一。因其發(fā)病率高、損傷具有不可逆性改變、治愈率低、截癱率高，給患者及家庭帶來(lái)巨大的心里壓力和經(jīng)濟(jì)上的負(fù)擔(dān)。脊髓功能的恢復(fù)仍是目前面臨的巨大難題，然而動(dòng)物實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)骨髓單個(gè)核細(xì)胞(bone marrow mononuclear cells, BMMNCs)的移植對(duì)脊髓損傷的治療取得了一定的效果[1,2]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)BMMNCs移植脊髓全橫斷模型大鼠，觀察對(duì)大鼠后肢功能及受損脊髓組織微環(huán)境中髓鞘堿性蛋白(myelin basic protein，MBP)變化，初步探討骨髓單個(gè)核細(xì)胞對(duì)治療全橫斷脊髓大鼠神經(jīng)功能恢復(fù)的分子機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及其分組

取45只8周齡Wistar大鼠(清潔級(jí)，由大連實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)，體重200～220g，雌雄不限。按照隨機(jī)數(shù)表法隨機(jī)分為:實(shí)驗(yàn)組(n=15)、對(duì)照組(n=15)、假手術(shù)組(n=15)。實(shí)驗(yàn)中對(duì)動(dòng)物的處置符合我國(guó)相關(guān)倫理學(xué)規(guī)定[3]。動(dòng)物在(23±2)℃飼養(yǎng)室飼養(yǎng)。

1.2 實(shí)驗(yàn)主要試劑和儀器

SABC試劑盒，MBP克隆抗體，BSA封閉液 (武漢博士得)；DAB顯色系統(tǒng)(北京中杉金橋)；恒溫冰凍切片機(jī)CM1900(德國(guó)LEICA)；臺(tái)式離心機(jī)(美國(guó)Sigma)。

1.3 骨髓單個(gè)核細(xì)胞的分離、純化

大鼠用10%水合氯醛(0.3mL/100g)腹腔注射麻醉，碘伏、酒精溶液常規(guī)消毒。切除大鼠股骨、脛骨，用5%肝素生理鹽水混合液沖洗骨髓腔, 將懸浮液進(jìn)行1500r/min、離心10min，棄去上清液。用2mL PBS稀釋，放置在含有2mL淋巴細(xì)胞分離液的離心管中，2000r/min、離心20min，吸取白色界面層, 用2mL的PBS洗滌兩次，離心10min、1000r/min。由此得到的懸液保存在DMEM培養(yǎng)基中，并將細(xì)胞濃度調(diào)節(jié)到6×108mL-1。臺(tái)盼藍(lán)檢測(cè)細(xì)胞活性在90%以上，4℃保存，2h內(nèi)移植。

1.4 脊髓損傷動(dòng)物模型的制作及骨髓單個(gè)核細(xì)胞細(xì)胞移植

參照楊建華[4]脊髓全橫斷模型建模：將實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組大鼠腹腔麻醉(10%水合氯醛0.3mL/100g)成功后固定于無(wú)菌操作臺(tái)，定位T9脊髓棘突并作標(biāo)記，術(shù)區(qū)常規(guī)消毒3遍，在標(biāo)記上下行正中切口長(zhǎng)約2.0，使椎骨暴露，咬除相應(yīng)棘突、椎板，借助顯微外科剪在T9節(jié)段打開(kāi)椎管，直至完全暴露脊髓組織，用自制脊髓橫斷刀(取剃須刀片刀刃部長(zhǎng)約3cm寬約0.5cm)迅速、輕柔、完全離斷脊髓，大量生理鹽水沖洗，逐層縫合，常規(guī)消毒，脊髓損傷模型制備完成。術(shù)后給予腹腔內(nèi)青霉素注射防感染，早晚擠壓、按摩腹腔輔助排便、排尿。

實(shí)驗(yàn)組造模過(guò)程中在脊髓橫斷處上下兩端各注射15μL 濃度為6×108L-1的BMMNCs懸液；對(duì)照組造模過(guò)程中在脊髓橫斷處上下兩端各注射15μL PBS緩沖液；假手術(shù)組只咬除對(duì)應(yīng)的棘突、椎板，不損傷脊髓，然后逐層縫合。

1.5 運(yùn)動(dòng)功能評(píng)估

各組動(dòng)物分別在SCI后1d、5d、1w、2w、4w和6w后，隨機(jī)每組抽取5只大鼠進(jìn)行BBB評(píng)分。為避免對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果影響，每次評(píng)分前都會(huì)協(xié)助大鼠排空尿液、糞便，并且分別由兩人同時(shí)獨(dú)立進(jìn)行BBB評(píng)分。參照BBB評(píng)分[5]項(xiàng)目表，仔細(xì)觀察大鼠雙側(cè)后肢的運(yùn)動(dòng)功能并分別對(duì)大鼠的左、右后肢進(jìn)行運(yùn)動(dòng)功能評(píng)分。每只大鼠嚴(yán)格按照標(biāo)準(zhǔn)評(píng)分3次，最后取其平均值。

1.6 組織學(xué)和免疫組化分析

到達(dá)各時(shí)間點(diǎn)后處死大鼠，取材、切片常規(guī)脫蠟水化、3% H2O2處理，微波修復(fù)抗原，分別滴加一抗：兔抗鼠髓鞘堿性蛋白多克隆抗體，4℃過(guò)夜后分別滴加生物素化山羊抗兔IgG，在37℃孵育30min，加SABC工作液，DAB顯色，蘇木素染色，封片觀察。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 功能評(píng)估

2.1.1 術(shù)后動(dòng)物一般情況

所有大鼠均能耐受手術(shù)，手術(shù)后前幾天飲水及進(jìn)食食物較少，此后飲食逐漸恢復(fù)至正常水平。術(shù)后出現(xiàn)切口感染1例，未見(jiàn)血尿、下肢潰瘍等并發(fā)癥出現(xiàn)，偶爾可見(jiàn)術(shù)后大鼠間的相互攻擊。術(shù)后積極防治并發(fā)癥，感染的大鼠給予加大青霉素劑量及術(shù)后感染切口每日換藥；術(shù)后尿潴留大鼠，每天早晚各一次按摩、擠壓膀胱協(xié)助排尿，直至完全恢復(fù)；術(shù)后死亡1例。

2.1.2 脊髓神經(jīng)功能評(píng)價(jià)

參照BBB評(píng)分[5]標(biāo)準(zhǔn)要求嚴(yán)格進(jìn)行評(píng)分，所有大鼠均在實(shí)驗(yàn)前進(jìn)行BBB雙后肢運(yùn)動(dòng)功能評(píng)分，且全為滿分21分，均符合實(shí)驗(yàn)要求。實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組大鼠在脊髓全橫斷術(shù)后1d雙側(cè)后肢運(yùn)動(dòng)功能均完全喪失，雙側(cè)下肢均呈拖行狀態(tài)，5d后雙側(cè)下肢的運(yùn)動(dòng)功能開(kāi)始逐漸恢復(fù)，但是各組未見(jiàn)明顯的差異；2w后實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組出現(xiàn)了輕微的髖、膝關(guān)節(jié)主動(dòng)運(yùn)動(dòng)，但是實(shí)驗(yàn)組評(píng)分結(jié)果較對(duì)照組稍高但差別不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；4W后上述兩組出現(xiàn)了髖、膝關(guān)節(jié)明顯的主動(dòng)運(yùn)動(dòng)，踝關(guān)節(jié)輕微運(yùn)動(dòng)，實(shí)驗(yàn)組較對(duì)照評(píng)分結(jié)果高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表1。

時(shí)間組別 1d5d1w2w4w6w假手術(shù)組21.00±0.0021.00±0.0021.00±0.0021.00±0.0021.00±0.0021.00±0.00對(duì)照組0.00±0.000.15±0.781.62±0.40a2.10±0.10a3.30±0.58a4.25±0.31a實(shí)驗(yàn)組0.00±0.001.90±0.743.90±0.49ab5.80±0.69ab7.23±0.58ab8.10±0.50ab

注：與假手術(shù)組比較，aP<0.05；與對(duì)照組比較，bP<0.01。

2.2 組織學(xué)和免疫組化染色結(jié)果

MBP蛋白免疫組織化學(xué)染色(圖1～3)發(fā)現(xiàn)，4周后在實(shí)驗(yàn)組脊髓損傷處發(fā)現(xiàn)有些細(xì)胞的核呈棕紫色陽(yáng)性，對(duì)照組呈棕色的細(xì)胞明顯少或無(wú)，表明移植的骨髓單個(gè)核細(xì)胞在宿主體內(nèi)已有向髓鞘細(xì)胞方向分化的趨勢(shì)，實(shí)驗(yàn)組在BMMNCs治療作用下脫髓鞘的軸突髓鞘再生明顯。

圖1～3：1假手術(shù)組、2實(shí)驗(yàn)組、3對(duì)照組，術(shù)后4周MBP免疫組織化學(xué)染色(×400)

3 討論

近些年來(lái)有關(guān)干細(xì)胞移植的方法來(lái)治療急性脊髓損傷修復(fù)的研究一直是神經(jīng)-生物科學(xué)領(lǐng)域的熱點(diǎn)，倍受基礎(chǔ)和臨床科研工作者的青睞。目前大量動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究均已經(jīng)證實(shí)BMMNCs[2]能對(duì)脊髓損傷有一定的修復(fù)作用。BMMNCs因提取簡(jiǎn)單而且不必進(jìn)行培養(yǎng)非常適合進(jìn)行移植治療，為大鼠移植治療SCI提供新的種子細(xì)胞。BMMNCs具有自我更新、分化的潛能，并且還能釋放某些細(xì)胞因子促進(jìn)神經(jīng)和血管再生[6,7]，并促進(jìn)脊髓功能的恢復(fù)，然而在體內(nèi)恢復(fù)機(jī)制很復(fù)雜，目前仍不明確。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)BMMNCs移植并觀察脊髓損傷區(qū)附近微環(huán)境中髓鞘堿性蛋白表達(dá)，免疫組織化結(jié)果均表明受損傷大鼠脊髓的神經(jīng)功能恢復(fù)與髓鞘堿性蛋白表達(dá)有一定的相關(guān)性。

脊髓組織損傷后可使損傷組織分泌相應(yīng)的神經(jīng)化學(xué)物質(zhì)、增加了微血管通透性和周圍組織的水腫等一系列的病理生理改變，這種病理生理變化必然導(dǎo)致?lián)p傷后脊髓組織自身成分的改變，這其中也包括中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)中髓鞘的主要組成成分-髓鞘堿性蛋白(MBP)變化。MBP是CNS髓鞘的主要結(jié)構(gòu)蛋白[8]，是維持神經(jīng)元髓鞘結(jié)構(gòu)和功能穩(wěn)定的重要物質(zhì)基礎(chǔ)，其主要生理功能是通過(guò)與髓鞘膜帶負(fù)電荷的磷脂在髓鞘漿膜面的相互作用，促使少突膠質(zhì)細(xì)胞質(zhì)面融合而成多層膜結(jié)構(gòu)的主要致密線維持鞘的緊密性，而且在髓鞘形成過(guò)程中具有啟動(dòng)作用。Olesson Y[9]等研究發(fā)現(xiàn)在大鼠脊髓損傷模型中通過(guò)免疫組織化學(xué)的方法觀察到在脊髓損傷組織中許多神經(jīng)細(xì)胞體皺縮并且組織呈海綿狀水腫表現(xiàn), 其內(nèi)存在一個(gè)膠質(zhì)細(xì)胞原纖維酸性蛋白免疫應(yīng)答的顯著增加和MBP染色的明顯減少，其丟失的髓鞘堿性蛋白進(jìn)入腦脊液中,脊髓損傷后損傷部位的缺血及炎癥和免疫反應(yīng)可導(dǎo)致血脊髓屏障的破壞,使其毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞間隙增寬,血管壁連接松散,血脊髓屏障的通透性增加, 此破壞并不局限于損傷部位且向損傷部位的周邊區(qū)域擴(kuò)散[10]。

在本實(shí)驗(yàn)研究中，移植BMMNCs的大鼠后肢運(yùn)動(dòng)功能從2周起明顯優(yōu)于對(duì)照組。第6周后的大鼠的HE染色顯示明顯愈合和組織形態(tài)修復(fù)完好。用髓鞘堿性蛋白免疫組化顯示陽(yáng)性髓鞘細(xì)胞增多及部分運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元中突觸蛋白光密度增加。并且實(shí)驗(yàn)組的BBB評(píng)分中明顯優(yōu)于對(duì)照組，且有大量的髓鞘陽(yáng)性細(xì)胞個(gè)數(shù)增加，可能是促進(jìn)內(nèi)源性修復(fù)機(jī)制之一，這種機(jī)制與BMMNCs的移植呈高度相關(guān)性。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)組織學(xué)和免疫組化檢測(cè)等方法，發(fā)現(xiàn)BMMNCs能在脊髓損傷環(huán)境中存活，6周后依然能夠檢測(cè)到，而且有效促進(jìn)了截癱的大鼠后肢功能恢復(fù)。并且發(fā)現(xiàn)，在宿主存活的單個(gè)核細(xì)胞不僅促進(jìn)了髓鞘的修復(fù)，而且提高的髓鞘細(xì)胞的量隨周期的延長(zhǎng)有逐漸增加的趨勢(shì)，6周時(shí)增加的量與對(duì)照組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。脊髓損傷的恢復(fù)行為學(xué)測(cè)試表明實(shí)驗(yàn)組的后肢運(yùn)動(dòng)功能較對(duì)照組大鼠恢復(fù)明顯，所有大鼠在脊髓損傷前BBB評(píng)分為21，術(shù)后1d～6w每個(gè)時(shí)間點(diǎn)BBB評(píng)分移植組均高于對(duì)照組。骨髓單個(gè)核細(xì)胞移植能促進(jìn)大鼠的后肢運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)，于Chopp[11]等研究發(fā)現(xiàn)移植人MSC細(xì)胞相似。另外本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn), BMMNCs移植后6周的行為學(xué)觀察，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組大鼠的后肢功能均有所改善，但前者明顯比后者好。這一現(xiàn)象說(shuō)明BMMNCs移植入大鼠脊髓損傷處可以促進(jìn)損傷脊髓的修復(fù)和再生。這與文獻(xiàn)報(bào)道的其他各種干細(xì)胞(神經(jīng)、胚胎和骨髓干細(xì)胞)治療脊髓損傷相似[12～14]，說(shuō)明植入細(xì)胞能融入血管結(jié)構(gòu)并長(zhǎng)期存活體內(nèi)促進(jìn)再生血管，而且基本適應(yīng)機(jī)體內(nèi)的微環(huán)境，并能分泌相關(guān)細(xì)胞因子，來(lái)繼續(xù)促進(jìn)損傷脊髓功能的恢復(fù)，防止繼發(fā)性脊髓損傷的可能。

脊髓損傷后神經(jīng)元再生和重塑是一個(gè)十分復(fù)雜的課題。本研究從動(dòng)物行為學(xué)和組織形態(tài)MBP含量這兩個(gè)方面顯示了BMMNCs可促進(jìn)脊髓全橫斷損傷后髓鞘細(xì)胞的再生、上調(diào)了髓鞘堿性蛋白的表達(dá)，這可能是 BMMNCs促進(jìn)大鼠后肢功能改變的原因。在本實(shí)驗(yàn)中未進(jìn)行PCR檢測(cè)和western blot檢測(cè)，至于BMMNCs是否通過(guò)刺激 MBP 基因的轉(zhuǎn)錄或其他機(jī)制來(lái)促進(jìn) MBP 的合成還有待進(jìn)一步研究。

[1]申福國(guó)，孔維麗，劉士臣，等.大鼠脊髓損傷后對(duì)巢蛋白及突觸素Ⅰ表達(dá)的影響[J].中華急診醫(yī)學(xué)雜志，2014，(10):994-1000

[2]張富運(yùn)，楊建華，王蕾，等.骨髓單個(gè)核細(xì)胞對(duì)大鼠脊髓損傷后行為功能影響的研究[J].黑龍江醫(yī)藥科學(xué)，2013，36(12):44-46

[3]The Ministry of Science and Technology of the People’s Republic of China. Guidance Suggestions for the Care and Use of Laboratory Animals，2006-09-30

[4]楊建華, 陳杰, 李長(zhǎng)德.大鼠脊髓全橫斷模型的研究及其評(píng)價(jià)[J].黑龍江醫(yī)藥科學(xué)，2006，29(2)：1-3

[5]Bradbury EJ, Khemani S, Von R, et al. NT-3 promotes growth of lesioned adult rat sensory axons ascending in the dorsal columns of the spinal cord[J]. Eur J Neurosci，1999，11(11):3873-3883

[6]Vulliet PR. Intra-coronary arterial injection of mesenchymal stromal cells and microinfarction in dogs[J]. Lancet, 2004，363(9411):783-784

[7]Tomita S.Improved heart function with myogenesis and angiogenesis after autologous porcine bone marrow stromal cell transplantation[J].Thorac Cardiovasc Surg, 2002，123(6): 1132-1140

[8]Becker D, CL Sadowsky, and JW McDonald. Restoring function after spinal cord injury[J]. Neurologist, 2003，9(1): 1-15

[9]Enomoto M.Present situation and future aspects of spinal cord regeneration[J]. Orthop Sci, 2004，9(1):108-112

[10]Pluchino S.Neural stem cells and their use as therapeutic tool in neurological disorders[J]. Brain Res Brain Res Rev, 2005，48(2): 211-219

[11]Chopp M. Spinal cord injury in rat: treatment with bone marrow stromal cell transplantation[J]. Neuroreport, 2000，11(13):3001-3005

[12]Saito F.Spinal cord injury treatment with intrathecal autologous bone marrow stromal cell transplantation: the first clinical trial case report[J].Trauma, 2008，64(1): 53-59

[13]Gage FH，J Ray, and LJ. Fisher Isolation, characterization, and use of stem cells from the CNS[J]. Annu Rev Neurosci, 1995，8:159-192

[14]Osaka M.Intravenous administration of mesenchymal stem cells derived from bone marrow after contusive spinal cord injury improves functional outcome[J]. Brain Res, 2010，1343:226-235

The effect of bone marrow mononuclear cells transplantation on the expression of myelin basic proteinafter acute transection spinal cord injury in rats

JIQing-hui，SHENFu-guo,KONGWei-li,YANGJian-hua,CUIHong-yu,QIAOJian-min

(The First Affiliated Hospital of Jiamusi University, Jiamusi 154003, China)

Objective: To investigate the effects of the transplantation of allogeneic bone marrow mononuclear cells (BMMNCs) on myelin basic protein expression in spinal cord injury district local microenvironment. Methods: 45 Winstar rats of either gender aged 8 weeks old, each weighing from 200 to 220g, were randomly divided into three groups: the experimental group (n=15), the control group (n=15), the sham group (n=15). Rats in the experimental and control groups were established spinal cord injury model. After modeling rats in experimental group were immediately injected into the bone marrow mononuclear cells at the upper and lower ends of the spinal cord. Rats in the control group were injected phosphate buffer (PBS) at the upper and lower ends of the spinal cord. The spinal cords in sham group were not damaged. The spines were cut off only T8-10 sutured after the sudden and lamina.After the cells were transplanted, BBB hindlimb function in rats was assessed in 1d, 5d, 1w, 2w, 4w and 6w to determine the recovery of neurological function. Immunohistochemical expression method was used to observe rat spinal cord myelin basic protein. Results: (1) BBB scores showed rats in sham group at each time point were in normal range. Scores in the experimental group and control group were gradually increased with time, and the score in experimental group was higher in the control group (P<0.05), but did not reach normal levels. After four weeks, BBB scores in the experimental group increased more significantly than that in the control group, and the difference was statistically significant (P<0.05). (2) immunohistochemical staining showed that rat spinal cord at each time point in the experimental group and model control group, the expressions of myelin basic protein are higher than those in the sham group; and the experimental group was higher (P<0.05). Conclusion: Allogeneic bone marrow mononuclear cell transplantation may change the local microenvironment and raise its expression in the spinal cord myelin basic protein.

bone marrow mononuclear cells；transplantation；transected injury；myelin basic protein

黑龍江省教育廳科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目， 編號(hào)：12511539。

季慶輝(1983～)男，黑龍江黑河人，碩士，醫(yī)師。

楊建華( 1969 ～)男，黑龍江佳木斯人 ，碩士，主任醫(yī)師，碩士研究生導(dǎo)師。E-mail: jianhua01@163.com。

R683.2

A

1008-0104(2015)01-0066-03

2014-09-16)