Chk1/chk2在Aβ致傷海馬神經元中的表達及意義①

黃昕艷，尉榮翠，楊 智，李 壯，劉 爽

(1．佳木斯大學附屬第二醫(yī)院神經內科，黑龍江 佳木斯 154002；2．佳木斯大學附屬第一醫(yī)院腫瘤科，黑龍江 佳木斯 154003；3．佳木斯大學遺傳教研室，黑龍江 佳木斯 154002)

Chk1/chk2在Aβ致傷海馬神經元中的表達及意義①

黃昕艷1，尉榮翠1，楊 智1，李 壯2，劉 爽3

(1．佳木斯大學附屬第二醫(yī)院神經內科，黑龍江 佳木斯 154002；2．佳木斯大學附屬第一醫(yī)院腫瘤科，黑龍江 佳木斯 154003；3．佳木斯大學遺傳教研室，黑龍江 佳木斯 154002)

目的：探討Chk1/chk2在Aβ致傷海馬神經元中的表達及意義。方法：應用新生(3d以內)SD大鼠采用急性分離、胰酶消化的方法培養(yǎng)海馬神經細胞，分別于Aβ25-35致傷0h、8h、16h、24h，并采用免疫細胞染色觀察各時間點Chk1/chk2表達情況。結果：體外培養(yǎng)的神經細胞生長狀態(tài)良好，免疫細胞染色鑒定結果表明Chk1、chk2蛋白在Aβ致傷神經元后，隨致傷時間延長均有表達，且以chk1表達顯著，在致傷16h有差異明顯(P<0.05)。結論：Chk1/chk2共同參與了在Aβ致傷海馬神經元中的DNA損傷修復，以chk1表達更顯著，提示可望為AD中神經元的DNA損傷修復提供新的干預點。

海馬神經元；Chk1/chk2；Aβ

近年來的研究指出，細胞周期的異常可能是AD發(fā)生的較早期事件，這種異常的細胞周期可導致細胞的凋亡，最終引發(fā)AD。成熟神經元再進入細胞周期與DNA損傷有關，在DNA損傷修復過程中不可回避的涉及到細胞周期檢測點激酶Chk1和(或)Chk2的活化[1]，而Chk1和(或)Chk2在Aβ致傷神經元中的激活情況尚未見報道，故本研究以Aβ致傷神經元為AD的細胞模型，探討Chk1和Chk2在Aβ致傷神經元的表達差異，為AD中神經元的DNA損傷修復提供全新的干預點。

1 材料與方法

1.1 材料

新生SD大鼠(1～3d)，由佳木斯大學實驗動物中心提供(動物質量合格證號：黑動字第99102001)。藥物及試劑 DMEM/F12干粉培養(yǎng)基、B27、胎牛血清均購自美國Sigma公司，Aβ25-35購自北京博奧森生物技術有限公司，兔抗大鼠單克隆神經元特異性烯醇化酶(neuron specific enolase,NSE)單克隆抗體、SABC即用型試劑盒、DAB顯色試劑盒購于Boster公司。

1.2 方法

1.2.1 海馬神經元的原代培養(yǎng)[2]

選用出生3d內的SD大鼠，解剖分離出海馬，經0.125%胰酶消化8～12min，用含有10%胎牛血清的DMEM/F12種植液終止消化。經懸浮、離心、過濾等步驟收集細胞，用種植液制成密度為5×105個/mL的單細胞懸液，接種于預先鋪有多聚賴氨酸的6孔培養(yǎng)板內，置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24h后換含2%B27的DMEM/F12培養(yǎng)基，每隔3d半量換液1次。

1.2.2 原代神經元鑒定[3，4]

NSE免疫細胞化學鑒定：培養(yǎng)至第7d的神經細胞，以PBS輕洗3遍，4%多聚甲醛固定30min后，PBS洗2次。0.4% TritonX-100破膜20min，PBS洗3遍，山羊封閉血清封閉30min，滴加NSE(1：200稀釋) 一抗，4℃濕盒內孵育過夜。次日加二抗室溫避光孵育50min，加新鮮配制的DAB溶液顯色，光鏡觀察。

1.2.3 Aβ25-35致傷及實驗分組

海馬神經元培養(yǎng)7d后，棄原培養(yǎng)液，加入DMEM培養(yǎng)液及終濃度為10μmol/L的Aβ25-35(前期實驗篩選的最佳致傷濃度)孵育，Aβ25-35肽分別孵育0h、8h、16h、24h終止培養(yǎng)，分別以chk1、chk2為一抗，進行免疫細胞化學染色。每組6孔，每張蓋玻片上隨機選取6個視野，高倍鏡下綜合染色強度和陽性細胞所占比例進行半定量測定。染色強度評分標準：不著色0分；黃色1分；棕黃色2分；黃褐色3分。陽性細胞所占比例評分標準：陽性細胞數(shù)<10%者0分；10%～40%者1分；40%～70%者2分；>70%者3分。兩種評分相乘，結果記為免疫化學評分值，以均數(shù)±標準差表示。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件包進行統(tǒng)計分析，以P<0.05作為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 神經元形態(tài)學觀察及鑒定

接種后的海馬神經細胞呈圓形，單個均勻分布，2h后開始貼壁，培養(yǎng)24h后細胞大部貼壁且部分已長出突起，隨養(yǎng)時間延長，突起逐漸增多、延長并交織成網。培養(yǎng)至7d細胞生長成熟，見圖1。NSE免疫染色顯示90%以上的培養(yǎng)細胞為陽性染色，符合細胞原代培養(yǎng)純度要求，見圖2。

圖1 7d，神經細胞原代培養(yǎng)7d(×200)

圖2 7d，NSE免疫細胞染色(DAB顯色)

2.2 Chk1、Chk2蛋白在Aβ致傷神經元中的表達

Chk1、chk2蛋白在Aβ致傷神經元后，隨致傷時間延長均有表達，陽性細胞表達定位在細胞核及細胞質，并以細胞核為主。 Chk1與chk2蛋白表達在0h、8h無顯著差異，在致傷16h及24h， Chk1與chk2蛋白表達水平明顯高于對照組(P<0.05)，且chk1與chk2表達有顯著性差異(P<0.05)，見表1。

表1 chk1、chk2蛋白在Aβ致傷神經元中的表達(免疫化學積分)

注：*與正常對照組比較，P<0.05；△與chk2蛋白表達比較P<0.05。

3 討論

Aβ可通過多種途徑產生神經毒性作用，近年來提出了AD發(fā)病過程中大量神經細胞凋亡機制的假說-細胞周期假說。CHK1、CHK2是細胞周期檢查點蛋白，在DNA損傷所致的周期阻滯中起到重要作用，其不僅能夠引起細胞周期阻滯，而且還直接或間接參與了DNA損傷的修復過程[5]。

在本研究中，通過免疫細胞化學觀察，Aβ肽致傷神經細胞的8h、16h、24h均可看到CHK1、CHK2的蛋白表達，在Aβ肽致傷16h時CHK1、CHK2表達顯著，同時可以看到CHK1、CHK2相比較，CHK1的表達更明顯，CHK1和CHK2功能上的相互重疊增強了損傷細胞的自我保護能力。

DNA受損后，可觸發(fā)一系列的級聯(lián)效應，DNA修復蛋白復雜多樣，作為DNA損傷修復的關卡反應蛋白，有研究報道CHK1或CHK2的高表達可以提高DNA修復效率，改變細胞凋亡的命運[6]。

目前，CHK抑制劑在阻止細胞周期停滯、抑制DNA修復，誘導DNA損傷細胞凋亡方面的研究受到廣泛關注[7，8]，大量結果表明CHK抑制劑在抑制DNA修復的治療中越來越顯現(xiàn)出其優(yōu)勢[9]，這些問題的解決對于挽救AD中大批損傷神經元的命運至關重要。而隨著細胞周期檢驗點和DNA修復機制研究的深入，針對性的選擇周期檢驗點或DNA修復通路中的關鍵蛋白，已成為近年來干預細胞周期治療的新靶點。

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[2]王廷華，馮忠堂.神經細胞培養(yǎng)理論與技術[M]．北京：科學出版社，2005，83-84

[3]黃昕艷,趙錦程,尉榮翠,等. Aβ_(25-35)寡聚體對大鼠海馬神經細胞的活性影響及形態(tài)學觀察[J].中風與神經疾病雜志，2013，30(3)：218-221

[4]胡旭慧，黃昕艷，朱曉峰. Aβ_(25～35)寡聚體對原代培養(yǎng)海馬神經元突觸的損傷作用[J].黑龍江醫(yī)藥科學，2010，33(3)：113

[5]馮旭，黃昕艷，江清林，等. BDNF對Aβ致傷大鼠海馬神經元突觸功能修復的影響[J]. 黑龍江醫(yī)藥科學，2013，36(6)：7-10

[6]Karnitz LM，F(xiàn)latten K S，Wagner J M，et al.Gemcitabine-induced Activation of checkpoint signaling pathways that affect tumor cell survival[J]. Mol Pharmacol,2005,68:1636-1644

[7]Ashwell S，Zabludoff S. DNA damage detection and repair pathways—recent advances with inhibitors of checkpoint kinases in cancer therapy[J]. Clin Cancer Res，2008,14:4032-4037

[8]Helleday T，Petermann E，Lundin C，et al.DNA repair Pathways as targets for cancer therapy[J]. Nat Rev Cancer，2008,8:193-204

[9]Mukhopadhyay U K，Senderowicz A M，F(xiàn)erbeyre G. RNA silencing of Checkpoint regulators sensitizes P53-defective prostate cancer cells to Chemotherapy while sparing normal cells[J].Cancer Res，2005,65:2872-2881

黑龍江省教育廳課題，編號：12521570和12521543。

黃昕艷(1969～)女，黑龍江佳木斯人，學士，主任醫(yī)師。

劉爽(1975～)女，黑龍江佳木斯人，博士，教授。E-mail:lockandkey@sina.com。

R741.02

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1008-0104(2015)01-0072-02

2014-08-12)