奧拉西坦對(duì)新生大鼠腦損傷中NT-3蛋白的相關(guān)研究①

楊 松，王一川，穆國(guó)軍

(佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院兒內(nèi)一科，黑龍江 佳木斯 154003)

奧拉西坦對(duì)新生大鼠腦損傷中NT-3蛋白的相關(guān)研究①

楊 松，王一川，穆國(guó)軍

(佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院兒內(nèi)一科，黑龍江 佳木斯 154003)

目的：制備HIBD模型，應(yīng)用神經(jīng)細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)劑—奧拉西坦，探討其對(duì)神經(jīng)再生、修復(fù)及其可能的機(jī)制，同時(shí)觀(guān)察HIBD后神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)素-3(NT-3)的動(dòng)態(tài)變化。方法：經(jīng)乙醚麻醉新生7日Wistar大鼠(相當(dāng)于人類(lèi)新生兒期)后，于頸部正中切口，分離結(jié)扎左側(cè)頸總動(dòng)脈，動(dòng)物休息靜止2h，放入含有8%氧氣和92%氮?dú)獾拿荛]容器持續(xù)2h，制備成HIE模型。將缺血缺氧后出現(xiàn)左旋或夾尾左旋者納入試驗(yàn)。隨機(jī)共分為3組，雌雄不限，體重在13～15g，每組25只。(1)空白組:分離左側(cè)頸總動(dòng)脈后下置線(xiàn)，不結(jié)扎，不缺氧。(2)模型組: 制備大鼠缺血缺氧性腦損傷模型后立即腹腔注射生理鹽水0.1mL/只。(3)治療組: 造模成功后立即腹腔注ORS 100mg/kg。所有動(dòng)物于6h，12h，24d，36h，后斷頭取腦，通過(guò)免疫組化方法檢測(cè)各時(shí)間點(diǎn)NT-3的表達(dá)情況。結(jié)果：通過(guò)免疫組化分析各組比較，可見(jiàn)治療組NT-3表達(dá)最多，模型組表達(dá)次之，空白組表達(dá)最少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論：證明奧拉西坦的神經(jīng)保護(hù)作用及NT-3在新生兒缺氧缺血性腦損傷中發(fā)揮重要的作用。

新生兒缺氧缺血性腦損傷；奧拉西坦；NT-3

新生兒缺氧缺血性腦損傷(HIBD)是圍產(chǎn)期新生兒窒息導(dǎo)致的缺氧缺血性腦損害，其病死率高同時(shí)也是我國(guó)小兒致殘的主要原因[1～2]。隨著新生兒重癥監(jiān)護(hù)病房(NICU)對(duì)HIBD搶救的存活率提高，但其存活者中如智力障礙、神經(jīng)行為異常、腦性癱瘓、癲癇等神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥也隨之升高[1]。而神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子是能促進(jìn)神經(jīng)元存活，誘導(dǎo)其增殖分化，并對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育及功能的維持起一定作用,從而減少神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥的發(fā)生，降低了HIBD致殘率，故成為了目前研究的熱點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

清潔級(jí)Wistar新生大鼠100只，雌雄不限，出生后7d(相當(dāng)于人類(lèi)新生兒期)。佳木斯大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。

1.2 主要試劑

奧拉西坦溶液(100mg/kg)，NT-3抗體(Sigma美國(guó))。

1.3 制備動(dòng)物模型

經(jīng)乙醚麻醉后，取頸部正中切口，分開(kāi)結(jié)扎左頸總動(dòng)脈，放入含有8%氮?dú)夂?2%氧氣的密閉容器持續(xù)2h，制備成HIE模型。將出現(xiàn)左旋或夾尾左旋者納入試驗(yàn)。

1.4 實(shí)驗(yàn)分組及給藥

出生7d大鼠共分為3組，每組25只。正常組:分離左側(cè)頸總動(dòng)脈后在動(dòng)脈下置線(xiàn), 結(jié)扎亦不低氧。模型組: 制備大鼠HIE模型立即腹腔注射生理鹽水0.1mL/只。治療組: 模型后立即腹腔注射ORS 100 mg/kg，即6h，12h，24d，36h，在HIE后即刻給藥一次，之后每24小時(shí)給藥一次。

1.5 樣品處理

按照不同時(shí)間點(diǎn)處死各組動(dòng)物，大鼠經(jīng)拉頸處死后迅速于冰上開(kāi)顱分離腦組織，按不同檢測(cè)目的分別儲(chǔ)存大腦及部分腦干脊髓組織。

1.6 檢測(cè)

免疫組化。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行分析，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用單因素方差分析進(jìn)行兩兩比較，P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

免疫組化檢查結(jié)果：空白組：可見(jiàn)NT-3有微量表達(dá)，各組間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。模型組：NT-3陽(yáng)性細(xì)胞在造模6h出現(xiàn)表達(dá)，12開(kāi)始下降，24降到最低，此后逐漸升高。模型組與空白組SDF-1陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)比較顯著，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。治療組各時(shí)間點(diǎn)NT-3的表達(dá)均高于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；模型組和治療組陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯多于空白組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

表1 NT-3蛋白免疫組化結(jié)果

4 討論

缺氧缺血性腦損傷后的微環(huán)境中存在多種抑制軸突再生、分化的抑制分子[3]。目前，如何克服缺氧缺血性腦損傷后抑制軸突再生的微環(huán)境，促進(jìn)軸突再生并與靶細(xì)胞形成功能性突觸聯(lián)系是缺氧缺血性腦損傷修復(fù)的目標(biāo)，也是缺氧缺血性腦損傷患者功能恢復(fù)的基礎(chǔ)。國(guó)內(nèi)外研究證實(shí)[4，5]，在缺氧缺血性腦損傷后的有害微環(huán)境中，存在許多生長(zhǎng)抑制分子和軸突排斥分子，如突起坍塌蛋白家族、坍塌反應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白家族、髓鞘相關(guān)的抑制分子、軸突引導(dǎo)分子等。這些抑制分子主要通過(guò) Rho-ROCK II 信號(hào)途徑及細(xì)胞極性信號(hào)途徑傳遞抑制信號(hào)，作用于軸突生長(zhǎng)錐的細(xì)胞骨架，介導(dǎo)了脊髓損傷、腦出血、缺血性腦損傷等軸突的再生性抑制。有學(xué)者研究證明，對(duì)缺血性腦損傷大鼠海馬和紋狀體NT-3 mRNA 表達(dá)的影響中提到，缺血性腦損傷24h 和36h 后模型組動(dòng)物的NT-3 mRNA 在海馬和紋狀體均有表達(dá)增多。Yang 等研究報(bào)道，用核酶保護(hù)和原位雜交法檢測(cè)短暫性腦缺血大鼠海馬神經(jīng)元時(shí)發(fā)現(xiàn)NT-3的表達(dá)趨勢(shì)是呈先下降后上升的趨勢(shì)。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)結(jié)扎7d齡新生鼠左側(cè)頸總動(dòng)脈及缺氧處理后，用免疫組化法檢測(cè)NT-3蛋白的表達(dá)，分別采用6h，12h，24d，36h，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示模型組NT-3蛋白在大腦皮質(zhì)、海馬神經(jīng)細(xì)胞胞及軸突內(nèi)均有陽(yáng)性表達(dá)。6h就有少量表達(dá)，12h表達(dá)下降，24h表達(dá)最低，以后逐漸升高，與上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果基本一致。綜上所述，神經(jīng)細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)劑可通過(guò)促進(jìn)NT-3的表達(dá)起到營(yíng)養(yǎng)神經(jīng)的作用。因此，對(duì)于大腦神元損傷、修復(fù)和再生的機(jī)制，可以通過(guò)對(duì)缺氧缺血后腦損傷中 NT-3 的動(dòng)態(tài)變化的研究，為臨床治療缺氧缺血性腦損傷提供新的思路，使得與NT-3有關(guān)的藥物治療可能成為中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷修復(fù)新的有效手段。

[1]彭形.神經(jīng)生長(zhǎng)因子生物學(xué)效應(yīng)的研究進(jìn)展[J].檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)與臨床， 2009，6(3):203-204

[2]路露，陳美婉，羅煥敏.神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子受體的研究進(jìn)展[J] . 中國(guó)老年醫(yī)學(xué)雜志，2010，30:126-131

[3]張燕平. 神經(jīng)生長(zhǎng)因子對(duì)腦梗死大鼠的神經(jīng)保護(hù)作用[J] .中國(guó)現(xiàn)代醫(yī)生， 2010，48(1):7

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[5]Yang JT，Chang CN，Lee TH， et al． Effect of dexamethasone on the expression of brain-derived neurotrophin factor and neurotropuin-3 messenger ribonucleic acid after forebrain ischemia in the rat[J]．Crit Care Med，2002， 30(4) : 913-918

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楊松(1981～)女，黑龍江佳木斯人，學(xué)士，醫(yī)師。 通迅作者：穆國(guó)軍(1983～)男，吉林四平人，在讀碩士研究生。E-mail:Muguojw2008@163.com。

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1008-0104(2015)01-0145-01

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