Noggin基因修飾對Aβ致傷神經干細胞凋亡及突觸素表達的影響①

王增冕,張曉梅,盛寶英

(佳木斯大學附屬第一醫院神經內科,黑龍江 佳木斯 154003)

Noggin基因修飾對Aβ致傷神經干細胞凋亡及突觸素表達的影響①

王增冕,張曉梅,盛寶英

(佳木斯大學附屬第一醫院神經內科,黑龍江 佳木斯 154003)

noggin基因;P38表達;神經干細胞

阿爾茨海默病(Alzheimer disease，AD)R 病人群大多數為中老年人。此病患者經常記不清發生的事情，認不出熟悉的人，而且在行為神態上呈現出呆傻狀態。這主要是因為病人的中樞神經受到此病的侵害，中樞神經不能正常工作。年齡越大的人患病的可能性越大。因此，由該病引起的死亡排在臨床死亡原因的第四位。此類疾病的病理是：病患的神經細胞遭到破壞，影響病患的部分身體機能的工作。治療該病的關鍵在于病變神經元的恢復和替換。嬰兒和成年人的大腦內都有神經干細胞。利用神經干細胞移植入受損的神經組織，更換和修復受損的神經元，以恢復大腦的正常功能，是用于AD的治療未來的一個重要方向。神經系統的神經干細胞不僅在發展中國家，也繼續存在于成人中樞神經系統中的多個腦區域。利用神經干細胞移植入受損的神經組織，更換和修復受損的神經元，以恢復大腦的正常功能，是用于AD的治療未來的一個重要方向。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

新生3d內昆明小鼠 由佳木斯大學實驗動物中心提供。

1.2 主要試劑配制

①2μg/mL bFGF 液配制:bFGF100ug加5mL三蒸水配制成20μg/mL bFGF 溶液(-20℃冰凍)。1mL的20μg/mL bFGF 溶液加9mL三蒸水配制成2μg/mL bFGF 溶液。

②2μg/mL EGF 液配制:EGF100μg加5mL三蒸水配制成20μg/mL EGF 溶液(-20℃冰凍)。1mL的20μg/mL EGF 溶液加9mL三蒸水配制成2μg/mL EGF溶液。

③DMEN/F12(1:l)培養基二倍液配制:取DMEM/F12干粉14.79g，三蒸水400mL溶解，NaCHO3調整pH值7.2～7.4，定容至500mL。0.22μm微孔濾膜濾器過濾，每瓶50mL/瓶分裝。-20℃保存。用時37℃溫箱孵育。

④神經干細胞培養基配制:試劑液體量加入后濃度,DMEM/F12 二倍液50mL —EGF(2μg/mL)1mL 20ng/mL;bFGF(2μg/mL)1mL 20ng/mL;B27 2mL 2%;青霉素(1萬單位/mL)1mL 100單位/mL;鏈霉素(1萬單位/mL)1mL 100單位/mL;用10%NaHCO3或HCL調節pH 值為7.2～7.3。三蒸水滴定容至100mL，密閉，4℃冰箱保存備用。

⑤多聚賴氨酸的配制:將多聚賴氨酸以1：10的比例稀釋于無菌三蒸水中，針式濾器過濾，盛裝于塑料瓶內備用。應用時將多聚賴氨酸均勻涂布于蓋玻片上，無菌培養箱孵育過夜，滅菌三蒸水清洗2次，將蓋玻片置入無菌培養板孔中，晾干后使用。

⑥Aβ1-42 聚集態的制備:用二甲基亞砜溶解Aβ1-42后加0.01MPBS 使其終濃度12.5μmol/L， 37℃培養箱中孵育一周(二甲基亞砜濃度小于5%)。

1.3 實驗方法[1～4]

1.3.1 小鼠海馬神經干細胞分離、培養

75%酒精的棉球擦洗新生小鼠，在超凈工作臺無菌條件下斷頭并分離海馬，無菌眼科剪將組織塊剪成1mm3以下的小塊，用尖頭已拋光的長頸吸管機械吹打成單細胞懸液，用血球計數板計數，以5×106/L密度接種于培養瓶中，神經干細胞條件培養基，37℃、CO2體積分數5%的條件下培養，每3天換一半完全培養液。

1.3.2 神經干細胞的傳代培養及分化

在培養的第7～10天，用15mL離心管收集培養瓶中的多克隆球，1000rpm離心3min，棄上清。用尖頭已拋光的長頸吸管吹打成單細胞懸液，傳代次數共計不超過4次。以1×106/L 密度接種于多個25cm2的培養瓶中，加入神經干細胞完全培養液，以后每3～4日半量換液，6～7d傳代一次。傳三代后神經干細胞在培養液內加入10%胎牛血清，孵育72h后行MAP-2、GFAP鑒定。

1.3.3 SABC免疫化學法Nestin、MAP-2、GFAP鑒定

取懸浮培養第三代神經干細胞，接種于預先涂布0.1g/L多聚賴氨酸的蓋玻片中，并加入分化培養基，37℃培養箱培養24h后行Nestin免疫熒光鑒定。

1.3.4 重組PEGFP-N1-NOG真核表達載體的構建

① noggin基因的提取

根據大鼠Noggin基因cDNA的全部序列, 設計一對引物，noggin上游：5’GCCAACATTATCTGCACATCAGAC3’,下游：5’TACTGAATGGTTATCCACGCACAC3’,提取胎鼠腦細胞總RNA, 合成cDNA的第一條鏈,取5μL RT產物進行PCR反應,總反應體系為50μL,反應條件為94℃5min后,94℃ 45s、60℃ 45s、72℃ 2min循環35次,末次延伸72℃ 10min。

② pEGFP-N1和noggin質料的準備

將含DH5α的菌株以1∶100體積比接種于LB培養基中,同時把Noggin質粒的DH5α菌株以同比例種于100μg/mL氨芐青霉素的LB培養基內,37℃搖床培養12～16 h。

③pEGFP-N1和noggin的產物回收

對pEGFP-N1和Noggin質粒酶切產物電泳目的進行回收。

④ DNA的片段連接

將回收純化基因片段Noggin和pEGFP-N1進行定向連接。

⑤ pEGFP-N1-NOG重組質粒的雙酶切鑒定。

大腸桿菌DH5α的制備擴連接產物的轉化均在無菌條件下操作。從含kan的平板上隨機挑取3～4個菌落分別接種于5mL含有30μg/mL Kan 的LB液培養基中，37℃，180r/min振蕩培養10～12h后，提取質粒。所提取的質粒用限制性內切酶EcoR I和Sal I雙酶切鑒定。重組質粒的PCR擴增鑒定:采用20μL體系進行PCR，產物經1%瓊脂糖凝膠電泳，pEGFP-N1-NOG引物序列對應目的片段長7599bp，用Marker DL 15000作為參照。

pEGFP-N1-NOG的DH5α陽性克隆菌液中加入15%甘油，-70℃保存備用。

1.3.5 重組PEGFP-N1-NOG基因轉染大鼠神經干細胞及Noggin蛋白表達

瞬時轉染24h后，按1/10比例傳代，第二天改用含G418 (800UG/ML)及10%胎牛血清的MEM培養液篩選，維持培養，3～5d換液一次，約7d左右陰性對照細胞全部死亡，將G418濃度降為200μg/mL的維持濃度，約14d后出現細胞克隆。挑取陽性克隆擴大培養，命名為NSC/NOGGIN載體組和NSC/空載體組，分別擴大培養，傳代建系。激光共聚焦顯微鏡檢測重組PEGFP-N1-NO。

1.3.6 實驗分組

正常組：神經干細胞不加β-淀粉樣蛋白培養；Aβ組：β-淀粉樣蛋白與體外培養的未轉染神經干細胞；noggin組： PEGFP-1-noggin神經干細胞β-淀粉樣蛋白培養；空質粒組：β-淀粉樣蛋白與轉染PEGFP-1 -GFP修飾神經干細胞共培養；Noggin+Aβ組：β-淀粉樣蛋白與體外培養的PEGFP-1-noggin神經干細胞共培養。

1.4 統計學方法

采用SPSS10.0行方差檢驗分析,P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

免疫組化檢測結果顯示：正常組Caspase-3 陽性細胞比率最低，多散在分布；Aβ組與空質粒Caspase-3 陽性細胞比率較高，達34.83%、33.96%，行χ2檢驗Aβ組與空質粒比較P>0.05，Aβ組及空質粒與其他組比較P<0.01。noggin+Aβ組Caspase-3 陽性細胞比率較小，達24.72%，與正常組、Aβ組與空質粒比較P<0.01，結果具有統計學意義。

3 討論

神經干細胞的生物學特性是自我更新、多分化潛能，還有良好的遷移能力和與宿主細胞融合能力以及低免疫源性，使其為移植治療神經系統疾病成為可能。我們可以利用神經干細胞的生物學特性。通過移植使損傷神經的結構和功能達到重建立，也可將目的基因轉染至神經干細胞，使其做為基因載體，達到基因治療及結構修復的協同作用，所以，神經干細胞的體外培養、基因轉染與細胞移植，成為近年研究的熱點[5～9]。有研究表明在轉基因小鼠建立的 AD 模型中發現其額葉的前皮質內缺乏突觸素和神經元，而AD 患者的神經元突觸損傷的關鍵原因是Aβ的神經毒性作用，所以近年來，突觸素常常做為AD研究的一個指標。本實驗結果顯示: 與未轉染NSCs比較，noggin基因轉染神經干細胞突觸素表達增高，轉染組細胞在Aβ致傷條件下仍可有一定的突觸素表達。noggin基因在常規體外培養條件下，可提高NSCs的突觸素表達，有利于細胞間的信號傳遞，在Aβ 致傷后noggin基因仍可促進突觸素的表達，提示在軸突的生長和突觸的成熟中，noggin基因可能起到重要作用。利用神經干細胞移植與原位誘導治療中樞神經系統退行性疾病一直是人們不斷探索的一種手段，希望找尋補償各種原因引起的神經元丟失的方法，以促進腦缺血后神經功能的恢復。noggin基因轉染在一定程度上能抑制體外培養的神經干細胞在Aβ致傷后的凋亡，提高體外培養及Aβ 致傷條件下突起生長、突觸素表達，但其作用機制還需進一步探討，noggin基因修飾神經干細胞移植治療AD，對促進原位細胞的生長發育、神經再生以及退行性病變的神經系統中的突觸重建所能起的作用還需進一步觀察。

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黑龍江省教育廳科研項目, 編號: 12521543。

王增冕(1985～)女，黑龍江佳木斯人，碩士，醫師。

盛寶英(1956～)女，黑龍江佳木斯人，碩士，主任醫師，碩士研究生導師。E-mail:dr.wts@163.com。

Q421

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1008-0104(2015)01-0157-02

2014-05-03)