高效液相法檢測細胞內嘌呤含量研究①

劉慧東，李錦蓮，武冬梅

(1.黑龍江省開拓輻射技術開發公司，黑龍江 哈爾濱 150001；2.佳木斯大學藥學院，黑龍江 佳木斯 154007)

高效液相法檢測細胞內嘌呤含量研究①

劉慧東1，李錦蓮2，武冬梅2

(1.黑龍江省開拓輻射技術開發公司，黑龍江 哈爾濱 150001；2.佳木斯大學藥學院，黑龍江 佳木斯 154007)

目的：改進細胞收集方法以提高高效液相法檢測細胞內嘌呤的效率。方法：采用高效液相法檢測原位和傳統兩種收集方法獲得的細胞質。結果：原位收集獲得的MCF-7細胞質中黃嘌呤，次黃嘌呤，腺嘌呤濃度均高于傳統收集細胞法獲得的MCF-7細胞質相應的嘌呤濃度。結論：與傳統的細胞收集法相比，原位細胞收集法更能得到含量較高的嘌呤。

高效液相法；嘌呤；MCF-7細胞

嘌呤是核苷酸代謝中間產物，細胞內嘌呤含量的檢測對核苷酸代謝相關生理、病理過程的研究有重要意義[1～3]。高效液相(HPLC)法是經典的定量檢測方法[4～6]，然而此法目前采用的細胞收集和前處理方式復雜，所需細胞大，不僅造成檢測價格昂貴，而且所需時間較長，易造成檢測信號的丟失，因此改進細胞前處理方式，提高信號強度，縮短前處理時間，以便節省細胞培養，保證檢測的精確度，具有重要意義。本文改進了原始的細胞需要消化、離心、重懸、裂解的收集過程，直接在培養皿中原位裂解收集，大大縮短了實驗操作時間，降低了細胞收集所需費用。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

安捷倫1100高效液相色譜儀，美國；HH.CP-T型二氧化碳培養箱，上海一恒科學儀器有限公司；人乳腺腫瘤細胞MCF-7，東北林業大學贈送；優級胎牛血清、DMEM培養基、鏈霉素和青霉素，Gibco公司；其余試劑均為分析純。

1.2 MCF-7細胞的培養和收集

MCF-7細胞加適量DMEM培養液，置37℃、5% CO2、100%飽和濕度的培養箱中培養。將生長狀態良好且長滿培養皿底的MCF-7細胞按下述兩種方法收集。

傳統細胞收集法：將細胞依次進行消化、吹打懸浮、離心(1000 r·min-1，10 min)后得細胞沉淀，所得細胞沉淀用pH 7.4 PBS溶液沖洗3次，然后用適量的pH 7.4 PBS溶液配成細胞懸液并計數。所得細胞懸液在水浴50℃作用30 min后獲得待測細胞質。

原位細胞收集法：將生長狀態良好且長滿培養皿底的細胞用PBS清洗3次，加入適量的pH 7.4 PBS在水浴50℃作用30min后獲得待測細胞質。

1.3 HPLC測試條件

Ascenis RP-Amide 柱(250mm×4.0mm ID，5.0μm)；DAD檢測器；檢測波長為254 nm；流動相為的磷酸二氫鉀溶液，pH=4.0；流速為1.0mL·min-1。

2 結果與討論

2.1 原位法與傳統法收集MCF-7細胞質內嘌呤HPLC法檢測

圖1為HPLC法檢測原位收集的MCF-7細胞質中嘌呤堿基信號峰。并與傳統收集過程做了比較。原位收集的MCF-7細胞質(圖1-a)高效液相色譜信號峰明顯大于傳統收集的MCF-7細胞質信號峰(圖1-b)。

圖1 HPLC檢測原位收集獲得的MCF-7細胞質中電活性物質的含量 (a)原位收集MCF-7細胞，(b)傳統收集法MCF-7細胞 細胞濃度：2.0×106 cells·mL-1

2.2 HPLC法測定嘌呤堿基標準曲線

見圖2。如圖2所示，隨著嘌呤濃度的增加，高效液相色譜法檢測的峰面積也隨著增加，并在0.5～100.0μg·mL-1的范圍內呈現良好的線性關系。鳥嘌呤、黃嘌呤、次黃嘌呤和腺嘌呤的線性方程線性關系分別為Sguanine=10.3 Cguanine(μg·mL-1)，R=0.999；Sxanthine=21.68 Cxanthine (μg·mL-1)-8.923，R=0.999；Sxanthine= 17.55 Cxanthine (μg·mL-1)-12.593，R=0.999；SAdenine=32.58 CAdenine(μg·mL-1)-3.879，R=0.999。

圖2 嘌呤濃度與HPLC峰面積的關系 (A)鳥嘌呤，(B)黃嘌呤，(C)次黃嘌呤，(D)腺嘌呤

2.3 HPLC法測定原位法和傳統法收集細胞內嘌呤含量比較

見表1～2。

表1 細胞收集方法對HPLC峰面積的影響

由表1可見，原位收集的MCF-7細胞質中次黃嘌呤、黃嘌呤和腺嘌呤的峰面積分別為124.6，84.0和157.0，與傳統收集法的峰面積相比，其峰面積分別相對增長8.6，6.1和7.4，相對增長比例分別為7.4 %，7.8 %和4.9 %。而原位收集的MCF-7細胞質中鳥嘌呤的峰面積由28.2相對減少了10.3，其相對減少的比例達25.2 %。

表2 HPLC檢測MCF-7細胞質中嘌呤的濃度

表2描述的是細胞收集方法對細胞質內嘌呤濃度的影響。結果表明，原位收集獲得的MCF-7細胞質中黃嘌呤，次黃嘌呤，腺嘌呤3種嘌呤濃度均高于傳統收集細胞法獲得的MCF-7細胞質相應的嘌呤濃度，但鳥嘌呤濃度低于傳統收集細胞法獲得的MCF-7細胞質，引起這種現象的原因目前還無法解釋，仍需進一步的實驗研究才能確定。

3 結論

采用HPLC法檢測細胞內嘌呤的含量，從次黃嘌呤、黃嘌呤和腺嘌呤的峰面積角度考慮，原位收集法>傳統收集法。說明與傳統的細胞收集法相比，原位細胞收集法更能得到含量較高的嘌呤。

[1]武冬梅, 胡玲, 劉繼光,等. 基于MCF-7細胞質伏安行為的電化學抗腫瘤藥物敏感試驗研究 [J]. 藥物分析雜志, 2011, 31(5): 857-861

[2]D M Wu, G L Fu, L Hu, et al. Studies on the origin of the voltammetric response of the PC-3 cell suspension [J]. Talanta，2009, 78(2): 602-607

[3]J T Wang, X E Li, Y Zhang, et al. Voltammetric behavior of the MCF-7 cell cytoplasm and the effect of taxol on voltammetric response[J].Analytical Biochemistry，2009, 394(2): 229-236

[4]H E Ok, S W Choi, M Kim, et al. HPLC and UPLC methods for the determination of zearalenone in noodles, cereal snacks and infant formula[J].Food Chemistry，2014, 163(22):252-257

[5]C D Lorenzo,A D Santos, F Colombo,et al. Development and validation of HPLC method to measure active amines in plant food supplements containing Citrus aurantiumL[J].Food Control，2014,46(12): 136-142

Study of detection of purine cellular by HPLC method

LIUHui-dong1,LIJin-lian2,WUDong-mei2

(1.Heilongjiang Kaituo Radiation Technology Development Company,Haebin 150001，China;2.College of Pharmacy of Jiamusi University,Jiamusi 154007,China)

Objective: To improve the method of cell collection for promotion efficiency of detection purine cellular by HPLC method. Methods: HPLC methodis adopted to detect cytoplasm collected by in situ and traditional methods. Results: The concentrations of xanthine, hypoxanthine and adenine collecting by in situ method were more than that by tradition method. Conclusion: Compared with the tradition collection method, in situ collection method was more effective.

HPLC method; purine; MCF-7 cell

黑龍江省教育廳科學研究項目，編號：12511542。

劉慧東(1963～)女，黑龍江哈爾濱人，大專，工程師。

武冬梅(1967～)女，黑龍江佳木斯人，博士，教授，博士研究生導師。E-mail:dmwu@jmsu.edu.cn。

R965.2

A

1008-0104(2015)01-0015-02

2014-10-04)