含氮表面活性劑促進礦物潤滑油生物降解的作用與機制

韋友亮，陳波水，王 九，張 楠，方建華，吳 江

(1. 78416部隊， 重慶 400054； 2. 后勤工程學院 軍事油料應用與管理工程系，重慶 401311)

含氮表面活性劑促進礦物潤滑油生物降解的作用與機制

韋友亮1，陳波水2，王 九2，張 楠2，方建華2，吳 江2

(1. 78416部隊， 重慶 400054； 2. 后勤工程學院 軍事油料應用與管理工程系，重慶 401311)

以液體石蠟模擬礦物潤滑油基礎油，通過生物降解實驗考察了脂肪酸乙醇胺、脂肪酸酰胺、羥乙基咪唑啉、酰基氧化胺4種含氮表面活性劑對其生物降解性的影響，分別采用紫外-可見光分光光度計和表面張力儀測定了液體石蠟生物降解體系在600 nm波長處的光密度和油-水界面張力。結果表明，4種含氮表面活性劑均可顯著提高液體石蠟的生物降解性，其中?；趸返男Ч詈?；當其以質量分數1.0%加入液體石蠟時，可使后者的生物降解率由33.76%提高至72.13%。生物降解過程中，含氮表面活性劑顯著降低體系的油-水界面張力并加速微生物生長，從而起到促進潤滑油生物降解之作用。

含氮表面活性劑；礦物潤滑油；液體石蠟；生物降解

礦物潤滑油是應用最廣泛的潤滑劑品種之一。但是，由于其生物降解性差[1]，因滲透、泄漏、溢出和回收不當等導致的生態系統污染十分嚴重。研究改善其生物降解的技術措施，對于降低生態系統污染具有重要的理論和現實意義。

烴類化合物的生物降解性與其所處的環境狀態密切相關，改變環境狀態可使本來難降解的化合物變得易于降解。環境微生物學的研究表明，某些含氮和/或含磷化合物可加快微生物繁殖，增強其活性，促進難降解化合物的生物降解[2-4]；自然環境中，氮源和磷源是烴類化合物生物降解的重要因素。鑒此，在礦物潤滑油中添加含氮和/或含磷表面活性化合物，可望有效改善其生物降解性，實現潤滑油污染環境的“主動”生物修復。迄今為止，有關利用添加劑技術改善礦物潤滑油生物降解性的研究鮮有報道。陳波水等[5-12]的研究表明，在礦物基礎油、抗磨液壓油、高相對分子質量聚α-烯烴等生物難降解潤滑油中添加氨基酸、酰胺、磷酸酯等化合物，對改善潤滑油的生物降解性作用明顯，并提出了“潤滑劑生物降解促進劑”的新概念。某些生物降解促進劑還可有效改善潤滑油的抗磨減摩性和氧化安定性等性能。

筆者以液體石蠟作為礦物潤滑油的模擬基礎油，以脂肪酸乙醇胺、脂肪酸酰胺、羥乙基咪唑啉和?；趸?種含氮表面活性劑作為生物降解促進劑，研究其對液體石蠟生物降解性的影響及促進作用機制。

1 實驗部分

1.1 主要試劑及儀器

瓊脂粉，生化試劑，國藥集團化學試劑有限公司產品；胰蛋白胨、酵母膏，生化試劑，北京奧博星生物技術有限責任公司產品；油酸，分析純，成都市科龍化工試劑廠產品；液體石蠟，分析純，上海華靈康復器械廠產品；脂肪酸乙醇胺(FAE)、羥乙基咪唑啉(HIZ)、脂肪酸酰胺(FAA)、?；趸?AAO)，均由實驗室制備。

北京哈科試驗儀器廠HARKE-DWK型自動界面張力儀；北京普析通用儀器有限責任公司TU-1950型紫外-可見光分光光度計；金壇市富華儀器有限公司150A型生化培養箱和BS-1E型振蕩培養箱。

1.2 菌株及菌懸液

1.2.1 菌株

實驗所用菌株分別為假單胞菌屬、蒼白桿菌屬、博德特式菌屬和戈登氏菌屬。4株菌種系從油污染土壤中富集培養、分離和鑒定，并被證實具有降解潤滑油的作用[13]。菌種用含甘油培養物保藏法保存于-70℃備用。

1.2.2 菌懸液

將胰蛋白胨5 g、酵母膏2.5 g、NaCl 5 g 置于500 mL錐形瓶中，用蒸餾水定容至300 mL，121℃蒸汽滅菌20 min，配制得到LB液體培養基。

采用濕重法配制菌懸液作為生物降解實驗的接種微生物。將上述4株菌株分別復活于LB平板，挑選單菌落置于LB液體培養基中，于(30±2)℃、轉速200 r/min搖床中振蕩培養24h。8000 r/min下離心分離6 min，去上層清液，稱菌體濕重。用質量分數0.85%無菌生理鹽水配制20%菌懸液。量取單菌株菌懸液各2 mL，混合后組成混合菌懸液。

1.3 生物降解性測定

采用文獻方法[14-15]測定各受試物的生物降解性。在液體石蠟中分別加入質量分數1.0%的FAE、FAA、HIZ和AAO，配制得到4個加有含氮表面活性劑的液體石蠟試樣。以加劑試樣、空白試樣(液體石蠟)和基準物(油酸)作為受試物，以配制的混合菌懸液作為接種微生物，進行降解實驗。實驗時間12d、溫度(30±2)℃。每隔48h測定并計算受試物CO2生成量，以生物降解指數(BDI)作為降解性指標，評定受試物的生物降解性。BDI定義為相同條件下受試物降解生成的CO2量與基準物油酸降解生成的CO2量的比值，BDI值越大，生物降解性越好。每個受試物分別進行3次重復實驗，取3次實驗的BDI平均值作為測定結果。

1.4 光密度及油-水界面張力測定

微生物的濃度與光密度成正比，通過測定液體培養物在600 nm波長處的光密度是分析微生物生長變化的常用方法。

將NaCl 0.05 g、NH4NO30.05 g、MgSO4·7H2O 0.05 g、KCl 0.05 g、CaCl20.25 g、KH2PO40.25 g和K2HPO4·3H2O 2.5 g置于1000 mL錐形瓶中，用蒸餾水定容至 500 mL，121℃蒸汽滅菌 20 min，配制得到pH=7.0 的無機鹽培養基。

分別將0.0025 g FAE、0.0025 g FAA、0.0025 g HIZ、0.0025 g AAO和0.25 g液體石蠟及2 mL混合菌懸液加至pH=7.0 的無機鹽培養基中，于(30±2)℃、轉速200 r/min搖床中振蕩培養12 d。培養過程中每隔48 h取樣100 mL，采用紫外-可見光分光光度計在600 nm 波長處測定培養液的光密度(OD600)，重復測定3次取平均值。樣品液經4000 r/min離心分離10 min后，采用自動界面張力儀測定上層清液的油-水界面張力[16]，重復測定3次取平均值。每次測定結束后，將樣品倒回錐形瓶于搖床繼續振蕩培養。OD600和界面張力測定結果均與不加含氮表面活性劑的空白培養液所得結果對比。

2 結果與討論

2.1 含氮表面活性劑對液體石蠟生物降解性的影響

圖 1為添加質量分數1.0%含氮表面活性劑的液體石蠟式樣的生物降解指數(BDI)。從圖1可以看出，液體石蠟(LP)加入1.0%含氮表面活性劑后，其BDI明顯提高，表明所采用的4種含氮表面活性劑均為有效的生物降解促進劑。在添加量相同的情況下，4種含氮表面活性劑的促進效果差距較大，?；趸?AAO)的促進效果最好，BDI由加劑前的33.76%提高至72.13%；添加脂肪酸乙醇胺(FAE)、脂肪酸酰胺(FAA)、羥乙基咪唑啉(HIZ)的BDI依次為68.19%、65.95%、57.69%。

圖1 添加質量分數1.0%含氮表面活性劑的液體石蠟試樣的生物降解指數(BDI)

烴類化合物的生物降解過程是指其被相應的降解菌通過末端氧化生成脂肪醇、脂肪酸，再通過β-氧化形成酰基輔酶A，直至最終被降解的過程[17-18]。其微生物可利用性主要受烴類從不可被微生物利用的非水相到可被微生物利用的水相的傳質速率和烴類“暴露”于微生物細胞膜的濃度兩個因素的限制[19]。在這4種含氮表面活性劑的作用下，液體石蠟生物降解的這兩個因素均得到了強化，生物降解率得到顯著提高。酰基氧化胺是一種長鏈烷基叔胺的氧化物，也是一種易生物降解、性能溫和的兩性表面活性劑，同等添加量下，其結構中含有的?；蛊渚哂懈鼮槌浞值目杀晃⑸锢玫牡?。脂肪酸乙醇胺結構中含有親水性較強的羥基，其親水性強于脂肪酸酰胺，可使烴類化合物在水中的傳質速率加快，生物降解率也就高于脂肪酸酰胺。羥乙基咪唑啉是一種五元含氮雜環化合物，分子結構中雖有羥基和氨基2種親水基團，但因其正離子特性，容易吸附到帶負電的細菌表面，影響細菌的正常生理活動，烴降解酶不能靠近并破壞化合物分子內部結構，也就不能更好地被微生物利用，所以相比其它3種含氮表面活性劑，其促進液體石蠟生物降解的效果較差。

圖2為添加質量分數1.0%含氮表面活性劑液體石蠟生物降解中CO2生成量(mCO2)隨降解時間(t)的變化。從圖2可以看出，純液體石蠟和加劑液體石蠟生物降解中，CO2生成量隨降解時間均呈現波浪型變化，且后者CO2生成量始終多于前者；在第4 d至第6 d之間出現波峰，在第12 d則即將出現波峰。液體石蠟是一種多組分烴類混合物，其中許多成分都可成為微生物生長的碳源，出現2個波峰表明同生菌群在降解中出現了二次生長現象。液體石蠟在生物降解中CO2生成量變化曲線呈現波浪型的原因有兩個方面。一方面，降解初期，微生物生長處于適應新環境的遲緩期，活性較低，對碳源消耗不多；降解中期，微生物生長進入對數期和穩定期，碳源被充分消耗利用；降解后期，碳源和無機鹽養分被微生物進一步消耗利用，微生物生長進入衰亡期。另一方面，降解過程中，由于含氮表面活性劑增大了水中微生物與液體石蠟的接觸幾率，提高了微生物對液體石蠟的利用率，進而改善了液體石蠟的生物降解性。添加不同含氮表面活性劑液體石蠟在生物降解中CO2生成量不同的原因與含氮表面活性劑對液體石蠟生物降解指數影響原因相同。

圖2 添加質量分數1.0%含氮表面活性劑液體石蠟生物降解中CO2生成量(mCO2)隨降解時間(t)的變化

2.2 液體石蠟生物降解過程中體系油-水表面張力變化

圖3為添加質量分數1.0%含氮表面活性劑液體石蠟生物降解體系油-水界面張力隨降解時間的變化。從圖3可以看出，添加含氮表面活性劑的液體石蠟生物降解體系油-水界面張力明顯低于不加者，表明4種含氮表面活性劑均能降低體系的油-水界面張力，增大油-水界面面積，使微生物與礦物油的接觸機會增多，促進微生物對烴類化合物的吸收利用。這是含氮表面活性劑促進液體石蠟生物降解的原因之一。

圖3 液體石蠟生物降解體系油-水界面張力(F)隨降解時間(t)的變化

烴類有機物在生物降解中，表面活性劑主要通過乳化作用、提高假相溶解度和增強降解微生物膜的通透性[20]三方面的作用提高其生物可利用性。對烴類化合物的乳化和假增溶作用主要源于表面活性劑能夠降低界面的表面張力，并可通過形成膠束的形式將烴類化合物包裹在膠束內部，通過乳化或假增溶方式而脫附進入水相，從而增加烴類化合物的流動性。此外，烴類的難溶性使得攝取烴類的微生物在生長過程中往往伴隨著生物表面活性劑的生成。第三方面的作用主要體現在表面活性劑對微生物細胞膜狀態的改變。由于生物膜由大量磷脂分子組成，磷脂與生物表面活性劑有類似的結構和性能，所以細胞膜對生物表面活性劑具有較強的吸附作用。正是這種吸附作用影響到烴類化合物的脫附速率，同時改變細胞膜的通透性，使烴類化合物和中間代謝物的跨膜速率加快，有助于提高降解速率。

從圖3還可以看出，降解初期，在含氮表面活性劑乳化和提高假相溶解度的作用下，體系油-水界面張力迅速下降，而后略有上升，這可能是因為含氮表面活性劑隨碳氫化合物的降解而同時被消耗的結果；在降解第6 d，體系油-水界面張力迅速降低到最低值，這可能是因為隨著微生物生長進入穩定期，微生物產生的生物表面活性劑進一步降低了體系的油-水界面張力所致；在降解后期，體系油-水界面張力略有上升，這可能是隨著含氮表面活性劑消耗，微生物進入穩定期后期和衰亡期，生物表面活性劑的產生量逐步減少所致。

2.3 液體石蠟生物降解過程中微生物生長變化

圖4為液體石蠟生物降解體系的光密度(OD600)隨降解時間(t)的變化。由圖4可以看出，添加含氮表面活性劑液體石蠟生物降解體系的光密度(微生物濃度)高于不加者，表明4種含氮表面活性劑作為微生物營養物質加速了微生物繁殖，這是其促進液體石蠟生物降解的又一原因。從圖4還可以看出，添加含氮表面活性劑液體石蠟生物降解體系在降解第2 d，微生物進入其指數生長期，不加者在降解第4 d 進入指數生長期。這與圖3顯示的油-水界面張力變化規律相一致。即在降解反應初期，體系的油-水界面張力迅速下降，微生物得以充分利用烴類化合物，并在這一時期加速生長，大量繁殖；此后，隨著油-水界面張力的回升，微生物進入穩定生長階段，可能產生大量乳化劑和生物表面活性劑，從而又一次降低了油-水界面張力，直到微生物進入衰亡期，油-水界面張力回升到一定數值并趨于穩定。

圖4 液體石蠟生物降解體系的光密度(OD600)隨降解時間(t)的變化

3 結 論

(1)脂肪酸乙醇胺、脂肪酸酰胺、羥乙基咪唑啉、?；趸?種含氮表面活性劑可顯著促進液體石蠟生物降解。在添加量相同的情況下，含氮表面活性劑促進液體石蠟生物降解效果由大到小依次為酰基氧化胺、脂肪酸乙醇胺、脂肪酸酰胺、羥乙基咪唑啉。

(2)含氮表面活性劑在液體石蠟生物降解過程中，可有效降低體系油-水界面張力，使微生物與液體石蠟的接觸機會增多，促進微生物對烴類化合物的吸收利用，這是其促進液體石蠟生物降解性的原因之一。含氮表面活性劑作為微生物營養物，在液體石蠟生物降解過程中加速了微生物生長，使微生物數量增多，這是其促進液體石蠟生物降解性的又一原因。

[1] WILLING A. Lubricants based on renewable resources：An environmentally compatible alternative to mineral oil products [J].Chemosphere，2001，43 (1)：89-98.

[2] SOBISCH T, NIEBELSCHüTZ H.Effect of additives on biodegradation of PAH in soils[J].Colloids and Surfaces A： Physico-chemical and Engineering Aspects，2000，162(1)：1-1.

[3] 李秀艷，魏德洲. 氮磷營養鹽對微生物降解作用的影響[J].有色金屬，2000, 52(4) : 237-239.(LI Xiuyan, WEI Dezhou.Effect of nutrient phosphates and nitrates on biodegradation of microbe[J].Ferrous Metals, 2000, 52(4)：237-239.)

[4] LEE S H，LEE S, KIM D Y.Degradation characteristics of waste lubricants under different nutrient conditions [J].Journal of Hazardous Materials，2007，143(1)：65-72.

[5] 陳波水，方建華, 王九，等.油酰基甘氨酸在礦物潤滑油中的生物降解和摩擦磨損特性[J].石油學報(石油加工)，2009，25(增刊1)：6-9.(CHEN Boshui，FANG Jianhua，WANG Jiu, et al.Biodegrdation，friction and wear characteristics of oleoyl glycine in mineral lubrication oil[J].Acta Petrolei Sincia (Petroleum Processing Section)，2009，25(Suppl 1)：6-9.)

[6] CHEN Boshui, WANG Jiu，FANG Jianhua.Tribological performances of fatty acyl amino acids as green additives in lubricating oil[J].China Petroleum Processing & Petrochemical Technology，2010，12 (3)： 49-53.

[7] CHEN Boshui, WANG Jiu，FANG Jianhua.Enhanced biodegradability，lubricity and corrosiveness of lubricating oil by oleic acid diethanolamide phosphate[J].Tribology in Industry，2012，34(3)：152-157.

[8] CHEN Boshui, ZHANG Nan，WU Jiang，et al.Enhanced biodegradability and lubricity of mineral lubricating oil by fatty acidic diethanolamide borates[J].Green Chemistry，2013，15 (3)：738-743.

[9] CHEN Boshui, FANG Jianhua，WU Jiang.The influence of amino Acids on biodegradability，oxidation stability and corrosiveness of lubricating oil[J].Petroleum Science & Technology，2013，31(2)：185-191.

[10] 夏侃，陳波水, 張楠，等.月桂酸二乙醇酰胺對液壓油生物降解性及使用性能的影響[J].石油煉制與化工， 2013，44(3)：63-66.(XIA Kan，CHEN Boshui，ZHANG Nan， et al.Effects of lauric diethanolamide on the biodegradability and service performance of hydraulic oil[J].Petroleum Processing and Petrochemicals，2013，44(3)：63-66.)

[11] 夏侃，陳波水, 張楠，等.月桂酸二乙醇酰胺對聚α-烯烴理化性能的影響[J].后勤工程學院學報，2013，29(2)：64-69.(XIA Kan, CHEN Boshui, ZHANG Nan, et al.Effects of lauric diethanolamide on physico-chemical properties of poly-α-olefins[J].Journal of Logistical Engineering University，2013，29(2)：64-69.)

[12] CHEN Boshui, ZHANG Nan，FANG Jianhua，et al.Enhanced biodegradation of petroleum lubricant by bacterial strains harvested from oil contaminated soil[J].Petroleum Science & Technology，2014, 32(8)：938-946.

[13] 張楠，陳波水, 余瑛，等.潤滑油降解菌群的構建及其降解性能[J].石油學報(石油加工)，2010，26(增刊1)：182-186.(ZHANG Nan，CHEN Boshui，YU Ying, et al.Construction of bacterial consortium for lubricating oil and it’s biodegradating ability[J].Acta Petrolei Sinica (Petroleum Processing Section)，2010，26(Suppl 1)：182-186.)

[14] 王昆，方建華, 陳波水.潤滑油生物降解性快速測定方法的研究[J].石油學報(石油加工)，2004，20(6)：74-78.(WANG Kun，FANG Jianhua，CHEN Boshui.A fast method for evaluating biodegradability of lubricants[J].Acta Petrolei Sinica (Petroleum Processing Section)， 2004，20(6)：74-78.)

[15] WANG Jiu, CHEN Boshui，FANG Jianhua，et al.The influence of environment factors on lubricants biodegradation by orthognal design[J].Advanced Materials Research，2013，772：319-322.

[16] GB/T 22237—2008, 表面活性劑 表面張力的測定[S].

[17] BARATHI S, VASUDEVAN N.Utilization of petroleum hydrocarbons by pseudomonas fluorescens isolated from a petroleum-contaminated soil [J].Environment International，2001，26(5-6)：413-416.

[18] 華兆哲，陳堅, 倫世儀.石油烷烴降解與生物表面活性劑生產的相關性研究及進展[J].石油化工，1998，27(12)：925-929.(HUA Zhaozhe，CHEN Jian，LUN Shiyi.The relativity research progress of the biodegradation of petroleum hydrocarbons and synthesis of biosurfactant[J].Petrochemical Technology，1998，27(12)：925-929.)

[19] 梁生康，王修林, 單寶田.生物表面活性劑強化疏水性有機污染物生物降解研究進展[J].化工環保，2005，25(4)：276-280.(LIANG Shengkang，WANG Xiulin，SHAN Baotian.Development of biosurfactant-enhanced biodegradation of hydrophobic organic pollutants[J].Environmental Protection of Chemical Industry，2005，25 (4):276-280.)

[20] GUHA S, JAFFE P R.Biodegradation kinetics of phenanthrene partitioned into the micellar phase of nonionic surfactants[J].Environmental Science & Technology，1996，30(2)：605-611.

Effect and Mechanism of Nitrogenous Surfactants on Biodegradation of Mineral Lubricating Oil

WEI Youliang1, CHEN Boshui2, WANG Jiu2, ZHANG Nan2, FANG Jianhua2, WU Jiang2

(1.ThePLAof78416Army,Chongqing400054,China;2.DepartmentofOilApplication&ManagementEngineering,LogisticalEngineeringUniversity,Chongqing401311,China)

Impacts of four nitrogenous surfactants, viz. fatty acidic ethanolamine, fatty acidic amide and hydroxyl imidazoline, and acyl amine oxide, as additives on biodegradation of liquid paraffin were tested by a biodegradation tester. Thereafter, the optical density at 600 nm wavelength and oil-water interfacial tension of the biodegradation system were determined by ultraviolet-visible spectrophotometer and interfacial tension instrument, respectively. The results indicated that the biodegradability of liquid paraffin was markedly enhanced by nitrogenous surfactants, among which acyl amine oxide was the best candidate. The biodegradability of liquid paraffin increased from 33.76% to 72.13% after formulated with acyl amine oxide at mass fraction of 1.0%. The stimulation of nitrogenous surfactants to liquid paraffin biodegradation was ascribed to the dramatic decrease of oil-water interfacial tension and the obvious increase of microbial populations in the biodegradation system.

nitrogenous surfactant; mineral lubricating oil; liquid paraffin; biodegradation

2014-06-19

國家自然科學基金項目(50975282)資助

韋友亮，男，碩士研究生，主要從事環境友好添加劑研究；E-mail：18523690127@163.com

陳波水，男，教授，主要從事潤滑材料和液體燃料研究；Tel：023-86730832；E-mail：boshuichen@163.com

1001-8719(2015)05-1116-06

TE626.3

A

10.3969/j.issn.1001-8719.2015.05.013