海島棉GbCBF6基因克隆及其在逆境脅迫下的表達分析

李月，孔麗穎，李才運，李 翔，代培紅，劉曉東

（新疆農業大學 農學院／農業生物技術重點實驗室，烏魯木齊830052）

植物在生長發育過程中會面臨各種逆境脅迫， 其中非生物脅迫（低溫、干旱和高鹽）是影響植物生長發育、導致作物減產的主要因素。植物作為固著生物，不能趨利避害，為了克服這些不利的環境因素，其體內形成了一套復雜的調控機制，涉及生理、生化和與脅迫信號感知、信號傳導、基因表達相關的分子調控過程，最終通過代謝調控阻止細胞發生損傷，產生環境適應性［1］。轉錄因子是一類調控蛋白，通過特異序列組成的DNA 結合功能域，結合下游抗逆功能基因的啟動子區，誘導或抑制相應基因的表達，參與生命體不同生理生化途徑的調控。根據轉錄因子的初級結構或三維結構的相似性和多聚化結構域的結構特點，可以分為不同的家族。目前，研究表明在植物中存在至少64個轉錄因子家族［2－3］。其中，NAC、C2H2 鋅 指 蛋 白、bZIP 和WRKY 轉 錄因子家族是研究最多而且廣泛參與非生物脅迫的幾個大家族［4－5］。

CRT／DRE （C－repeat／dehydration－responsive element）順式作用元件結合因子CBF／DREB，屬于AP2／ERF亞家族的DNA 結合蛋白，能夠特異性結合脅迫誘導基因啟動子區域的CRT／DRE 序列，激活靶基因的表達［6］。如干旱和高鹽等非生物脅迫，能誘導CBF基因的表達，進而激活COR基因的表達，通過基因產物的作用增強植物的抗逆性［7］。該家族首先在擬南芥中被鑒定出來，是目前已報道的重要的參與脅迫應答的轉錄因子。在擬南芥中，響應非生物脅迫的6個CBF／DREB1基因，分別參與不同的逆境脅迫。CBF1／DREB1C、CBF2／DREB1B和CBF3／DREB1A受冷脅迫誘導，CBF4／DREB1D、DREB1E／DDF2 和DREB1F／DDF1 響 應 滲 透 脅迫［6，8］。目前，已經在許多植物中鑒定克隆出CBF／DREB基因，如番茄、油菜、玉米、水稻、大麥和小麥等［9－14］。不同植物克隆出的這些同源基因具有高度的保守性，表現出CBF 轉錄因子典型的結構特性，即C端有酸性激活區，N 端有核定位信號區，中間包含1個由60多個氨基酸組成的AP2結構域和2個CBF 特 征 基 序（PKKR／PAGRxKFxETRHP 和DSAWR）。AP2結構域含有3 個反向平行β折疊和1個α－螺旋結構，參與調控基因的上游啟動子區結合，第2個β－折疊的第14位纈氨酸和第19位谷氨酸，起著識別特異DNA 順式作用元件的作用，PKKP／RAGR 基序是核定位信號（NLS）［15］。根據氨基酸結構特征，該轉錄因子被分為6個亞類［16］。

棉花作為重要的纖維和油料作物，在全球范圍內廣泛種植，與水稻、小麥、玉米等主要作物相比，棉花具有較強的抗旱、耐鹽性。盡管如此，由于全球氣候變化和環境污染，非生物脅迫已成為影響棉花正常生長和產量的主要限制因子［17］。因此，揭示棉花耐逆的分子機理、克隆與逆境脅迫相關的重要功能基因對于棉花耐逆性和廣適應性的基因工程改良，擴大棉花生產具有重要的戰略意義。本研究利用生物信息學和PCR 的方法，從海島棉‘新海16’中克隆了1 個新的CBF基因GbCBF6，并對其序列特征、在高鹽、干旱和低溫脅迫下的表達模式進行了研究，為進一步了解CBF轉錄因子基因家族功能及其調控的分子機制提供理論依據，為利用基因工程手段提高棉花抗逆性提供重要信息。

1 材料與方法

1.1 材 料

實驗材料為海島棉品種‘新海16’，由新疆農業大學農學院作物遺傳育種室提供。選?。?5±2）℃培養間生長一致的15d苗齡的棉花幼苗，參照Li等［18］已報道的棉花脅迫處理方法，分別進行干旱、高鹽和4 ℃低溫處理。干旱處理：將棉苗置于干凈的濾紙上，在（25±2）℃、相對濕度45%、連續光照條件下進行自然干旱處理；高鹽處理：將苗的根部浸入200mmol／L NaCl溶液中；冷處理：棉苗置于盛有水（已預冷到4 ℃）的大燒杯中，放置于4 ℃培養箱，持續光照。每種脅迫處理10株棉花。分別于上述各處理的0、1、3、6和12h采集2株真葉葉片樣品，迅速置于液氮冷凍，用于總RNA 提取。

1.2 方 法

1.2.1 總RNA的提取和cDNA的制備 采用改良的CTAB法，參照Hu等［19］的方法提取棉花不同脅迫處理時間點葉片的總RNA，按照TaKaRa（公司）RNase－Free DNase I試劑盒的方法消化基因組DNA 污染，按照Promega（公司）M－MLV 反轉錄試劑盒操作說明合成單鏈cDNA，于－20 ℃保存，用于基因脅迫表達特征分析。

1.2.2 棉花GbCBF基因的克隆 以擬南芥TAIR（http：／／www.arabidopsis.org／index.jsp）的AtCBF2基因（AT4G25470.1）的序列作為BlastP查詢序列，在棉花EST數據庫（http：／／www.leonxie.com）、植物轉錄因子數據庫（PTFD，http：／／planttfdb.cbi.edu.cn）和美國國家生物技術信息中心（NCBI，http：／／www.ncbi.nlm.nih.gov）中搜索AP2／ERF亞家族基因與AtCBF2序列保守的EST序列，以其在已公布的棉花基因組數據庫（http：／／www.phytozome.net／）中比對，獲得了1個cDNA序列，然后根據此序列的ORF（Open reading frame）序列設計引物（GhCBF6F：5′－ATGGAGTATTTGGAGATTGATTCT－3′和GhCBF6R：5′－TTAGTAATGTCGCCATAAATCA－3′）。以海島棉‘新 海16’cDNA 為模板，以高保真聚合酶TransStar KD Plus（北京全式金）進行PCR 擴增。高保真Trans－Star KD Plus（TransGen）擴增反應體系為：5×TransStar KD Plus Buffer 10μL；2 mmol·L－1dNTP 5μL；TransStar KD Plus DNA Polymerase 1μL；模板1μL；正反向引物各1μL，補充水到50 μL。反應條件為：94 ℃2 min；94 ℃10s；60 ℃30s；68 ℃45s，35個循環，68 ℃10min。將擴增產物經質量濃度為1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，回收目的片段連接至Peasy－Blunt Zero克隆載體上（北京全式金），然后測序驗證。

1.2.3 棉花GbCBF基因的生物信息學分析 將所得的GbCBF基因的ORF用DNAStar翻譯成蛋白序列，并用EXPASy的ProtParam tool在線程序（http：／／web.expasy.org／cgi－bin／protparam／protparam）預測蛋白的分子量和等電點。用Psort（http：／／www.psort.org／）在線工具完成蛋白亞細胞定位預測。以AtERF1 的DNA 結合域（AtERF1－DNA－binding domain，1gcc）做模板，利用SWISSMODEL（http：／／swissmodel.expasy.org／workspace／）軟件預測棉花CBF 家族蛋白AP2／ERF 結構域的蛋白質三級結構模型。利用NCBI的BlastP對棉花蛋白序列進行氨基酸同源序列比對分析；由DNAMAN 軟件完成多重序列比對分析；用Clustal X 進行系統進化樹分析，采用鄰接法（Neighbor－Joining，NJ）方法構建系統發生樹，分支的可靠性評價采用靴帶分析（Bootstrap，1000），采用MEGA5對系統樹進行作圖。

1.2.4 棉花GbCBF基因的半定量RT－PCR 以GbCBF基因的GbCBF6F和GbCBF6R 引物為半定量RT－PCR 引物，以棉花GhACT2（基因登錄號：AY305724.1）為內參基因（ACT2F：5′－CGTACAACAGGTATTGTGCTGG－3′，ACT2R：5′－GAAATCCACATCTGCTGGAAGGTG－3′），以干旱、高鹽和4 ℃低溫處理不同時間點的海島棉‘新海16’的葉片cDNA 為模板，進行RT－PCR 擴增。RT－PCR反應體系為20μL，包括0.5～1μL cDNA、正反向引物（10μmol·L－1）各0.5μL、2μL 10×PCR 緩沖液（含Mg2＋）、0.5μL dNTPs（10 mmol·L－1each）和0.5μL EasyTaq DNA 聚合酶（北京全式金），用滅菌超純水補至20μL。在Eppendorf PCR儀上進行，反應條件為94 ℃預變性5min；98 ℃變性30s，55～60 ℃退火30s，72 ℃延伸30s，27～33個循環；72 ℃延伸10 min。PCR 產物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，并用Imaging DensitoMeter（Bio－Rad）中的Image Lab軟件進行拍照分析。

2 結果與分析

2.1 GbCBF6基因的克隆與序列分析

以‘新海16’葉片cDNA 為模板進行的PCR 擴增結果表明，從海島棉中克隆1個CBF基因cDNA序列，命名為GbCBF6，提交GenBank 獲得基因登陸號KR233255。GbCBF6基因的最大開放閱讀框（ORF）為753bp（圖1），編碼251 個氨基酸，用DNAStar軟件預測該蛋白質分子量為27.82kD，等電點為7.68?！潞?6’中的GbCBF6基因的全長ORF序列與其對應基因組中的基因編碼序列完全一致，結果表明GbCBF6基因不含有內含子。

用DNAMAN 軟件對GbCBF6 基因編碼的氨基酸序列進行多重序列比對分析。結果表明，Gb－CBF6蛋白具有CBF 蛋白典型的結構特點，包含1個AP2 結 構 域 和2 個CBF 特 征 序 列，PKKR／PAGR 基序和DSAWR 基序，和1個C－端的酸性結構域（圖2）。

目前已在棉花中克隆了6 個CBF同源基因，GhDBP1、GhDBP2、GhDBP3、GhDREB、GhDREB1和GhDREB1L，其GenBank登錄號分別是AY174160、AY619718、DQ224382、AF509502、AY920495 和DQ409060，對這6個GhCBF基因與本研究克隆的GbCBF6基因進一步比對分析，同時以擬南芥AtCBF1、AtCBF2 和AtCBF3 基 因 為 參 照。結 果如 表1所 示，GhDBP1 和GhDREB基 因 編 碼 的 蛋白 氨 基 酸 序 列 的 相 似 性 為1 0 0%；GhDREB1和GhDREB1L之間相似性為98.2%，應該為同一基因。另外這6個基因與已克隆的GbCBF6基因相似性均低于38.5%，而且除GhDREB1 和GhDREB1L外，GbCBF6 與 擬 南 芥AtCBF1、AtCBF2、AtCBF3基因的相似性要高于已克隆的棉花其他CBF同源基因。

圖1 棉花GbCBF6基因PCR 產物的電泳分析Fig.1 Electrophoresis of PCR product of cotton CBFgenes

圖2 不同植物CBF／DREB蛋白氨基酸序列比對Fig.2 Alignment of amino acid sequences of CBF／DREB from different plants

圖3 GbCBF6蛋白與其他物種CBF蛋白的系統進化樹Fig.3 Phylogenetic tree of GbCBF6and CBF proteins from other species

2.2 棉花GbCBF6蛋白系統進化樹分析

圖4 GbCBF6蛋白三維結構預測Fig.4 Three－dimensional structure prediction of GbCBF6protein

Sakuma等［16］根據CBF／DREB 轉錄因子的結構特點，把該類蛋白分為A－1～A－6共6個亞組，我們以此為基礎，選取擬南芥CBF／DREB不同亞類的基因，并從其他的單雙子葉植物包括水稻（Oryza sativa）、大麥（Hordeumvulgare）、玉米（ZeamaysL.）、棉 花（Gossypiumhirsutum）、大 豆（Glycine max）中選取已克隆并鑒定的CBF／DREB轉錄因子基因序列，用于構建系統進化樹（圖3）。圖3顯示，GbCBF6蛋白和A－1 亞組成員AtCBF1、AtCBF2、AtCBF3和HvCBF1聚為一類，屬于CBF／DREB轉錄因子A－1 亞類。與擬南芥AtCBF1、AtCBF2、AtCBF3蛋白相似性在40%以上（表1）。

利用AtERF1 DNA 結 合 域（AtERF1－DNAbinding domain，1gcc）做模板，利用SWISS－MODEL（http：／／swissmodel.expasy.org／workspace／）軟件對棉花CBF 家族蛋白AP2／ERF 結構域進行蛋白質三級結構模型預測。結果如圖4所示，GbCBF6 蛋白的三維結構與AtERF1（PDB ID：1gcc）的三級結構模型圖相似，均含有CBF 轉錄因子典型結構特點，即含有3個β折疊和1個α－螺旋結構，進一步證實獲得的GbCBF6 基因屬于CBE／DREB轉錄因子家族。此外，利用在線軟件Psort（http：／／www.psort.org／）預測GbCBF6 蛋白定位在細胞核中，屬于核定位轉錄因子。

表1 棉花CBF 基因相似性分析Table1 Similarity analysis of CBFgenes cloned in cotton

圖5 各種非生物脅迫下GbCBF6基因的表達譜Fig.5 Expression profiles of GbCBF6under various abiotic stresses

2.3 GbCBF6基因的誘導表達分析

用高鹽、干旱和低溫3種非生物脅迫處理棉花，可以較全面地反映GbCBF6 基因在非生物脅迫中的應答機制。RT－PCR 結果（圖5）表明，GbCBF6基因對以上3種逆境脅迫均有應答，但是表達模式存在明顯差異。在鹽處理下，GbCBF6基因在處理3h時表達量最低，幾乎檢測不到，在0、1、6和12h的表達量基本相同。干旱處理下，GbCBF6基因隨著脅迫處理時間的延長，表達量逐漸下降，在12h時最低；而在低溫處理下，GbCBF6基因隨著脅迫處理時間的延長，基因表達量逐漸升高。

3 討 論

由于全球耕地面積的減少，糧棉爭地矛盾加劇，積極開發旱地、鹽堿地植棉潛力，將成為棉花生產保持相對穩定的重要應對策略，因此培育多抗棉花品種已是當前棉花育種的重要目標。轉錄因子在植物耐逆改良中發揮著關鍵作用。近年來，從棉花植株分離耐逆關鍵轉錄因子基因，應用基因操作技術創制棉花耐逆新材料已成為研究重點。如CCCHtype的鋅指結構基因GhTZF1、WRKY 轉錄因子基因GhWRKY39－1，它們過表達，均能增強植物的抗逆性［20－21］。

本研究利用生物信息學和PCR 的方法在海島棉中克隆了1 個與擬南芥CBF2 同源的GbCBF6基因。和已報道的雙子葉植物CBF基因一樣，該基因無內含子，其預測的編碼產物大小與擬南芥CBF轉錄因子相似，表現出CBF轉錄因子的主要結構特點。GbCBF6蛋白在N 端區域有1 個堿性氨基酸鏈［PKK（R）RAGRK（R）K（V）FR（Q／K）］，與擬南芥AtCBF1、AtCBF2、AtCBF3 中的核定位信號一致［6］。GbCBF6蛋白結構的高度保守性表明，它們可能和其他植物CBF 蛋白一樣在植物抗逆調控中扮演重要角色。

研究表明，將擬南芥植物暴露在低溫環境下，通過組成型表達AtCBF1、AtCBF2 或AtCBF3 基因增強植物的耐逆性，包括抗凍性［22］。近年來，利用RNA 干擾和反義技術分別下調AtCBF1 和AtCBF3基因表達，導致冷處理的植物抗凍性下降25%～40%［23］，這些結果表明擬南芥AtCBF基因參與植物響應和耐受低溫脅迫。目前已經在多種植物中鑒定出響應低溫脅迫的CBF基因［24］。一般認為蛋白質具有相似的結構域可能具有相似的生物學功 能，GbCBF6 蛋白和A－1亞組成員AtCBF1、AtCBF2、AtCBF3聚為一類，與它們的相似性均在40%以上，推測可能發揮相同的功能。因此本研究分析了GbCBF6基因在高鹽、干旱和低溫逆境脅迫處理下基因的表達情況。結果表明，GbCBF6基因受4℃低溫上調表達，受干旱脅迫下調表達，而高鹽處理下其表達量先是下降，然后再增加，推測Gb－CBF6基因除參與棉花低溫信號傳導，也參與了棉花滲透脅迫信號傳遞調控網絡，在海島棉抵抗不同逆境中可能扮演重要的角色。

關于棉花CBF／DREB基因，分別報道了6 個CBF基因［25］，本研究經過比對發現，其中有2對基因相似性高達98%以上，應該為同一基因。因此，認為棉花上已有4個CBF基因被鑒定出來。它們分別屬于DREB家族的A－1亞組、A－4亞組、A－5亞組和A－6亞組。本研究的GbCBF6蛋白與這4 個棉花CBF蛋白氨基酸相似性均低于38.5%，推測為棉花新的CBF基因，而且該基因與擬南芥AtCBF1、AtCBF2、AtCBF3蛋白一起聚類在一個亞組。結果暗示，與已克隆的陸地棉4 個GhCBF基因相比，除屬于A－1亞組的1 個陸地棉CBF基因（GenBank 登陸號為DQ409060 和AY920495）外，本研究克隆的GbCBF6 基因與擬南芥AtCBF1、AtCBF2、AtCBF3基因編碼的蛋白氨基酸的相似性均高于已克隆的棉花其他CBF同源基因。以上結果顯示本研究克隆的GbCBF6 基因為新的未報道的CBF同源基因，而且功能可能與已報道的擬南芥抗逆AtCBFs基因更加接近。

綜上，以上研究結果為研究GbCBF6基因的功能以及利用轉基因技術培育抗凍棉花新品種奠定堅實的前期研究基礎，關于該基因的具體功能和調控機理是未來研究工作的重點。

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