‘馬哈利’櫻桃雄性不育細胞學觀察

李 彬，蔡宇良＊，趙曉軍，宛 甜，高天翔

（1 西北農林科技大學 園藝學院，陜西楊凌712100；2 銅川市園藝工作站，陜西銅川727031）

‘馬哈利’櫻桃（Prunusmahaleb‘Mahaleb’）屬于薔薇科（Rosaceae）李屬（Prunus），是西北農林科技大學園藝學院從匈牙利引進的櫻桃育種資源植物，由于其抗根癌病性強，又具有矮化、耐鹽堿等許多優良的生物學特性［1］，是世界性的甜櫻桃砧木，現己成為西北地區甜櫻桃的主要砧木之一。關于‘馬哈利’生殖發育的研究較少，張雪等［2］對‘馬哈利’櫻桃的大孢子發生和雌配子體發育進行了研究，但并沒有涉及到雄性不育的情況，‘馬哈利’櫻桃結實率低可能與雄性不育有關。果樹雄性不育的現象非常普遍，前人在果樹雄性不育的機理上也做了相關基礎研究，劉玲等［3］在棗中發現了雄性不育的現象；沈元月等［4］在白桃的雄性不育研究中發現了小孢子消失的現象；杏的雄性不育品種‘Trevatt Blue’（P.armeniaca）中也觀察到了小孢子的退化問題［5］，櫻桃的雄性不育研究未見報道，本試驗就在‘馬哈利’櫻桃觀察到了雄性不育現象。

有效利用‘馬哈利’櫻桃雄性不育株，能夠大幅度提高雜交效率［6］，而且在保持苗木一致性，保證栽培苗木整齊度方面也有很大的意義［7］。本研究在對‘馬哈利’櫻桃雄配子體發育過程進行解剖學研究的基礎上，以期在試驗站保存的‘馬哈利’野生種質資源中尋找到雄性不育株系，通過對不育株和正常可育株花藥發育過程的比較，闡明其雄性不育發生的時期、方式和特征，完善對‘馬哈利’櫻桃生殖生物學的研究，為進一步利用‘馬哈利’櫻桃雄性不育特性培育櫻桃優質苗木提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 材料獲得與采集

試驗材料采自西北農林科技大學眉縣櫻桃試驗園。試驗品種為正常開花結實的‘馬哈利’實生種，共6株，經過花粉活力測定等試驗，確定其中1株為雄性不育株，其余5株為正常發育株（對照）。取樣時間為2013年8月到2014年5月，2014年3月1日花芽萌動開始至成熟花粉形成（4月1日）期，每天采集不同發育狀態的花芽或花蕾20個，其余時間每2周取樣1次，每次采集10個樣。

‘馬哈利’花芽取樣時從整個樹體的東西南北四個方向，上中下三層以及內外膛分別取樣，以確保試驗結果不會因為花芽受到環境因素與生長狀態的影響而造成誤差。

開花期取少量未經授粉‘馬哈利’新鮮花芽，剝取其中花粉，常規石蠟切片方法（如下）和常規干燥處理，分別用作顯微鏡和電鏡掃描材料。

1.2 方 法

1.2.1 石蠟切片 用于細胞學觀察的花芽，采用FAA 固定液固定，4 ℃冰箱保存。按照常規石蠟切片法制片，分別經過脫水、透明、浸蠟、包埋步驟后切片，期間采取愛氏蘇木精整體染色，對樣品進行橫切與縱切，切片厚度8μm，中性樹膠封片［8］，選取具有代表性并且清晰的樣本，在Olympus BX－51型光學顯微鏡下進行觀察并照相。

1.2.2 掃描電鏡 用于電鏡下掃描的材料，用戊二醛固定，經過脫水、臨界點干燥、上銅臺噴金等步驟，在JSM－6360LV 掃描電鏡下對花藥和花粉進行觀察并照相。

2 結果與分析

2.1 ‘馬哈利’櫻桃雄性不育系花藥的發育過程

‘馬哈利’櫻桃雄性不育系的花藥發育在孢原細胞時期到四分體時期的表現與正常株系植株的表現基本一致，都是在3月初花芽分化結束，3月1日左右開始出現雄蕊原基（圖版Ⅰ，1），孢原細胞隨后分化形成，具有很明顯的細胞核。花藥壁由孢原細胞分裂產生的初生壁細胞分裂分化而成，由外向內共有表皮、藥室內壁、中層（2層）和絨氈層5層細胞。

初生造孢細胞是由孢原細胞分裂而來，發育形成小孢子母細胞（圖版Ⅰ，2）后進入減數分裂時期。小孢子母細胞經過第一次減數分裂形成2個子核，隨后進入減數分裂Ⅱ期，再次分裂之后形成四面體形狀的四分體，外面由胼胝質壁包圍（圖版Ⅰ，3）。花藥壁細胞則伴隨著小孢子發育過程也持續產生著變化，早期的絨氈層細胞呈長方形，細胞較大，細胞質濃厚，排列整齊。發育過程進行到單核小孢子形成時，絨氈層細胞明顯退化（圖版Ⅰ，4）直至完全消失，花藥壁最終分化發育成4室蝶形腔狀形。小孢子細胞從四分體中分離出后，細胞質濃，細胞核大且位于細胞中央，經過單核靠邊期（圖版Ⅰ，5）后，最終經過發育后形成成熟花粉粒（圖版Ⅰ，6）。

與對照相比，雄性不育株系花藥發育則從四分體時期開始出現異常，在形成正常的四分體之后，絨氈層細胞液泡增大且細胞形狀不規則（圖版Ⅰ，7），并沒有正常退化而是向藥室中央收縮，排列開始混亂（圖版Ⅰ，8），在此過程當中，四分體形態變異，出現了退化的跡象。絨氈層細胞繼續擴增，把敗育的小孢子圍在藥室中央，形成整體團塊狀，最終，異常的絨氈層和敗育的小孢子核、質開始互融，小孢子已經完全無法正常發育并逐漸解體（圖版Ⅰ，9），最后全部消失，不育株的花藥內花粉囊成為了同為蝶形腔狀形的空腔（圖版Ⅰ，10）。觀察還發現少部分不育株可以形成少量的成熟花粉，著色較深，但是大部分花粉粒在藥室破裂時著色淺呈現無活性狀態（圖版Ⅰ，11），出現敗育現象。另外觀察到可育的花粉粒總是貼近絨氈層和纖維層（圖版Ⅰ，12），一方面可能是為藥壁破裂散粉做準備，另一方面花粉為了吸收足夠的營養。

本試驗統計表明從雄性不育株上采集的樣品當中，91.67%實驗樣中的小孢子在四分體時期之前正常發育，從四分體時期開始絨氈層細胞和小孢子發育出現異常并且最終出現敗育的現象；其余8.33%的樣品發育情況并沒有出現異常，與花粉正常發育的對照組相比在發育過程并無區別，四分體時期之后小孢子發育成為花粉，絨氈層正常退化，但是在藥壁開裂時期只有極小部分花粉粒具有活力，絕大部分呈現出無活力的狀態，出現敗育現象。

2.2 開花期花藥和花粉的掃描電鏡觀察

雄性不育系的植株與正常植株相比，除了在花粉發育過程當中的區別之外，在開花期也有很顯著的特征。在同一比例尺下，正常的花藥不僅體積大，而且飽滿，從外形上可以明顯看出4室蝶形的形狀（圖版Ⅰ，13），而敗育的花藥外形干癟，體積遠小于正常花藥（圖版Ⅰ，14）。將花藥剝開繼續觀察，可以觀察到正常成熟花藥出粉量大（圖版Ⅰ，15），且花粉粒飽滿呈扁三角形狀，外具橫紋，且有3 個萌發溝（圖版Ⅰ，16）。相反可以看到，敗育花藥跟上述石蠟切片觀察結果相同，絕大部分花藥是空的（圖版Ⅰ，17），極個別有出粉的花粉粒也呈敗育狀，干癟并且看不出形狀（圖版Ⅰ，18）。

3 討 論

3.1 ‘馬哈利’雄性不育發生的形態與時期

‘馬哈利’櫻桃的小孢子形態在四分體時期前并沒有發現異常，隨后在四分體時期的絨氈層細胞排列混亂，部分細胞當中出現液泡，絨氈層膨大并與小孢子粘連在一起，阻礙了小孢子正常的減數分裂，最終一同降解消失，不能形成正常的花粉粒，最終出現敗育現象，這與韓愛華等［9］對“新梨7號”花粉敗育途徑的研究、羅來水等［10］在桃樹雄性不育的研究等關于雄性不育株系花粉發育觀察的結果相一致。但關于其小孢子發育異常的生化及分子機制還有待進一步深入研究。

根據Laser針對CMS類型花粉敗育時期的統計結果和Kaul針對NMS類型敗育時期的統計結果來看［11］，四分體時期以后敗育比例達到70%，減數分裂前、減數分裂和減數分裂后各時期敗育的比例大體相同，從孢原細胞分化開始，每個過程都可能出現導致雄性不育發生的異常現象，本試驗結果中四分體時期以后出現敗育現象，符合前人的研究結果。

3.2 ‘馬哈利’雄性不育發生的原因

在本次觀察過程中，還出現了一部分花粉未完全成熟時花藥壁就提前破裂散粉的情況，這部分花粉著色淺且活力弱，可能是‘馬哈利’雄性不育的另一種類型。結合絨氈層液泡化并且膨大的現象，以及對敗育花粉粒形態學觀察，可以確認‘馬哈利’雄性不育跟小孢子發育時期營養物質的供應有著比較密切的聯系，而且發育不整齊，內含物不足，形態不飽滿的花粉也會造成坐果率和結實率偏低。綜合‘馬哈利’敗育的整個過程，絨氈層細胞的異常分化起到了很大作用。絨氈層細胞是包裹在花粉母細胞之外、藥壁最內層的一層細胞［12］。在花粉形成和發育的過程當中，絨氈層一個很重要的作用就是在小孢子發育過程當中轉運營養物質［13］。另外一方面，絨氈層在發育過程中也會分泌和提供胼胝質酶、孢粉素和花粉囊液等對發育有重要影響的物質［14］。參考前人研究和本試驗結果，‘馬哈利’在四分體時期絨氈層液泡化并且異常膨大，一方面，其細胞膨大的過程當中本身消耗了大量的物質，造成了發育物質對外運輸的不足，同時擠壓了小孢子的發育空間；另一方面，絨氈層細胞異常發育導致分泌物不足或者沒有分泌物也嚴重影響了諸如四分體正常釋放小孢子或者小孢子正常減數分裂等發育過程。

另外，耿三省［15］、葉要妹［16］等在對辣椒、百日草等雄性不育系材料進行研究的過程當中，都對花器做了形態學觀察，部分植物的不育系會出現花朵張開度、花瓣或者花絲等數據有別于正常發育植株的情況，但是在本試驗觀察過程中發現，‘馬哈利’雄性不育系的花器與正常可育植株的花器是沒有區別的，維管束和花絲等組織均正常發育，這為田間尋找雄性不育株系帶來了困難，但是從側面證明其他的藥壁組織的發育和‘馬哈利’雄性不育并沒有很明確的關系。

本試驗表明，藥壁組織及其他組織均沒有直接出現敗育或者營養供給異常的現象，表明‘馬哈利’雄性不育株系的花粉在發育過程當中破壞了絨氈層的正常發育，致使絨氈層細胞異常膨大和提前的程序性死亡，進而造成了小孢子的異常發育。一般認為絨氈層發育和行為的異常是雄性不育的基因調控所導致的，它們的表達與否涉及到了敗育現象是否出現［17］，目前關于‘馬哈利’雄性不育決定基因的研究還處于空白階段，雄性不育性狀的顯隱性、控制基因的作用時期以及發生敗育的過程當中水分營養運輸、內源激素分泌等問題還需要通過分子標記和生理生化實驗來解決［18］，但關于其小孢子發育異常的生化及分子機制還有待進一步深入研究，這樣才能明確‘馬哈利’雄性不育的機理和原因，為進一步利用提供理論基礎和技術保障。

在果樹的發育過程中，其雄性育性是環境調控一定基因型表達出的結果，在考慮到雄性不育基因等遺傳因素帶來影響的同時，還發現‘馬哈利’的可育花粉總是靠近絨氈層，距離藥壁比較近，跟生境敏感型雄性不育的部分特征相似［19］，這表明‘馬哈利’雄性不育可能在一定程度上也會受到環境的影響，結合敗育過程跟營養物質缺失有關，建議在‘馬哈利’小孢子分化發育的敏感時期，加強果園的水肥管理，盡量創造好的發育條件，提高受精成活率，達到育種和高產的目的。

圖版Ⅰ Ta.絨氈層；Tt.四面體型四分體PlateⅠ Ta.Tapetum；Tt.Tetrahedral tetrads

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