外源亞精胺對鹽脅迫下菠菜葉綠素合成前體含量的影響

王 穎，郭世榮，束 勝，劉 芳，劉 濤，孫 錦

（1 南京農業大學 園藝學院，南京210095；2 南京農業大學（宿遷）設施園藝研究院，江蘇宿遷223800）

鹽脅迫嚴重影響植物的生長和發育，過量鹽離子主要通過引發滲透脅迫、離子毒害和氧化脅迫，致使植物的蛋白質合成、能量和脂類的代謝等生理代謝受抑制，也影響光合作用器官的組分，如酶、光合色素、類囊體膜蛋白及膜脂等［3－4］，并使得植物葉綠素（Chlorophyll，Chl）合成代謝受阻、含量降低，從而影響植物的光合作用。植物則通過調節氣孔開度、合成滲調物質、區隔過量離子及清除活性氧物質等響應來減輕脅迫損害［5］。

Chl是綠色植物葉綠體內參與光合作用的重要色素，在光合作用的能量捕獲及傳遞中起著重要作用［6］。植物體內Chl的合成與分解代謝一般處于一個動態平衡，失衡就會產生異常。Chl的生物合成途徑為：谷氨酸（glutamate，Glu）→δ－氨基酮戊酸（δaminolevulinic acid，ALA）→膽色素原（porphobilinogen，PBG）→尿卟啉原Ⅲ（uroorphyrinogenⅢ，Uro Ⅲ）→原卟啉Ⅸ（protoporphyrin Ⅸ，ProtoⅨ）→鎂原卟啉Ⅸ（Mg－protoporphyrin Ⅸ，Mg－protoⅨ）→原葉綠素酸（protochlorophyll，Pchl）→葉綠素a（Chlorophyll a，Chl a）→葉綠素b（Chlorophyll b，Chl b）［7］，生物合成的任何一個步驟出現障礙，都會影響Chl的正常合成，從而引起Chl含量降低［8］；病害、鹽脅迫、溫度等生物和非生物脅迫都會破壞Chl合成和降解的動態平衡，從而引起Chl含量的變化［9］。許多研究表明，植物Chl含量在鹽脅迫下降低［10－11］，但也有Chl含量升高的報道［12－13］，并且Chl含量與光合作用效率有正相關關系［11］。

多胺（polyamines，PAs）是一類廣泛存在于植物體內的具有強烈生理活性的低分子量脂肪族含氮堿，與逆境脅迫關系密切［14］。植物體內的PAs主要包括腐胺（Put）、亞精胺（Spd）和精胺（Spm）。許多研究表明，PAs可提高鹽脅迫下植物的光合色素含量，從而改善光合作用，提高植物的耐鹽性［15－16］。然而，PAs提高鹽脅迫下植物葉片Chl含量的原因尚不清楚。菠菜（SpinaciaoleraceaL.）Chl含量豐富，是研究植物Chl代謝和光合作用的理想材料。為此，本試驗以耐鹽性較弱的菠菜品種‘全能菠菜’［17］為材料，通過葉面噴施Spd，研究了外源Spd對鹽脅迫下菠菜Chl合成前體含量的影響，探討外源Spd緩解鹽脅迫下菠菜Chl合成受阻的原因，為利用外源Spd提高作物鹽脅迫耐性的實踐提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

選用耐鹽性較弱的菠菜（SpinaciaoleraceaL.）品種‘全能菠菜’為材料，種子購自于株洲湘蔬種業有限公司；Spd購自Sigma公司。

1.2 材料培養與處理設置

試驗于2013年10月至2014年4月在南京農業大學牌樓實驗基地自控溫室內進行。將菠菜種子在15 ℃去離子水中浸泡12h后放置于20 ℃恒溫箱中催芽，待芽長2 mm 時播種于50cm×50cm的石英砂盤內。子葉展開后，每2d澆1次1／4倍的Hogland營養液；幼苗長至5 片真葉時，定植于20L的水培箱中，箱內盛有1／2Hogland營養液，水培箱上覆蓋有5×6 個定植孔的泡沫板，每孔植1株，實驗期間用氣泵24h向水箱內通氣。

試驗分3部分進行：①NaCl對菠菜生長和Chl含量的影響試驗。在菠菜定植后7d，在營養液中分別一次性加入25、50、75、100、150、200、250、300和350mmol·L－1的NaCl，以正常營養液栽培（不進行鹽處理）為對照。處理14d后取樣測定植株生長和Chl含量等指標；②Spd對NaCl脅迫下菠菜生長與Chl含量的影響試驗。菠菜定植后7d，以試驗①篩選出的鹽濃度處理菠菜植株，同時葉面分別噴施0.01、0.05、0.1、0.5、1.0和1.5mmol·L－1Spd溶液，以不噴施Spd而噴施等量清水為對照。處理14d后測定植株生長和Chl含量等指標；③外源Spd對鹽脅迫下菠菜葉綠素前體含量的影響試驗。因預備試驗中正常營養液栽培用Spd處理，對菠菜Chl含量沒有影響，故以試驗①和試驗②篩選出的鹽濃度和Spd濃度為依據，設置如下處理：正常營養液栽培并噴施等量清水（CK）；營養液中加入250 mmol·L－1NaCl（NaCl）；鹽脅迫7d 后葉面噴施Spd溶液（NaCl＋Spd）。分別在處理后第0、1、3、5、7天測定葉綠素合成前體ALA、PBG、UroⅢ、ProtoⅨ、Mg－protoⅨ、Pchl、Chl a及Chl b含量。上述試驗均重復3次，隨機排列，測定結果取平均值。

1.3 測定指標及方法

1.3.1 植株生長指標 各處理材料分別取10株，用去離子水洗凈植株，吸干表面水分，先分別測定每株地上部和地下部鮮重（g），再經105℃殺青15min，75℃烘至恒重，測定每株地上部和地下部干重。

1.3.2 Chl含量 Chl含量測定參考沈偉其［18］的乙醇、丙酮、水混合液浸提法（體積比為4.5∶4.5∶1）。

(3)該種原料適合生產粒度不大于2.8 μm、松裝密度不大于1.0 g/cm3的韓國喜新鉬粉，但是一次過篩率則較低。

1.3.3 葉綠素合成前體含量 Proto Ⅸ、Mg－protoⅨ和Pchl含量測定參考Hodgins［19］的方法；UroⅢ含量測定參考Bogorad［20］的方法；ALA 含量測定參考Richard［21］方法；PBG 含量測定參考Bogorad［20］的方法。

1.4 數據分析

實驗數據采用SAS軟件Duncan’s多重比較法進行顯著性測驗分析。

2 結果與分析

2.1 不同濃度NaCl和Spd對菠菜植株生長的影響

由表1可知，隨著NaCl處理濃度的升高，菠菜植株地上部分和地下部分的干重、鮮重均呈先升高后降低趨勢，并大多在鹽濃度為25mmol·L－1時達到最大值，較對照均明顯升高，且除地下部干重外均達到顯著水平；但隨著NaCl濃度繼續升高，菠菜植株生長量逐漸降低，植株地上部分干重和鮮重大多在150mmol·L－1時就顯著低于對照，地下部分的干重、鮮重也最終顯著低于對照；在鹽濃度為250 mmol·L－1時，菠菜植株總鮮重、植株總干重、地上部鮮重、地上部干重、地下部鮮重和地下部干重分別較對照分別降低了57.23%、53.08%、63.14%、55.05%、42.22%和42.86%，且均達到顯著差異水平（表1）。

同時，250 mmol·L－1NaCl脅迫下，菠菜植株葉面噴施不同濃度Spd后，植株的生長量均有不同程度增加，且隨著噴施濃度的增大呈先上升后下降趨勢，并在1.0 mmol·L－1Spd時均達到最大值，此時植株鮮重、干重、地上部鮮重、地上部干重、地下部鮮重和地下部干重較單純鹽脅迫處理（CK）分別顯著提高了62.83%、71.19%、60.57%、71.74%、70.31%和69.23%（表1）。另 外，圖1顯 示，250 mmol·L－1NaCl脅迫下，噴施不同濃度的Spd均可促進菠菜植株生長，其中1.0mmol·L－1Spd的作用最為明顯。

圖1 外源Spd對鹽脅迫下菠菜生長的影響Fig.1 Effects of exogenous Spd on the growth of spinach under salt stress

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可見，鹽脅迫濃度為250mmol·L－1時，菠菜植株的干重、鮮重的降低幅度均在50%左右；在此基礎上再噴施1.0mmol·L－1Spd又可顯著提高菠菜植株的干重、鮮重，并且提高幅度在5 0%以上。盧樹昌等［22］認為，植物生長量降低50%左右時是植物的臨界鹽濃度。因此，將250mmol·L－1作為該菠菜品種的臨界鹽濃度，并作為后續試驗中采用的鹽脅迫濃度，同時將1.0mmol·L－1作為后續試驗中采用的Spd濃度。

2.2 不同濃度NaCl和Spd對菠菜葉片Chl含量的影響

隨著NaCl濃度升高，菠菜葉片Chl含量［Chl a、Chl b和Chl（a＋b）］也呈先增高后降低趨勢，并均在50mmol·L－1時達到最大值，且顯著高于對照；隨后，菠菜Chl含量又逐漸降低，當NaCl濃度超過150mmol·L－1時，Chl含量已顯著低于對照水平；之后，Chl含量維持在相對穩定的較低水平。當鹽濃度為250 mmol·L－1時，Chl a、Chl b 及總Chl含量分別較對照顯著降低了42.31%、54.55%和44.53%（表1）。同時，在250 mmol·L－1NaCl脅迫條件下，噴施不同濃度Spd均可不同程度提高菠菜葉片Chl含量，且隨Spd濃度升高表現出先升高后降低的趨勢，且均在1.0mmol·L－1時達到最大值，此時Chl a、Chl b及Chl（a＋b）含量分別較單純鹽脅迫處理（CK）顯著提高了46.24%、51.85%和47.11%（表1）。可見，菠菜葉片葉綠素含量在較低濃度（≤100mmol·L－1）鹽脅迫下不同程度被促進，但較高濃度（≥150 mmol·L－1）鹽脅迫下卻得到顯著抑制；250 mmol·L－1鹽脅迫下，菠菜葉片Chl含量降低50%左右，而噴施1.0 mmol·L－1Spd 后可使Chl含量顯著升高50%左右。

2.3 外源Spd對鹽脅迫下菠菜葉片葉綠素合成前體含量的影響

圖2 外源Spd對鹽脅迫下菠菜葉片中ALA 和PBG 含量的影響Fig.2 Effects of exogenous Spd on ALA and PBG contents of spinach leaves under NaCl stress

2.3.1 ALA和PBG含量 圖2顯示，在250mmol·L－1NaCl脅迫下，菠菜葉片中ALA 和PBG 含量均比對照（CK）顯著提高，且隨鹽脅迫時間延長呈遞增趨勢，兩者含量在鹽脅迫處理第7天較對照分別顯著提高了86.76%和42.70%；在鹽脅迫條件下噴施1.0mmol·L－1Spd，菠菜葉片中ALA 和PBG 含量總體呈降低趨勢，并接近對照水平，兩者含量在Spd處理第7天時分別顯著低于鹽脅迫處理52.76%和50.10%。

2.3.2 Uro Ⅲ含量 由圖3可看出，菠菜葉片中UroⅢ含量在NaCl脅迫下顯著比對照降低，并隨鹽脅迫時間延長呈遞減趨勢，其在鹽脅迫第7天較對照顯著降低38.57%；在鹽脅迫條件下，菠菜葉片UroⅢ含量在1.0mmol·L－1Spd處理第1、3天時與鹽脅迫處理接近，隨后逐漸增加，在Spd處理第7天時已顯著高于鹽脅迫處理52.16%，并與同期對照接近。

2.3.3 ProtoⅨ、Mg－protoⅨ和Pchl含量 由圖4可知，在NaCl脅迫條件下，菠菜葉片中Proto Ⅸ、Mg－protoⅨ和Pchl含量均比對照顯著降低，且隨鹽脅迫時間延長呈緩慢遞減趨勢，它們在鹽脅迫第7天 較 對 照 分 別 顯 著 降 低6 3.7 9%、4 4.4 4%和69.23%；在鹽脅迫條件下，噴施Spd處理菠菜葉片中ProtoⅨ、Mg－protoⅨ和Pchl含量也始終低于對照，其在Spd處理第7天時均顯著高于鹽脅迫處理61.90%、60.00%和125.00%。

圖3 外源Spd對鹽脅迫下菠菜葉片中UroⅢ含量的影響Fig.3 Effects of exogenous Spd on UroⅢcontent of spinach leaves under NaCl stress

圖4 外源Spd對鹽脅迫下菠菜葉片中ProtoⅨ、Mg－protoⅨ和Pchl含量的影響Fig.4 Effects of exogenous Spd on ProtoⅨ，Mg－protoⅨand Pchl contents of spinach leaves under NaCl stress

2.3.4 Chl a及Chl b含量 由圖5可以看出，菠菜葉片中Chl a及Chl b含量在NaCl脅迫下均始終顯著低于對照水平，且隨鹽脅迫時間延長均呈降低趨勢，其在鹽脅迫處理第7天時較對照分別顯著降低了61.11%和63.16%；同時，鹽脅迫菠菜葉片Chl a及Chl b含量在噴施Spd后均有所提高，且處理時間越長增加幅度越大，但始終明顯低于同期對照，其在Spd處理第7天時分別較鹽脅迫處理顯著提高78.57%和71.43%。

圖5 外源Spd對鹽脅迫下菠菜葉片中Chl a及Chl b含量的影響Fig.5 Effects of exogenous Spd on Chl a and Chl b content of spinach leaves under NaCl stress

以上 結 果 說 明，NaCl脅 迫 下，Chl a、Chl b、Pchl、Mg－protoⅨ、Proto Ⅸ和Uro Ⅲ含量均明顯降低，而PBG和ALA含量升高，表明鹽脅迫下菠菜Chl含量降低是由于PBG 向Uro Ⅲ的轉化受阻所致；鹽脅迫下葉面噴施Spd后，菠菜Chl合成前體Chl a、Chl b、Pchl、Mg－protoⅨ、ProtoⅨ和UroⅢ含量均明顯升高，而PBG 和ALA 含量有所降低，表明外源Spd可使Chl合成的受阻作用得到有效緩解。

3 討 論

生物量變化是植物對鹽脅迫的綜合反應，是評估脅迫程度和植物抗鹽能力的可靠指標［23］。鹽脅迫下，植物根系最早感受逆境脅迫信號，并產生相應的生理反應，繼而影響地上部生長。本研究結果表明，在NaCl濃度為25mmol·L－1時菠菜植株的生長量較對照均有明顯提高，這與鹽脅迫下桉樹幼苗［24］和西瓜幼苗［25］的研究結果一致。低濃度的NaCl處理促進植物生長，可能是由于低濃度NaCl脅迫促進了植物細胞伸展和水分平衡［26］，激發了植株根系對K＋的攝取［27］，改善了光合細胞的水分狀況進而促進光合作用［28］。隨著NaCl濃度的繼續升高，菠菜植株生長量逐漸降低，在鹽濃度為250 mmol·L－1時各生長指標均顯著低于對照，表明高濃度的鹽脅迫顯著抑制菠菜植株生長，菠菜植株受到了嚴重的鹽脅迫傷害。

PAs廣泛存在于植物細胞中，參與多種生理過程，如葉片衰老、花器官的形成與發育、果實發育與成熟以及植物對逆境的響應等［29－30］。眾多研究表明，逆境脅迫下，適宜濃度的PAs處理能夠緩解植物所受到的傷害，促進植物生長［31－32］。然而，PAs作為一種新型的植物激素，與其他大多數植物激素一樣，在逆境下的作用具有濃度效應。例如，1.0 mmol·L－1外源Spm 可顯著提高NO3－脅迫下黃瓜幼苗的凈光合速率，增加干物質積累，促進黃瓜生長，但Spm 濃度高達1.5～2.0mmol·L－1時，黃瓜幼苗生長受到抑制［33］；低濃度（0.1～15.0mmol·L－1）Put可緩解NaCl脅迫對黃瓜幼苗生長的抑制，株高、生物積累量均顯著升高，而高濃度（20.0～30.0mmol·L－1）Put處理則加劇了NaCl對黃瓜幼苗的生長脅迫［34］；低濃度（150～200 mg·L－1）Spd可顯著提高鹽脅迫下黃瓜幼苗生長量，而濃度為250mg·L－1時較低濃度處理的植株生長量明顯降低［35］；低濃度（100～150mg·L－1）Spd誘導能顯著提高鹽脅迫下小白菜的株高、單株干重、單株鮮重等生長量，濃度為200mg·L－1時較低濃度處理的植株生長量明顯降低［36］。本研究結果表明，1.0 mmol·L－1外源Spd顯著提高了鹽脅迫下菠菜的生長量，而濃度為1.5mmol·L－1時的菠菜生長量則比1.0mmol·L－1處理顯著降低，說明外源Spd緩解鹽脅迫對菠菜生長抑制的作用也存在濃度效應。

葉綠素（Chl）含量是反映植物光合能力的一個重要指標，環境因子的改變會引起Chl含量變化，進而引起光合性能的改變［37］。鹽脅迫下，植物Chl含量會顯著降低［38－39］。本研究結果表明，250mmol·L－1鹽脅迫下菠菜葉片Chl含量顯著降低，這可能是鹽脅迫下菠菜生長顯著受到抑制的重要原因之一。一般認為，造成植物Chl含量降低的原因主要是鹽脅迫下類囊體膜的完整性受損［40］、Chl合成途徑中關鍵酶活性的降低［41］和降解途徑中Chl酶活性的升高［38］等。孫錦等［42］認為，海水脅迫下菠菜Chl含量降低主要是由于其合成途徑受阻所致。Chl的生物合成途徑（Glu→ALA→PBG→UroⅢ→ProtoⅨ→Mg－protoⅨ→Pchl→Chl a→Chl b）中任何一步驟出現障礙，都會影響Chl的合成，從而引起Chl含量降低［43］。本研究結果表明，NaCl脅迫下，Chl a、Chl b、Pchl、Mg－protoⅨ、ProtoⅨ和UroⅢ含量均明顯降低，而PBG 和ALA 含量升高，表明鹽脅迫下菠菜Chl含量降低是由于PBG 向Uro Ⅲ的轉化受阻，這與陳新斌等［41］的研究結果一致。鹽脅迫下葉面噴施Spd后，菠菜Chl合成前體Chl a、Chl b、Pchl、Mg－protoⅨ、ProtoⅨ和UroⅢ的含量均明顯升高，而PBG 和ALA 含量有所降低，表明外源Spd可使Chl合成的受阻作用得到有效緩解。可見，鹽脅迫下外源Spd通過緩解菠菜Chl合成途徑的受阻程度來提高了Chl含量，對維持光合作用的正常進行具有重要作用。

Chl合成過程中PBG 向Uro Ⅲ轉化是在膽色素脫氨酶（PBGD）的催化下，4分子PBG 脫氨聚合成線性的1－羥甲基膽色素烷（HMB），HMB 在尿卟啉原Ⅲ合成酶的催化下環合形成所有天然四吡咯化合物的共同前體——尿卟啉原Ⅲ［44］。因此，作為一種具有重要功能的酶，PBGD 廣泛存在于生物體內，其活性與葉綠素合成息息相關。目前，已經從豌豆［45］等作物中分離、克隆到PBGD基因。植物在水分脅迫［44］、高低溫脅迫［46－48］下PBGD基因表達受抑制，PBGD 活性下降，從而抑制Chl合成，導致Chl含量降低。因此，推測Spd可能通過增強鹽脅迫下菠菜葉片中PBGD基因表達水平，使PBGD 活性升高，緩解Chl合成的受阻程度，從而促進Chl合成代謝的順利進行。然而，Spd對PBGD基因表達的調控作用是否如此，以及具體通過什么途徑和方式調節PBGD 基因表達，需要進一步的深入研究。

綜上所述，高鹽脅迫條件下，菠菜植株的生長受到顯著抑制，葉片葉綠素含量降低可能是其中重要原因之一；菠菜葉片含量降低源于其合成受阻，受阻位點在PBG 向Uro Ⅲ的轉化路徑之間；外源Spd能夠緩解鹽脅迫下菠菜葉片葉綠素合成路徑的受阻程度，促進葉綠素合成，從而提高葉綠素含量，有效緩解鹽脅迫對菠菜生長造成的傷害。

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