橄欖果實發(fā)育成熟過程中糖積累與相關(guān)酶活性的關(guān)系

李澤坤，陳清西

（福建農(nóng)林大學(xué) 園藝學(xué)院，福州350002）

糖含量是評價果實品質(zhì)的主要因子之一，而蔗糖代謝是糖積累過程的關(guān)鍵環(huán)節(jié)［1－2］。橄欖果實糖積累主要以蔗糖為主，還有葡萄糖、果糖以及少量的棉籽糖［3］。因此蔗糖代謝是影響橄欖品質(zhì)形成的主要因素。研究發(fā)現(xiàn)蔗糖代謝過程以蔗糖轉(zhuǎn)化酶（Ivr）、蔗糖合成酶（SuSy）、蔗糖磷酸合成酶（SPS）為主［4］。其中蔗糖轉(zhuǎn)化酶可分為酸性轉(zhuǎn)化酶（AI）、中性轉(zhuǎn)化酶（NI），催化蔗糖分解為葡萄糖、果糖；蔗糖合成酶催化可逆反應(yīng)，在一定條件下促進(jìn)蔗糖的分解或合成。目前蔗糖代謝的相關(guān)研究主要集中在蘋 果［5－6］、枇 杷［7］、柑 橘［8－9］、荔 枝［10］、玉 米［11］、甘蔗［12］等作物中，橄欖果實發(fā)育中蔗糖代謝變化的研究甚少。橄欖原產(chǎn)于福建、廣東，具有生津治咽、開胃止瀉等多種藥用功效［13－14］，但因其入口苦澀而后甘甜的口感造成消費群體小，市場潛力挖掘受到限制。本試驗選用不同含糖量的‘馬坑22’、‘檀頭23’橄欖品種為試驗材料（前者含糖量高，后者含糖量低［15］），研究橄欖果實蔗糖代謝變化過程，旨在探討不同含糖量品種橄欖果實糖積累差異的生理基礎(chǔ)，為進(jìn)一步在代謝與分子水平探討橄欖果實糖積累機制提供試驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

2個供試材料采自福建閩侯縣白沙鎮(zhèn)上岐橄欖園，樹齡7年，均為丘陵山地露天栽培，盛花期為5月中旬，成熟期為11月中上旬。盛花期后60d開始采果，每隔14d采集1次。選擇樹體東西南北四個方位各3～5個大小相近、無病蟲害的橄欖果實為試材。采樣后洗果、去核、凍干、粉碎，過40目篩，置－40 ℃冰箱中作為可溶性糖含量測定材料。另取一部分果實去核，液氮速凍后置于－40 ℃冰箱中用于蔗糖代謝相關(guān)酶活性測定。

1.2 測定指標(biāo)及方法

1.2.1 可溶性總糖含量 可溶性總糖含量的提取、測定參照王學(xué)奎［16］蒽酮法進(jìn)行測定。

1.2.2 糖組分含量 （1）樣品制備 取0.20g橄欖干樣置于離心管中，加入10mL純水，100 ℃水浴1 h，冷卻后10 000×g離心10min。取上清液加熱濃縮后用1mL純水溶解，過0.45μm 水系膜后待測。（2）標(biāo)準(zhǔn)溶液制備 取葡萄糖、果糖、蔗糖標(biāo)準(zhǔn)品配置成質(zhì)量濃度為2、6、10、14、18mg／mL的糖混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，過0.45μm 水系膜待測。（3）高效液相色譜（HPLC）條件 色譜柱選用NH2柱及保護柱，柱溫38 ℃，流動相為乙腈∶水＝80∶20，流速1 mL·min－1。檢測器為示差檢測器，檢測池溫度為38℃，進(jìn)樣量10μL。

1.2.3 蔗糖代謝相關(guān)酶活性 酶的提取過程均在0～4 ℃中完成。稱取橄欖樣品，液氮中研磨5～10 min，加 入200 mmol·L－1磷酸鉀緩沖液（含有0.1%β－巰基乙醇，5 mmol·L－1MgCl2，0.05%BSA，0.05% Triton X－100，2% PVPP，pH 7.5）研磨至勻漿，20 000×g離心30 min。取上清液逐漸加 入（NH4）2SO4至80%飽和度，4 ℃冰箱中靜置30min，20 000×g離心20min，去除上清液，加入脫鹽緩沖液（20mmol·L－1K3PO4緩沖液，0.01%β－巰基乙醇，0.25 mmol·L－1MgCl2，0.05% BSA，pH 7.5）重新溶解沉淀，裝入透析袋，脫鹽緩沖液中透析16h，即得酸性轉(zhuǎn)化酶（AI）、中性轉(zhuǎn)化酶（NI）。

SPS、SuSy的提取步驟與AI、NI相似，其中提取緩沖液為200 mmol·L－1Hepes－NaOH（含有0.1%β－巰基乙醇，5 mmol·L－1MgCl2，0.05%BSA，0.05% Triton X－100，2% PVPP，1 mmol·L－1EDTA，1mmol·L－1EGTA，10mmol·L－1抗壞血酸鈉，10mmol·L－1半胱氨酸－鹽酸，2%甘油，pH 7.5），脫鹽緩沖液為20 mmol·L－1Hepes－NaOH（0.25 mmol·L－1MgCl2，0.01%β－巰基乙醇，0.05% BSA，1 mmol·L－1EDTA，1 mmol·L－1EGTA，2%甘油，pH 7.5）。

酶的活性測定參照趙智中［17］方法略做改動，其中AI、NI活性測定反應(yīng)體系由490μL 改為700 μL。AI、NI、SuSy（分解方向）活性測定采用3，5－二硝基水楊酸法測定還原糖生成量來表示酶活性大小，SPS、SuSy（合成方向）活性測定采用蒽酮法測定蔗糖生成量來表示酶活性大小。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗每組重復(fù)3 次，試驗結(jié)果通過SPSS19.0和Excel 2003進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計，采用LSD 法進(jìn)行顯著性差異分析，Spearman法進(jìn)行相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 橄欖果實發(fā)育成熟過程中可溶性糖含量變化

如圖1所示，‘馬坑22’橄欖果實內(nèi)蔗糖含量在花后60～102d變化不大，果糖與葡萄糖含量在花后102d出現(xiàn)最低值，這可能與果核硬化過程有關(guān)；在花后102d直至成熟期間，果實內(nèi)蔗糖含量快速積累，可溶性總糖含量也迅速提高，其己糖與蔗糖含量比在果實成熟時為0.668。‘檀頭23’果實內(nèi)蔗糖含量在花后60～130d變化不大，果糖、葡萄糖含量的最低值同樣出現(xiàn)在花后102d；但‘檀頭23’果實內(nèi)蔗糖快速積累期出現(xiàn)在花后130～186d，較‘馬坑22’遲14d且增長幅度較小；成熟時‘檀頭23’果實內(nèi)葡萄糖、果糖含量與‘馬坑22’相近，蔗糖含量低于‘馬坑22’，己糖與蔗糖含量比為0.904。因此，不難發(fā)現(xiàn)蔗糖積累是橄欖果實內(nèi)可溶性糖含量提高的重要原因。

2.2 橄欖果實發(fā)育成熟過程中轉(zhuǎn)化酶活性的變化

圖2顯示，橄欖品種‘馬坑22’果實內(nèi)AI活性隨果實發(fā)育成熟總體呈現(xiàn)波動下降的變化趨勢，從花后144d開始隨著果實成熟逐漸降低，并在成熟時達(dá)到最低值（1.424 mg·g－1·h－1）。橄欖品種‘檀頭23’果實內(nèi)AI活性總體變化趨勢與‘馬坑22’相同，但在成熟時AI活性高于‘馬坑22’，且最低值出現(xiàn)在花后102d。在橄欖果實發(fā)育成熟過程前后，其AI活性在‘檀頭23’中有所增強，而在‘馬坑22’AI內(nèi)有所減弱。另外，在橄欖果實發(fā)育成熟過程中，2個品種果實內(nèi)NI活性變化趨勢也大致相同，但‘馬坑22’中的NI活性始終高于‘檀頭23’，尤其是在花后172和186d2個品種的差值更大，‘馬坑22’的NI活性分別比‘檀頭23’提高125.24%和112.69%。可見‘馬坑22’與‘檀頭23’AI活性主要差異表現(xiàn)在果實發(fā)育成熟的后階段，‘馬坑22’果實內(nèi)較低的AI活性有利于減緩蔗糖分解。而由于NI主要位于細(xì)胞質(zhì)中，因此‘馬坑22’較高的NI活性有利于提高果實庫強間接促進(jìn)蔗糖的進(jìn)入。

2.3 橄欖果實發(fā)育成熟中蔗糖磷酸合成酶活性的動態(tài)變化

如圖3所示，橄欖品種‘馬坑22’果實中SPS活性隨生育期呈現(xiàn)先升后降再升的變化趨勢，在花后130d達(dá)到最低值（0.408μg·g－1·h－1），并分別在花后102d和172d分別達(dá)到峰值。品種‘檀頭23’果實中SPS活性隨生育期變化趨勢與‘馬坑22’相同，但其在花后88d即達(dá)到第一峰值，且峰值明顯低于‘馬坑22’；同時‘檀頭23’SPS活性在果實成熟期（花后172～186d）顯著低于‘馬坑22’（P＜0.05）。可見，‘馬坑22’與‘檀頭23’在果實發(fā)育成熟過程中SPS 活性變化差異不大且2 個品種的SPS活性均明顯低于其他蔗糖代謝相關(guān)酶。

圖1 橄欖果實發(fā)育成熟過程中可溶性糖含量變化Fig.1 Soluble sugar content changes during the development and ripening of Chinese olive fruit

圖2 橄欖果實發(fā)育成熟過程AI和NI活性變化Fig.2 Changes of AI and NI activities during the development and ripening of Chinese olive fruit

圖3 橄欖果實發(fā)育成熟中SPS活性變化Fig.3 Changes of SPS activity during the development and ripening of Chinese olive fruit

2.4 橄欖果實發(fā)育成熟中蔗糖合成酶活性的變化

橄欖品種‘馬坑22’果實內(nèi)SuSy（合成方向）活性在花后60～144d 與‘檀頭23’變化趨勢大致相同，但其在花后144～186d快速提高，增長幅度為140.70%，而同期‘檀頭23’SuSy（合成方向）活性增長幅度明顯小于‘馬坑22’（圖4，A）。同時，在橄欖果實發(fā)育成熟過程中，品種‘馬坑22’和‘檀頭23’果實中SuSy（分解方向）活性變化趨勢大致相同，分別在7.344～14.533 mg·g－1·h－1和8.565～16.622mg·g－1·h－1范圍內(nèi)波動變化，但‘檀頭23’SuSy（分解方向）活性在大部分時期上高于‘馬坑22’（圖4，B）。以上結(jié)果說明在橄欖果實發(fā)育成熟過程中SuSy活性以分解方向為主且2個品種間的分解方向活性變化差異不大。但在合成方向上，‘馬坑22’與‘檀頭23’SuSy活性在花后144～186d表現(xiàn)明顯差異，‘馬坑22’SuSy（合成方向）活性的顯著提高促進(jìn)了果實內(nèi)蔗糖的快速積累。

圖4 橄欖果實發(fā)育成熟中SuSy活性在合成方向（A）和分解方向（B）的變化Fig.4 Changes of SuSy activity at synthetic direction（A）and cleavagedirection（B）during the development and ripening of Chinese olive fruit

表1 橄欖果實可溶性糖含量及其代謝相關(guān)酶活性的相關(guān)性分析Table1 Correlation analysis among souble sugar contents and the activities of sucrose－metabolizing enzymes in the Chinese olive fruits

2.5 橄欖果實可溶性糖含量及其代謝相關(guān)酶活性的關(guān)系

如表1所示，在橄欖果實發(fā)育成熟過程中，‘馬坑22’橄欖果實中可溶性總糖與蔗糖含量極顯著正相關(guān)（r＝0.855），其蔗糖含量與AI活性顯著負(fù)相關(guān)（r＝－0.661），與SPS、SuSy（合成方向）活性顯著正相關(guān)（r＝0.624）。而‘檀頭23’橄欖果實中可溶性總糖含量與果糖、葡萄糖含量極顯著正相關(guān)（r分別為0.867和0.770），其蔗糖含量與SuSy（合成方向）活性顯著負(fù)相關(guān)（r＝－0.673），與SuSy（分解方向）活性顯著正相關(guān)（r＝0.636）。以上結(jié)果說明，‘檀頭23’果實內(nèi)較低的蔗糖含量促使果糖和葡萄糖成為影響該品種橄欖果實可溶性總糖含量的主要影響因子；SuSy（合成方向）在2個品種果實的糖積累過程中發(fā)揮著截然不同的作用。

3 討 論

本研究結(jié)果表明蔗糖含量是橄欖果實可溶性糖含量提高的重要原因。在橄欖果實糖積累過程中，無論是‘馬坑22’還是‘檀頭23’均存在蔗糖快速積累期，且直接影響到果實成熟時可溶性糖含量的高低。在蔗糖積累型的網(wǎng)紋甜瓜糖代謝研究中也同樣發(fā)現(xiàn)在果實成熟前期出現(xiàn)蔗糖快速積累過程［18］。前人研究認(rèn)為果實內(nèi)蔗糖的積累通常經(jīng)韌皮部運輸直接進(jìn)入或者轉(zhuǎn)化為六碳糖進(jìn)入果實，其進(jìn)入速率主要依賴于源與庫間的濃度梯度［17，19－20］。蔗糖的水解通常被認(rèn)為是蔗糖進(jìn)入果實的限速步驟［21］。在甜菜［22］、柑橘［23］等研究上表明果實成熟過程中AI活性降低是蔗糖積累的前提。本研究中，在果實蔗糖快速積累期內(nèi)‘馬坑22’AI活性低于‘檀頭23’，從而為‘馬坑22’果實內(nèi)蔗糖的快速積累創(chuàng)造了前提條件，而其位于細(xì)胞質(zhì)中的NI活性高于‘檀頭23’又有利于增強果實庫強。在蔗糖合成方面，兩個品種的SPS活性變化大致相似，‘馬坑22’僅在成熟期時（花后172～186d）略高于‘檀頭23’，且SPS在橄欖果實中的活性較低，因此SPS不是兩個品種蔗糖積累差異的關(guān)鍵。在蔗糖快速積累期內(nèi)，兩個品種在SuSy（合成方向）活性變化上差異顯著，‘馬坑22’SuSy（合成方向）活性在花后144～186d增速高于‘檀頭23’。在 桃［24－25］、日本梨［26－27］、甜橙［28］等研究中均認(rèn)為SuSy是蔗糖積累的關(guān)鍵酶。此外，王惠聰研究認(rèn)為SPS、SuSy（合成方向）參與了庫組織的糖組分調(diào)節(jié)，較高的活性有利于荔枝假種皮的蔗糖積累，在本研究中也有相似的發(fā)現(xiàn)［29］。

在本研究中由于蔗糖凈合成速率（蔗糖凈合成速率＝SPS＋SuSy 合成方向－AI－NI－SuSy 分解方向）始終為負(fù)值，因此蔗糖直接進(jìn)入橄欖果實是蔗糖積累的另一重要途徑。有研究認(rèn)為SuSy是調(diào)節(jié)蔗糖直接進(jìn)入柑橘果實速度的關(guān)鍵酶，其機理主要是由于汁胞外SuSy催化蔗糖分解為UDPG 和果糖，經(jīng)三羧酸循環(huán)生成ATP，間接促使H＋外運，同時胞外蔗糖被運入胞內(nèi)［30］。在本試驗的‘檀頭23’橄欖果實中也有同樣的發(fā)現(xiàn)，相關(guān)性分析顯示SuSy（分解方向）活性的提高促進(jìn)了果實內(nèi)蔗糖的積累，表明SuSy（分解方向）間接地促進(jìn)了蔗糖直接進(jìn)入果實的速率加快。以上的這種變化關(guān)系在‘馬坑22’上并不明顯，但本研究中‘馬坑22’SuSy（分解方向）活性在大部分時期低于‘檀頭23’且2個品種的變化趨勢相似。研究表明在大多數(shù)植物中存在至少2種以上的SuSy同工酶［31］。因此可以推斷Su－Sy（分解方向）活性雖然在2個橄欖品種上變化趨勢相同，但在SuSy（分解方向）的功能結(jié)構(gòu)上可能存在差異。

［1］ LIANG J（梁 俊），GUAN Y（郭 燕），LIU Y L（劉玉蓮），etal.Analysis of contents and constituents of sugar and organic acid in different apple cultivars［J］.JournalofNorthwestA＆FUniversity（Nat.Sci.Ed.）（西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報·自然科學(xué)版），2011，39（10）：163－170（in Chinese）.

［2］ WANG D F（王德孚），YANG ZH J（楊志軍），SUN J M（孫江妹），etal.Difference in soluble sugar accumulation and related enzyme activity of fruits among different pear cultivars［J］.JournalofFruitScience（果樹學(xué)報），2014，31（1）：30－38（in Chinese）.

［3］ HE ZH Y（何志勇）.Analysis of nutrient content in the fruit flesh ofCanariumalbum［J］.ScienceandTechnologyofFoodIndustry（食品工業(yè)科技），2009，（12）：224－226（in Chinese）.

［4］ CHEN J W（陳俊偉），ZHANG SH L（張上隆），ZHANG L CH（張良誠）.Fruit sugar transport，metabolism and accumulation and its regulation［J］.JournalofPlantPhysiologyandMolecularBiology（植物生理與分子生物學(xué)學(xué)報），2004，30（1）：1－10（in Chinese）.

［5］ LI M，F(xiàn)ENG F，CHENG L.Expression patterns of genes involved in sugar metabolism and accumulation during apple fruit development［J］.PLoSOne，2012，7（3）：e33055.

［6］ ZHU Z，LIU R，LI B，etal.Characterisation of genes encoding key enzymes involved in sugar metabolism of apple fruit in controlled atmosphere storage［J］.FoodChemistry，2013，141（4）：3 323－3 328.

［7］ CAO S，YANG Z，ZHENG Y.Sugar metabolism in relation to chilling tolerance of loquat fruit［J］.FoodChemistry，2013，136（1）：139－143.

［8］ CHEN M，JIANG Q，YIN X－R，etal.Effect of hot air treatment on organic acid－and sugar－metabolism in Ponkan（Citrusreticulata）fruit［J］.ScientiaHorticulturae，2012，147：118－125.

［9］ JIANG N，JIN L－F，DA SILVA J A T，etal.Activities of enzymes directly related with sucrose and citric acid metabolism in citrus fruit in response to soil plastic film mulch［J］.ScientiaHorticulturae，2014，168：73－80.

［10］ YANG Z，WANG T，WANG H，etal.Patterns of enzyme activities and gene expressions in sucrose metabolism in relation to sugar accumulation and composition in the aril ofLitchichinensisSonn［J］.JournalofPlantPhysiology，2013，170（8）：731－740.

［11］ REN X，ZHANG J.Research progresses on the key enzymes involved in sucrose metabolism in maize［J］.CarbohydrateResearch，2013，368：29－34.

［12］ LOBO A K M，DE OLIVEIRA MARTINS M，NETO M C L，etal.Exogenous sucrose supply changes sugar metabolism and reduces photosynthesis of sugarcane through the down－regulation of Rubisco abundance and activity［J］.JournalofPlantPhysiology，2015，179：113－121.

［13］ WANG Y P（王燕平），CHEN Q（陳 勤），ZHOU ZH Q（周志欽），etal.Optimization of AFLP reaction system inCanariumalbum［J］.JournalofFruitScience（果樹學(xué)報），2012，3：39（in Chinese）.

［14］ ZHOU J，ZHONG G，LIN Z，etal.The effects of bagging on fresh fruit quality ofCanariumalbum［J］.JournalofFood，Agriculture＆Environment，2012，10（1）：505－508.

［15］ 林玉芳.福建橄欖［Canariumalbum（Lour）Raeusch］若干功能成分和品質(zhì)相關(guān)指標(biāo)的研究［D］.福州：福建農(nóng)林大學(xué)，2012.

［16］ 王學(xué)奎.植物生理生化實驗原理和技術(shù)［M］.北京：高等教育出版社，2006：202－204.

［17］ ZHAO ZH ZH（趙智中），ZHANG SH L（張上隆），XU CH J（徐昌杰），etal.Roles of sucrose－metabolizing enzymes in accumulation of sugars in satsuma mandarin fruit［J］.ActaHorticulturaeSinica（園藝學(xué)報），2001，28（2）：112－118（in Chinese）.

［18］ QIAO Y X（喬永旭），LIU Q T（劉栓桃），ZHAO ZH ZH（趙智中），etal.Study on the correlation of sugar accumulation and sucrose－metabolizing enzymes during the developing period of muskmelon（Cucumismelon）［J］.JournalofFruitScience（果樹學(xué)報），2004，21（5）：447－450（in Chinese）.

［19］ SUO B H（索濱華），CHEN G（陳 光），WANG D H（王德輝），etal.Sugar accumulation in Net－Melon［J］.ActaAgricultuaeNucleatae Sinica（核農(nóng)學(xué)報），1997，11（3）：190－192（in Chinese）.

［20］ VIZZOTTO G，PINTON R，VARANINI Z，etal.Sucrose accumulation in developing peach fruit［J］.PhysiologiaPlantarum，1996，96（2）：225－230.

［21］ WALKER A，HO L，BAKER D.Carbon translocation in the tomato：pathways of carbon metabolism in the fruit［J］.AnnalsofBotany，1978，42（4）：901－909.

［22］ GIAQUINTA R T.Sucrose translocation and storage in the sugar beet［J］.PlantPhysiology，1979，63（5）：828－832.

［23］ KATO T，KUBOTA S.Properties of invertases in sugar storage tissues of citrus fruit and changes in their activities during maturation［J］.PhysiologiaPlantarum，1978，42（1）：67－72.

［24］ MORIGUCHI T，YAMAKI S.Purification and characterization of sucrose synthase from peach（Prunuspersica）fruit［J］.Plantandcell physiology，1988，29（8）：1 361－1 366.

［25］ MORIGUCHI T，SANADA T，YAMAKI S.Seasonal fluctuations of some enzymes relating to sucrose and sorbitol metabolism in peach fruit［J］.JournaloftheAmericanSocietyforHorticulturalScience，1990，115（2）：278－281.

［26］ WANG D F（王德孚），YANG ZH J（楊志軍），SUN J M（孫江妹），etal.Difference in soluble sugar accumulation and related enzyme activity of fruits among different pear cultivars［J］.JournalofFruitScience（果樹學(xué)報），2014，31（1）：30－38（in Chinese）.

［27］ MORIGUCHI T，ABE K，SANADA T，etal.Levels and role of sucrose synthase，sucrose－phosphate synthase，and acid invertase in sucrose accumulation in fruit of Asian pear［J］.JournaloftheAmericanSocietyforHorticulturalScience，1992，117（2）：274－278.

［28］ ECHEVERRIA E.Developmental transition from enzymatic to acid hydrolysis of sucrose in acid limes（Citrusaurantifolia）［J］.Plant Physiology，1990，92（1）：168－171.

［29］ WANG H C（王惠聰），HUANG H B（黃輝白），HUANG X M（黃旭明）.Sugar accumulation and related enzyme activities in the litchi fruit of‘Nuomici’and‘Feizixiao’［J］.ActaHorticulturaeSinica（園藝學(xué)報），2003，30（1）：1－5（in Chinese）.

［30］ GONG R G（龔榮高），ZHANG G L（張光倫）.Advances in research on sugar metabolism inCitrusfruit［J］.JournalofSichuanAgricultralUniversity（四川農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報），2004，21（4）：343－346（in Chinese）.

［31］ LU H Q（盧合全），SHEN F F（沈法富），LIU L X（劉凌霄），etal.Recent advances in study on plant sucrose synthase［J］.ChieseAgriculturalScienceBulletin（中國農(nóng)學(xué)通報），2005，21（7）：34－37（in Chinese）.