垂序商陸繁殖期各器官錳富集規律及其對種子萌發的影響

廖 陽，閆榮玲，何永峰，龔令軍，殷小林

（湖南科技學院 化學與生物工程學院，湖南永州425199）

錳是植物所需微量元素的重要一員，它對細胞器正常結構的維持，光合作用的氧化還原反應以及體內酶的激活等均具有重要意義［1］。但過量錳則形成一種不利于植物生長的脅迫逆境［2－6］。在一定脅迫程度和持續時間內，植物可以通過多種機制抵御錳富集帶來的不利影響，并盡可能完成自身生命周期，但當脅迫超過植物應對能力后，則會在分子、細胞、器官、植株等多個水平表現出嚴重異常甚至死亡［7－9］。根系吸收的錳離子會向上運輸至莖、葉等器官，進入繁殖期后則繼續向生殖器官轉移、分配，進而可能影響植株的繁殖能力。

垂序商陸（Phytolaccaamericana）是具錳超富集能力的多年生草本植物，其葉片中錳含量可超過25g·kg－1，遠高于其他植物［10－11］。另外，垂序商陸還具有適應性好、繁殖力強、生長速度快、地理分布廣、生物量大等眾多優點，因此是開展錳污染土壤生物修復治理的理想植物種類［12］。迄今，已經對高錳脅迫下垂序商陸體內錳離子的富集規律，以及錳富集對植株組織結構、生理特征的影響等方面作了初步 研究［9，11，13］。但這些研究所進行的錳脅迫處理時間較短，且均在垂序商陸的非繁殖期進行，目前還未見有關錳脅迫下垂序商陸生殖器官錳富集規律的報道，且錳在生殖器官內的富集對植株的繁殖能力會產生怎樣的影響也還不明了。本研究試圖對上述問題進行初步探討。

1 材料與方法

1.1 植株培養與處理

2013年5月，將采自湖南科技學院校園附近空地的72株長勢一致的野生垂序商陸幼苗栽于裝有河沙的塑料桶內，所取河沙預先進行了清洗和過篩。各組幼苗置于可避雨的臨時棚內生長，棚四周與外界相通。幼苗分成3組，每組24株，每組設3次重復。其中一組為對照組，所澆霍蘭氏培養液不再額外添加錳離子（濃度為0.005 mmol／L），另兩組為處理組，依據有關文獻［9，11］培養液中錳離子的濃度分別設置為0.1和1.0mmol／L（屬于輕度至中度脅迫水平），額外錳離子添加試劑為MnCl2·4H2O。營養液每5d澆灑1次，每桶均為0.5L，中間根據實際情況適當補水。植株培養至2013年9月上旬實驗結束，此時收獲各組植株所結種子。

1.2 測定指標及方法

1.2.1 器官錳含量 2013年6月至8月標記一批同步開花的花朵，跟蹤觀察其從閉合花蕾到結果以及果實（種子）整個成熟過程，并根據果實的表觀性狀（大小、顏色、果漿量等）在不同階段（6月25日、7月15日、7月28日、8月8日、8月18日、8月30日）進行6次植株不同器官錳含量的測定。測定時，先用自來水沖洗干凈拔出的植株，再用去離子水洗2次，之后分離根、莖、葉、果實置于經硝酸浸泡處理過的干凈研缽內，于70℃烘箱內烘干至恒重后研磨至粉末狀，其中果實在研磨前分出一部分，分離出種子并在顯微鏡下確定種子表面無其他附著物，再次清洗并烘干后置于另一研缽內研磨。研磨得到的植株不同部位粉末稱取0.1～0.2g經硝酸與高氯酸4：1混合液充分消化后，用原子吸收分光光度法（WFX－1E2型原子吸收儀，北京）測定各器官錳含量。測定時儀器參數：波長279.5nm；燈電流3.0 mA；狹縫0.2nm；空氣流量6.5L／min；乙炔流量1.7L／min。

同時，在測定種子中錳含量基礎上，計算各次取樣種子中錳含量較前一次的變化率，計算公式為：變化率（%）＝（第N 次錳含量測量值－第N－1次測量值）×100／第N－1次測量值。

1.2.2 果汁中有機酸成分及含量 在最后一次采樣時，各處理組均選取顆粒飽滿的部分果實，撕開果皮后，輕輕擠壓收集果汁后離心（2 000r／min）取上清液。準確吸取樣品120mL，濃縮至30mL 左右后，置于150mL 碘量瓶中，加入60mL 12.5%硫酸甲醇溶液（冷水浴冷卻和攪拌條件下，將20 mL 濃H2SO4緩慢加入160 mL 無水甲醇中搖勻制得）。混勻后30 ℃（轉速150r／min）恒溫振蕩酯化24h。將甲酯化后的樣液置于150 mL 的分液漏斗中，用二氯甲烷萃取3 次（20mL×3），合并萃取液。用飽和氯化鈉溶液洗滌2 次（20mL×2），再用無水硫酸鈉（10g）脫水，靜置過夜后濾出硫酸鈉，濾液濃縮至30 mL，參照已有文獻使用氣質聯用儀（島津QP2010S）進行GC－MS分析［14］。

1.2.3 種子萌發率 收集不同錳離子濃度下各組植株顆粒飽滿的種子，于2014年4月進行種子萌發實驗。在硬質玻璃培養皿中疊放兩張圓形濾紙，用去離子水充分潤濕濾紙。種子經2.5%次氯酸鈉溶液浸種20min后用去離子水沖洗3次再置于濾紙上，每皿30 粒，每組設置3 次重復，蓋好皿蓋置于25 ℃恒溫培養箱中等待萌發，跟蹤觀察并注意補水保持濾紙濕潤，于第10天統計種子的萌發率。萌發率的計算公式為：

萌發率＝（發芽種子總數／供試種子總數）×100%。

1.3 數據分析

用Excel 2003、SPSS19.0 以 及Sigmaplot10.0等軟件對數據進行整理、分析與作圖。

2 結果與分析

2.1 種子成熟過程中果實與種子的表觀變化特征

各組垂序商陸植株5月中旬后不斷掛果，果內所含種子（近似腎形）隨時間推移不斷成熟。在此過程中，果實的大小、重量、果汁量、顏色以及種子的大小顏色、硬度等性狀均不斷變化。其中，花（果）枝遠端的果實生長速度較近端果實慢，果實顏色由最初的綠色逐漸變為棕色再變成最終的黑色。果枝與果柄的顏色也逐漸由綠色變為淺紅直至最終深紫色。果實中的果漿含量隨果實表觀變化表現為先增加后減少最后完全消失，僅剩透明薄皮包裹種子（果漿減少過程中，果皮形成越來越明顯的褶皺）。在此過程中，果實內的種子從乳白半透明逐漸變為黑色，體積逐漸增大至芝麻粒大小且硬度不斷增加。圖1示對照組種子成熟過程的不同時間節點果實與種子的表觀狀態，各圖分別對應實驗的第1次（階段）至第6次（階段）取材，各次對應的日期分別為6月25日、7月15日、7月28日、8月8日、8月18日和8月30日。跟蹤觀察過程中未發現錳處理組與對照組的果實和種子在表觀形態上表現出差異。

2.2 垂序商陸種子成熟過程中植株各器官錳含量動態變化

對種子成熟過程中垂序商陸不同器官錳含量進行分析發現，隨時間推移對照組和處理組植株的根、莖、葉、果實（含種子）的錳含量均呈持續增加趨勢。種子內錳含量的變化在對照與處理組之間存在差異：種子內錳含量在對照組（0.005mmol／L）中于初期先出現少許下降（4.0%），之后持續增加，且在最后階段微弱增加（1.2%；圖2，A）；而處理組（0.1 mmol／L與1.0mmol／L）則整體變化趨勢相似，均先持續增加，并于8月8日達到最大值，到種子成熟末期再有所減少，且1.0mmol／L 組的變化幅度在各階段均大于0.1mmol／L組（圖2，B、C）。

圖1 對照組種子成熟過程中垂序商陸果實與種子的表觀變化Fig.1 Apparent change of fruits and seeds during seed maturation process of Phytolacca americana of control group

同時，處理間相比較，各器官錳含量隨培養環境錳離子濃度的升高而大幅明顯增加，同一器官不同濃度下錳含量始終表現為1.0 mmol／L 組＞0.1 mmol／L組＞0.005mmol／L 組（圖2）。另外，器官間相比較而言，種子成熟后期，各組不同器官錳含量高低順序均為種子＜莖＜根＜果實＜葉，果實的錳含量遠高于種子中的錳含量（圖2），即果漿或果皮中分配和富集了大量的錳。

另外，GC－MS分析表明，果漿中的有機酸主要為草酸（占有機酸總量的95.5%）以及少量的2－羥基丙酸（占有機酸總量的4.5%；圖3、表1）；各處理組果汁有機酸成分相同，含量無明顯變化（P＞0.05，表1）。

圖2 不同錳濃度下垂序商陸各器官錳含量動態變化Fig.2 Dynamic changes of the manganese content in different organs of P.americana

圖3 垂序商陸果汁中2－羥基丙酸（A）和草酸（B）GC－MS分析質譜圖（1.0mmol／L組）Fig.3 Mass spectrometry of 2－hydroxy propionic acid（A）and oxalic acid（B）in P.americanajuice（1.0mmol／L group）

圖4 不同錳濃度下垂序商陸種子在成熟過程中錳含量變化規律及其萌發率Fig.4 Comparison of manganese content change in seeds during the maturation process and seed germination rate of P.americanaamong different manganese concentrations

表1 不同濃度組果汁有機酸含量比較Table1 Comparison of the content of organic acid in fruit juice among different group with different manganese concentrations

2.3 錳脅迫對垂序商陸種子錳含量和萌發率的影響

圖4顯示，垂序商陸種子內錳含量變化趨勢及變化程度在不同濃度間明顯不同。CK 組種子錳含量在初期出現少許下降（4.0%），且在最后階段微弱增加（1.2%）；2個不同濃度的錳脅迫處理組整體變化趨勢相似，且在后期均出現不同程度負增長；同時，所有各階段錳含量的變化率始終表現為1.0 mmol／L均大于0.1mmol／L。另外，0.005、0.1和1.0mmol／L 3個不同錳濃度下植株所結種子萌發率分別為97.8%、88.9%、78.8%，三者間差異極顯著（P＜0.01），即垂序商陸所處培養液錳濃度越高，種子萌發率則越低。

3 討 論

植物遭受錳脅迫后會發生積極靈敏的生理響應，并通過區域化隔離、根系有機酸螯合、限制吸收與外排、抗氧化系統增強、離子間交互等多種機制來抵御錳脅迫［1，15］。不同植物對錳的耐受能力差異明顯，木本植物中的馬尾松（Pinusmassoniana）與山茶科植物，以及生長在被錳礦尾渣污染的土壤中的早熟禾（Poaannua）、鼠麴草（Gnaphaliumaffine）等物種耐性較強［4，16－17］。盡管如此，這些植物對錳的耐受與富集能力相比垂序商陸還是低得多。研究表明，垂序商陸植株體內錳富集量遠超人們對錳超累積植物的界定標準（10 000 mg／kg）［11，17］。本研究中未發現錳脅迫處理組垂序商陸植株果實出現表觀異常，即所設錳處理濃度均在其耐受范圍內，這與已有報道相符［12－13］。同時，可能由于所設錳濃度較低，未形成導致出現嚴重生理機能障礙的嚴重脅迫，因此對照組與處理組植株的果汁中有機酸成分及含量沒有表現出顯著差異。

有研究表明，垂序商陸吸收的錳有87%～95%被轉移到地上部分［18］。當植株進入繁殖期形成花、果實、種子等生殖器官后，錳離子會繼續向這些新形成的器官轉運。本研究發現，垂序商陸生殖生長過程中各器官內錳含量隨錳離子處理濃度的升高而增加，錳脅迫處理組植株各器官錳含量遠高于對照組，且相同濃度下不同器官內錳含量表現為種子＜莖＜根＜果實＜葉。可見，不同錳離子濃度（低濃度，≤1 mmol／L）下，根、莖、葉3個營養器官在繁殖期對錳的累積規律及各器官錳含量高低關系與非繁殖期類似，且葉片是錳在垂序商陸體內累積的主要器官［12－13，19－20］。值得注意的是，果實錳含量遠高于其內部所包裹的種子的錳含量，推測垂序商陸的果汁內富集了較高水平的錳，這可能與果漿高水溶性環境密切相關。已有研究證實，垂序商陸葉細胞的液泡等高可溶性環境儲存了葉片中錳含量的絕大部分（74%～80%），從而緩解錳過量對葉細胞的傷害，也減輕了植株其他器官錳富集的壓力［21］。那么，其果汁的高水溶性環境是否也是一個重要的緩解錳脅迫的場所，其作用機制如何，這些還需要進一步的研究來證實。

GC－MS分析顯示，垂序商陸果汁中存在豐富的有機酸，主要成分為草酸以及少量的2－羥基丙酸。有研究證明有機酸在植物根、葉的解錳毒中發揮了重要作用，特別是草酸因其與金屬離子有很強的親和力，因此是植物體內與錳解毒機制密切相關的4種有機酸之一（另外3 種為檸檬酸、蘋果酸和琥珀酸）［22］。因此，推測有機酸是垂序商陸果漿中可富集高水平錳的重要原因。鑒于果汁幾乎不參與植株的重要生理活動，把大量錳轉移到果汁中對植株本身來說是有利的。另外，由于植株上成熟的果實最終會脫離母體，因此分批成熟的果實中，較早期成熟的果實在脫離母體的同時也帶走了其所含的錳，這與葉片會優先把錳累積在不太重要的表皮細胞，以及通過表皮毛把錳排出體外（外排效應）效果類似［23］。可見，垂序商陸在果汁中富集錳是一個十分巧妙的策略。結果同時提示，利用垂序商陸進行土壤修復時，應及時采摘已成熟果實，防止其掉落地面使錳回歸土壤。

植物遭受嚴重錳脅迫后，往往生物量減少、衰老提前、生理異常甚至死亡［24－25］。由于本實驗所設置的處理組錳離子濃度較低，在垂序商陸的耐受能力范圍內，因此各組植株均正常生長、開花、掛果、結籽從而完成當年的生長周期。本實驗結果顯示，垂序商陸種子的錳含量隨處理濃度的增加而升高，萌發率則隨之降低，提示垂序商陸種子內的錳富集會降低商陸的繁殖能力，且脅迫程度越高影響越顯著。體外重金屬浸種實驗也發現，當浸種液中錳離子濃度超過一定值后，種子萌發率急劇下降［26－27］。值得注意的是，處理組種子中錳含量在成熟后期不增反減，且錳濃度越高減少越明顯，這可能是垂序商陸的一種自我保護策略，即在成熟末期遷移出部分錳以降低種子中錳含量來提高種子萌發率，從而維持自身較高繁殖能力。

綜上所述，垂序商陸作為一種錳超富集植物，對環境中的錳離子濃度響應靈敏，且植株各器官內錳積累量與環境中錳濃度密切相關；處于繁殖期的垂序商陸在錳脅迫環境中會把累積到體內的過量錳盡可能合理地分配到不同器官中，以降低錳富集所帶來的毒害效應從而完成生命周期；在種子成熟末期，其還可能采取降低種子中錳分配量的策略來提高萌發率從而保證高繁殖能力，果漿的可溶性水環境及其所含的有機酸在繁殖期植株解錳毒中發揮了重要作用。該研究結果為了解高錳條件下繁殖期垂序商陸對錳離子的轉移與分配規律以及垂序商陸在生態修復中的實際應用提供些許參考。

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