大豆GmF6′H1基因的克隆及功能驗證

王 蕾，張 娟，魏麗娟，劉林德

（1 魯東大學 生命科學學院，山東煙臺264025；2 魯東大學 農學院，山東煙臺264025）

香豆素是一類廣泛存在于高等植物中的次生代謝產物，特別是在傘形科、蕓香科、豆科、菊科、瑞香科和木犀科中含量較高［1－2］。在化學結構上，香豆素類化合物是一種具有苯丙α－吡喃酮核的順式鄰羥基肉桂酸內酯。最近大量的科學研究顯示，香豆素及其衍生物在農業、工業、醫藥業發揮著重要作用［3－5］。在真菌或者微生物侵染的植物中香豆素會大量積累，這表明香豆素可能與植物抗逆的防御性反應存在著聯系［4］；許多傳統中草藥，如前胡、蛇床子、祖師麻、花椒、秦皮、枳實等，其活性成分就是香豆素及其衍生物［6－8］，它們在消炎、抗菌、抑制血栓形成、抗凝血劑、抗腫瘤、抑制中樞神經系統和降低血壓等方面臨床療效顯著［9－10］；在工業方面，香豆素因其特殊味道被用于制造香水、香皂和調味劑［11］。

香豆素在工業、農業和醫藥業的重要性使得越來越多的研究聚焦于香豆素的合成和提取，但由于工業合成的復雜性和高成本，香豆素在植物中的合成開始受到人們的關注。香豆素結構種類繁多，植物體內許多酶參與了其合成，其生物合成途徑是植物苯丙氨酸代謝途徑的一個分支，其中阿魏酰輔酶A 6′位的羥基化至關重要。最近的研究發現，一些細胞色素單加氧酶P450是呋喃香豆素生物合成的關鍵酶，其作用機理是催化傘形花內酯6位或者8位異戊烯化后的羥基化［12－14］。在擬南芥香豆素生物合成途徑中，對香豆酸－3′－羥化酶催化對－香豆酰－CoA 3′位羥基化，進而生成咖啡酰輔酶A；接著咖啡酰輔酶A 氧甲基轉移酶通過修飾3′位置上氧甲基化產生阿魏酰輔酶A，然后一個依賴于Fe（Ⅱ）和2－酮戊二酸的雙加氧酶催化阿魏酰輔酶A 6′位的羥基化，因此該酶被命名為F6′H；上述反應產物6－羥基阿魏酰輔酶A 最終通過順式／反式異構化和內酯化生成香豆素［15］。

本研究從大豆中克隆了1 個擬南芥AtF6′H1基因的同源基因，通過酶學特性分析其催化活性，并分析在擬南芥Atf6′h1突變體中過量表達對植株中香豆素的含量的影響。探討不同植物中F6′H同源基因可能存在的作用或調控機制。

1 材料和方法

1．1 植物材料和生長條件

大豆‘黑農35號’種子2012年5月初播種于盆中，置于光照培養箱（28±1）℃，16h光照（5：00～21：00），8h 暗培養，在結莢期分別取同一植株的根、莖、葉和莢果液氮速凍后存于－80℃待用。

擬南芥（Col 0、突變體和轉基因）種子常規表面消毒后播種于MS固體培養基上，4℃處理2～3d后置于光照培養箱培養［（21±1）℃，濕度為75%，光照時間同上所述］。幼苗約高為1～2cm 時，在無菌條件下分別移植于終濃度為100μmol／L 2，4－D、水楊酸和激動素的MS固體培養基中，然后依次在處理0h、12h、24h、48h時分別取地上部分和根部材料，液氮速凍。

1．2 方 法

1．2．1 大豆GmF6′H1基因克隆及其EST 序列分析 在大豆基因組數據庫（http：／／www．ncbi．nlm．nih．gov／）中找到一個擬南芥AtF6′H1（At3g13610）和AtF6′H2（At1g55290）［15］的同源序列，根據該序列信息，在開放閱讀框兩端分別設計GmF6′H1正向引物GmF6′H1－F（atgtcttccactcccaccaatctc）和反向引物GmF6′H1－R（tcatatcatggcaaattcaatag）。

取大豆新鮮葉片約1g，提取總RNA。大豆總RNA 提取采用Qiagen公司的RNeasy Plant Mini Kit試劑盒（Qiagen，Cat．No．74903），具體操作步驟參照說明書進行。cDNA 第一鏈合成采用寶生物公司PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser（寶生物，DRR047S）試劑盒并參考其使用說明進行操作，以合成的第一鏈cDNA 為模板，以GmF6′H1－F和GmF6′H1－R 為引物，利用普洛麥格公司的GoTaq? DNA 聚合酶（普洛麥格，M3005）進行PCR擴增。擴增所得PCR 產物與pGM－T 載體（天根公司，VT302）連接后導入大腸桿菌DH5α，鑒定正確后送公司測序（華大公司）。序列的比對和同源比較利用Vector NTI軟件（Invitrogen）進行分析。

1．2．2 實時熒光定量PCR 分析 分別提取液氮速凍收集的大豆各種材料總RNA，DNase I處理以消除基因組DNA 污染。第一鏈cDNA 合成見1．2．1。實時熒光定量PCR 分析采用天根公司SYBRGreen using RealMasterMix（SYBR Green）試劑盒（TIANGEN，China，FP202）。反應條件為94℃預變性2min；94℃變性15s，58℃退火15s，68℃延伸40s；35個循環。通過比較循環閾值法進行初始轉錄物濃度估算［16］，大豆Ubiquitin基因（D28123）作為內標。實時熒光定量PCR 所用的引物如下：大豆Ubiquitin（D28123）利用Ubiquitin－F（tctgacaccattgacaatgtg）和 Ubiquitin－R（cttctggatgttgtagtcagc）；大豆GmF6′H1利用GmF6′H1－F 和GmF6′H1－R。

1．2．3 原核表達載體的構建和重組蛋白的誘導表達 利用帶有特殊限制性酶切位點的引物GmF6′H1－BamHⅠF（aaggatccatgtcttccactcccaccaatc）和GmF6′H1－XhoⅠR（aactcgagtcatatcatggcaaattcaatag）擴增GmF6′H1基因編碼區。用BamHⅠ、XhoⅠ對GmF6′H1基因PCR 產物和表達載體pET32a分別進行雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳回收酶切片段。利用T4DNA 連接酶連接后轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞，挑取陽性克隆進行菌落PCR 和酶切鑒定，鑒定正確的質粒送華大基因公司測序，確保重組表達載體的正確性，最終獲得正確的重組表達載體pET32a－GmF6′H1。

利用CaCl2化學轉化法，將pET32a－GmF6′H1質粒轉入大腸桿菌TransBL21（DE3）感受態細胞。利用菌落PCR 對陽性克隆進行鑒定，鑒定正確的單菌落進一步誘導蛋白表達。帶有pET32a－GmF6′H1質粒的大腸桿菌BL21單菌落接種于含有100ng／mL氨芐青霉素LB液體培養基中，37℃過夜培養。然后將過夜培養的菌液以1∶100的比例接種于50 mL含有100ng／mL氨芐青霉素的LB 液體培養基中，培養至OD600達0．3 左右。此時將培養液轉入20℃搖床中培養1h后加入終濃度為0．5mmol／L IPTG，繼續培養16h。將培養完成的菌液4 000g、4℃離心10min收集菌體細胞，然后用冰冷的裂解緩沖液［50mmol／L Tris－Cl，pH 8．0，0．25mmol／L NaCl，1 mmol／L DTT，1 mmol／L EDTA，0．25 mmol／L PMSF（使用前加入）］重懸，超聲波破碎后，4℃離心10 min，上清上樣于Ni－Agarose His標簽蛋白純化試劑盒（康為世紀，CW0894）層析柱，沖洗3遍后，用溶解緩沖液洗脫目標蛋白。純化的蛋白質的濃度利用生工生物公司的Modified Bradford Protein Assay Kit（生工生物，SK3041）試劑盒進行測定，取少量蛋白質用于聚丙酰胺凝膠電泳檢測，純化的目的蛋白立即用于酶活性鑒定。

1．2．4 GmF6′H1的酶活性分析 GmF6′H1的酶活性分析參照Kai等［15］的文獻。100μL 酶反應體系中包含1．2μg蛋白，100mmol／L Tris／HCl，pH 6．5，1．0 mg／mL BSA，0．5 mmol／L FeSO4，5 mmol／L 2－酮 戊二酸鈉，5 mmol／L 抗壞血酸鈉，1 mmol／L阿魏酰輔酶A，30℃反應1 min。反應完成后，加入20μL 3mol／L NaOH 放置于37℃10 min以終止反應，然后加入20μL 醋酸。反應混合物15 000g 離心10 min，上清進行高效液相色譜（HPLC）分析。HPLC分析的條件為C18柱，流動相為25%（體積比）的甲醇（含有0．1%的甲酸），流速為每分鐘1．0 mL，溫度為40℃，檢測波長為348 nm。酶的活性鑒定所用的試劑均購自上海生工生物工程股份有限公司，阿魏酰輔酶A 來自于余曉丹博士的饋贈。

1．2．5 植物轉化載體的構建 擬南芥Atf6′h1的突變體（SALK＿129938）購置于美國Salk研究所基因組分析實驗室（Ohio State University，Columbus，OH，USA）。依據T－DNA 插入鑒定的原理（http：／／signal．salk．edu／tdnaprimers．2．html），在線設計3條引物LBb1．3（ATTTTGCCGATTTCGGAAC）、LP（GGTCGGGATTCTAATCTCAGC）和RP（AGAAGATGGTGAGGAGGCTTC）以篩選鑒定突變體純合系。

載體p1300－35S－GmF6′H1用于在擬南芥突變體Atf6′h1中過量表達GmF6′H1。利用PCR 從已測序正確的T－GmF6′H1 擴增GmF6′H1 編碼區，擴增引物帶有特異的限制性酶切位點BamHⅠ和SalⅠ，PCR 片段分別用BamHⅠ和SalⅠ雙酶切后，與經過同樣雙酶切的質粒pCambia1300進行連接，連接產物轉化大腸桿菌DH5α，陽性克隆進行菌落PCR 和酶切鑒定。鑒定正確的質粒利用電轉化的方法轉入農桿菌GV3101以備植物轉化侵染。

1．2．6 植物轉化 擬南芥轉化方法參照Bent［17］的方法。擬南芥Atf6′h1突變體種子4℃春化2～3d后播種于用B5 營養液浸泡過的含有蛭石的種植盆，隨后于23℃培養。待植物開花后，剪去其主枝頂端，促側枝發展。在剪枝后的4～6d內，進行農桿菌轉化。將植株倒置于含p1300－35S－GmF6′H1質粒的農桿菌轉化緩沖液的玻璃瓶中，維持30s，取出種植盆，在暗處保濕側放24h，然后將種植盆直立，按正常的方法培育植株至結實，收獲成熟種子。

轉基因植株的純合系篩選參照文獻［18］進行，轉 基因植 株DNA提取采用CTAB法［18］。PCR 鑒定時分別利用潮霉素和GmF6′H1 的特異引物檢測，反應體系為DNA 模板1μL，10×PCR 緩沖液2 μL，2．5mmol／L dNTP 0．4μL，10μmol／L 的正反向引物各1μL，rTaq1U，ddH2O 補齊到20μL。反應條件為94℃預變性3min，94℃變性30s，55℃退火30s；72℃延伸1．5min；35個循環后，72℃總延伸10min。

1．2．7 香豆素的定量分析 擬南芥植株中香豆素含量的測定方法見文獻［19］，植物材料液氮研磨后懸浮在冰冷的甲醇中22h，甲醇溶液中含有4－羥甲香豆素作為內標。提取液15 000g離心10min，上清用于HPLC分析，分析條件見1．2．4。

2 結果與分析

2．1 大豆GmF 6′H 1的克隆

用擬南芥AtF6′H1（At3g13610）和AtF6′H2（At1g55290）［5，15］的基因序列BLAST搜索大豆的EST 據庫（Gene Index），檢測到一個EST 片段（TC440182）與擬南芥AtF6′H1和AtF6′H2一致性高達60%，沒有發現其它一致性更高的EST 序列。序列分析顯示TC440182具有完整的開放閱讀框，把該基因命名為GmF6′H1。利用該序列BLAST 搜索大豆基因組文庫（NCBI，http：／／www．ncbi．nlm．nih．gov／），在染色體18和8上均發現了GmF6′H1基因片段，這表明GmF6′H1基因具有2個基因拷貝，由于大豆是四倍體的雙子葉植物，因此一個基因在基因組中很可能存在著多個拷貝。基因組序列和cDNA序列比對發現，GmF6′H1和AtF6′H1以及AtF6′H2 具有相同的內含子結構。氨基酸序列比對顯示（圖1），GmF6′H1和AtF6′H1以及AtF6′H2分別具有54%和53%一致性。根據得到的序列信息設計特異引物，利用RT－PCR 擴增GmF6′H1全長cDNA 序列，PCR 擴增片段，連接pGEM－T 載體后轉化大腸桿菌，陽性克隆鑒定正確后送公司測序。該基因序列已經上傳NCBI（KJ463390）。多次測序結果顯示，該基因與NCBI基因組文庫中的相應序列有一個氨基酸的差異，這有可能是基因來源的大豆品種不同造成的。

大豆GmF6′H1氨基酸序列分析顯示，該蛋白具有一個2OG－Fe（Ⅱ）氧化酶超級家族的保守區域。在其N－末端有一個非血紅素雙脫氧酶區域，該區域也是依賴于2－酮戊二酸和Fe（Ⅱ）雙氧化酶活性的蛋白保守區段。該蛋白還具有一個2OGD 超級家族保守的Fe（Ⅱ）結合區域H225－X－D227－Xn－H283，AtF6′H1也有該區域。另外，在GmF6′H1中還發現了一個結合C5 羧基基團的保守區域（R293－X－S295）。利用Swiss－Model工作站，根據推斷的氨基酸序列，預測了GmF6′H1、AtF6′H1和AtF6′H2蛋白的三級結構，這3個蛋白具有非常相似的三級結構［20］，這也暗示了GmF6′H1可能和AtF6′H1以及AtF6′H2具有相同的酶學特性，GmF6′H1可能是大豆香豆素合成途徑中的關鍵酶。

圖1 大豆與擬南芥F6′H 氨基酸序列同源性分析Fig．1 Amino acid alignment of GmF6′H1with AtF6′H1and AtF6′H2fromArabidopsis

2．2 GmF 6′H 1的轉錄表達模式分析

以大豆Ubiquitin基因為內參，利用實時定量PCR 研究了GmF6′H1 在各個組織器官中的表達模式，結果（圖2）表明，GmF6′H1在大豆的根中表達量最高，這暗示著大豆根中的香豆素含量最高。對擬南芥的研究也發現，香豆素類物質東莨菪素及其吡喃葡萄糖苷東莨菪苷在野生型的根中含量最高，是地上部分的180倍，這間接印證了香豆素類物質東莨菪素及其衍生物主要在植物的根系中發揮重要作用，可能與植物的抗逆反應機制有一定的關系，相關的研究也發現，真菌和微生物侵染的植物根系會有香豆素類物質的大量積累［21－22］。在大豆的其它組織器官中，GmF6′H1基因的表達量也相對較高，而在擬南芥中AtF6′H1和AtF6′H2主要在根部表達，在地上部分的表達量極低，幾乎檢測不到，但是2，4－D 的處理能夠誘導AtF6′H2 在地上部分的表達。這暗示著不同植物F6′H 的作用和調控機制存在差異，它們可能有不同的底物特異性，這需要進一步的研究進行印證。

同時，本實驗研究了不同處理對大豆GmF6′H1轉錄表達水平的影響。分別用2，4－D、水楊酸和激動素處理了播種10d左右的大豆幼苗，取材時間為處理0、12、24 和48h。取材時分地上部分和根部，液氮速凍。然后分別提取各部分、各時間段材料的總RNA，反轉錄成cDNA 進行實時熒光定量PCR 反應。結果顯示，2，4－D 的處理對大豆GmF6′H1的表達影響很小。但是水楊酸和激動素的處理均顯著提高了該基因的表達水平，然而隨著處理時間的延長，GmF6′H1的轉錄表達水平穩定下降，最后接近處理前的水平（圖3）。這暗示了GmF6′H1基因在大豆生物抗逆中發揮著重要的作用，同時也說明了植物對逆境的適應性，當逆境脅迫達到一定時間后，植物會通過調控自身基因的表達來適應逆境，繼續保持穩定的生長。

圖2 大豆不同器官中GmF 6′H 1PCR 分析Fig．2 Expression pattern of GmF 6′H 1in different organs of soybean revealed by real－time PCR

2．3 GmF6′H1酶活性鑒定

帶有組氨酸標簽的GmF6′H1在大腸桿菌中表達后，利用Ni－NTA 瓊脂糖層析柱純化重組蛋白，GmF6′H1在大腸桿菌中誘導表達和純化的蛋白見圖4。然后通過測定該蛋白是否能夠催化底物的鄰位羥基化來驗證其酶學特性。以不加蛋白的反應混合物為陰性對照，當以阿魏酰輔酶A 為底物時，一個鄰位羥基化的產物通過經反式／順式異構化和內酯化的自發過程生成了東莨菪素。HPLC檢測到一個產物的吸收峰，該吸收峰的紫外吸收光譜與東莨菪素相似（圖5）。這些結果表明，大豆GmF6′H1能夠催化阿魏酰輔酶A鄰位的羥基化，屬于依賴于Fe（Ⅱ）和2－酮戊二酸依賴的雙加氧酶。

圖3 水楊酸（A）和激動素（B）處理后地上部和根中GmF 6′H 1表達Fig．3 Expression pattern of GmF 6′H 1under the treatments of alicylic acid（A）and kinetin（B）

圖4 GmF6′H1蛋白表達和純化的SDS－PAGE檢測Fig．4 SDS－PAGE analysis of the expression of GmF6′H1

2．4 GmF6′H1參與植物香豆素合成的功能分析

為了更好地理解GmF6′H1的功能，在擬南芥Atf6′h1突變體中過量表達了大豆的GmF6′H1，以便觀察該蛋白是否能把擬南芥的突變體恢復成野生型。在35S啟動子下的GmF6′H1通過農桿菌轉化的方法轉入擬南芥Atf6′h1突變體植株。共獲得5個獨立的RT－PCR驗證正確的轉基因系，轉基因擬南芥與Atf6′h1突變體植株外在表型沒有觀察到明顯的差異（圖6）。依據文獻［19］提供的方法測定轉基因植株根系的香豆素含量，同時提取擬南芥野生型和擬南芥Atf6′h1 突變體根系香豆素作為對照。HPLC分析結果（圖7）顯示，GmF6′H1過量表達的轉基因株系根中香豆素的含量相比較擬南芥突變體本身有所提高，與野生型擬南芥中香豆素含量接近。這表明GmF6′H1與AtF6′H1有相似功能，均在香豆素生物合成的過程中發揮著關鍵作用。擬南芥野生型和突變體含量比較與已發表的結論相似［15］。

圖5 大豆GmF6′H1酶活性鑒定的HPLC分析Fig．5 HPLC profiles of extracts from different reaction systems

圖6 擬南芥突變體與轉基因株系表型Fig．6 The phenotype comparison among Arabidopsis

圖7 各材料根系中香豆素的含量比較Fig．7 Coumarin content in roots from different plants

3 討 論

盡管目前很多研究顯示香豆素及其衍生物在植物對病原菌的抗逆過程中發揮著重要作用，但是其機制并不清楚，很多植物香豆素合成的關鍵酶尚未知曉，而香豆素本身的醫療作用已經使人們越來越關注它。為了更深入地理解香豆素在植物中的作用，本研究獲得了1個大豆的香豆素合成關鍵基因GmF6′H1，并通過一系列的實驗研究了其酶學生化特性，同時利用基因的表達模式分析和互補實驗探索了其在植物中的生物學功能。

在過去的幾十年里，大豆的營養價值越來越受到人們的關注，其次生代謝的研究已經非常深入，然而在大豆植物化學物質中，異黃酮是目前討論最多的“健康促進因子”，而香豆素卻并沒有引起足夠的重視。由于香豆素在植物抗逆反應中也發揮著一定的作用，因此探索植物香豆素合成的關鍵酶顯得至關重要。同異黃酮相似，香豆素也是一組苯酚類次生代謝物，并且其生物合成途徑也是苯丙氨酸代謝途徑的一個分支。苯丙氨酸生物合成途徑起始于L－苯丙氨酸，該氨基酸經苯丙氨酸解氨酶、肉桂酸－4－羥化酶、4－香豆酸：輔酶A 連接酶、香豆酸－3′－羥化酶、咖啡酰輔酶A 氧甲基轉移酶被催化生成阿魏酰輔酶A。接著阿魏酰輔酶A 經過鄰位的羥基化，以及反式／順式異構化和內酯化的過程，最終生成香豆素類物質東良菪素，其中后兩步的過程是自發的，不需要酶的催化，因此鄰位羥基化是植物中香豆素合成的關鍵步驟［15］。目前僅在擬南芥中報道發現了一個催化鄰位羥基化的香豆素生物合成關鍵酶AtF6′H1。該酶是一個依賴于Fe（Ⅱ）和2－酮戊二酸的雙加氧酶，能夠催化阿魏酰輔酶A 的6′位羥基化生成東良菪素［15］。在大豆中，利用同源克隆的方法獲得了1個擬南芥的同源基因GmF6′H1。氨基酸序列比對的分析結果顯示，該酶與擬南芥AtF6′H1、AtF6′H2 的一致性很高。分別利用GmF6′H1、AtF6′H1和AtF6′H2氨基酸序列進行了三維結構預測，結果表明，GmF6′H1 和擬南芥AtF6′H1、AtF6′H2 具有相似的空間結構和作用位點。而且GmF6′H1的酶學特性分析也顯示，該蛋白能夠以阿魏酰輔酶A 為底物催化其6′位羥基化生成東良菪素，這表明大豆GmF6′H1也是香豆素生物合成關鍵酶。與此同時，在擬南芥Atf6′h1突變體中過量表達GmF6′H1明顯提高了轉基因植株根系中的香豆素含量，與擬南芥野生型根中的香豆素含量接近，進一步印證了大豆GmF6′H1的功能。將來，利用過量表達和RNA 抑制的方法，在大豆中研究GmF6′H1的功能可能會更深入地揭示其更多的生物功能。

基因表達模式的分析結果顯示，與擬南芥AtF6′H1相比，GmF6′H1存在著獨特的轉錄表達模式。GmF6′H1 在大豆的根、莖、葉、莢果中均有表達，而擬南芥AtF6′H1主要在根中表達，在地上部分其表達量極低，這說明大豆中香豆素在根和地上部分都發揮著重要作用，或者是GmF6′H1在地上部分以其他物質為底物催化化合物生成。在根中，香豆素可能和異黃酮一樣，作為一種植物根系分泌的一種信號物質，吸引相應的微生物與根系形成共生關系，促進植物的營養吸收，或者作為一種化學物質抑制微生物在根系的生長，相關研究也發現香豆素類化合物不僅能夠觸殺一些農業害蟲［23］，而且對一些植物病原真菌有顯著的抑制作用［24］。在地上部分，香豆素可能以其特殊的味道增強了植物的抗菌、抗蟲性，而且有研究也發現香豆素能夠抵抗紫外線的照射，并且紫外線照射能夠提高香豆素的抑菌性［4］。當用抗逆信號分子水楊酸和激動素處理大豆的幼苗時，GmF6′H1 在地上部分和根中都被強烈地誘導表達，而2，4－D 對該基因的表達沒有明顯的作用，這表明GmF6′H1在大豆正常生長和抗逆過程中可能都發揮著重要作用，由于大豆本身的香豆素種類就很繁雜，因此與擬南芥AtF6′H1相比，大豆GmF6′H1可能有更廣的底物范圍，也可能是不同植物中的香豆素合成酶存在不同的調控機制。由于目前報道的以輔酶A 為底物的雙加氧酶并不多見，因此對大豆GmF6′H1的反應機制和底物特異性進行進一步的深入探討將會為今后的研究提供更多的借鑒。

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