HLA新等位基因HLA-DRB1*09：19的確認及序列分析

孫 昂，粟玉萍，代 敏，蘇湘暉，胡 濱

（岳陽市中心血站，湖南414000）

HLA新等位基因HLA-DRB1*09：19的確認及序列分析

孫 昂，粟玉萍，代 敏，蘇湘暉，胡 濱

（岳陽市中心血站，湖南414000）

目的應用DNA測序方法確認人類白細胞抗原（HLA）-DRB1新等位基因。方法應用基因測序技術對造血干細胞捐獻者進行HLA分型，發現1個與HLA-DRB1*09相關的異常等位基因，采用Sanger法對其第2外顯子進行測序分析，以確認是否為新的基因序列。結果1例樣本DRB1*09：XX第2外顯子序列與所有已知等位基因序列均不一致，與DRB1*09：01：02高度相似，外顯子2區域中的149位堿基發生了C→T堿基替代，并導致了相應氨基酸序列蘇氨酸突變為甲硫氨酸。結論該等位基因為HLA-DRB1*09組中的1個新等位基因，被WHO的HLA因子命名委員會證實命名為DRB1*09：19。

HLA-DR抗原/遺傳學；HLA抗原；等位基因；核酸探針；序列分析

自 1958年發現第 1個人類白細胞抗原（human leukocyte antigen，HLA），人類開始了對HLA的研究。隨著分子生物學技術和測序技術的發展，對HLA的研究逐步深入[1]。中華骨髓庫岳陽HLA分型實驗室在對造血干細胞捐獻志愿者進行HLA分型時，發現1例HLA-DRB1新等位基因，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 標本來源 造血干細胞捐獻志愿者，湖北籍，漢族，男，2013年12月在岳陽市捐獻血液時同意捐獻造血干細胞，2014年5月在本實驗室HLA分型中因與軟件數據庫中所有已知HLA-DRB1位點等位基因核苷酸序列不一致而進一步確認。

1.2 方法

1.2.1 標本DNA提取 抽取志愿者外周靜脈血（EDTA抗凝）5 mL，采用DNA提取純化試劑（北京TIANGEN公司，批號∶L0116），按試劑說明書提取DNA，擴增前調整DNA濃度40～100 ng/μL，光密度（OD）260/280∶1.6～1.8。

1.2.2 標本HLA基因分型 采用HLA SBT試劑盒（荷蘭GenDx公司，批號∶11250611）進行HLA-A、HLA-B、HLA-DRB1位點的常規高分辨基因分型，使用美國Onelambda公司HLA Fusion 3.0軟件分析HLA基因型。

1.2.3 新等位基因的確定 對不能確定的HLA-DRB1位點基因型的樣本采用位點特異性引物進行PCR擴增，PCR產物經酶純化及稀釋后作為模板，根據Sanger法對其第2外顯子進行測序分析，正向測序按照等位基因組間差異分成兩組，即2Fa和2Fb。2Fb組檢測DRB1* 04∶07∶09基因型，2Fa組則檢測除DRB1*04∶07∶09以外的其他基因型。測序方法∶用DRB1位點擴增產物1μL，序列組合9 μL，總體積10 μL進行PCR反應，PCR程序為預變性96℃、10 s 1個循環，變性96℃、10 s，退火50℃、10 s，延伸60℃、120 s 25個循環，15℃保存。PCR產物純化后用3730 DNA分析儀（美國ABI公司）測定序列。所有操作嚴格按試劑和儀器說明書進行。通過2次獨立PCR擴增，分別測序，驗證結果的正確性，采用SBTengine軟件分析序列判讀基因序列，通過EBI（http∶//www.ebi.ac.uk）和NCBI（http∶//www.ncbi.nlm.nih.gov）進行HLA等位基因序列比對（BLAST），以確認是否為新的基因序列。

2 結 果

2.1 PCR-SBT分型結果 測序結果導入軟件后分析結果顯示，該志愿者HLA-DRB1位點與等位基因DRB1*08∶03∶02和DRB1*09∶01∶02有1個堿基不匹配，不能指定為任何HLA-DRB1位點等位基因。測序結果見圖1，DRB1*08∶03∶02、DRB1*09∶01∶02的序列在 149位堿基應為C，而該標本在此堿基位置為Y（C+T），提示存在突變。

圖1 HLA-DRB1*08：03：02、DRB1*09：01：02的雜合測序結果

2.2 新等位基因與DRB1*09∶01∶02序列差異分析根據正向2Fb引物測序結果顯示，未知基因與同源性最高的等位基因DRB1*09∶01∶02序列差異在第2外顯子，編碼序列在149位堿基發生了C→T的改變（圖2），導致密碼子第21位發生了ACG→ATG的改變，結果造成第50位氨基酸由蘇氨酸（Thr）突變為甲硫氨酸（Met）（圖3）。該等位基因的測序結果擴增涵蓋了第2、3外顯子，測序長度為270、282 bp，將這2個外顯子序列提交給Genbank，獲得Genbank登錄號JX040451。將新等位基因相關數據上報給WHO的HLA因子命名委員會，2014年12月22日被WHO的HLA因子命名委員會證實命名為HLA-DRB1*09∶19。

圖2 DRB1*09：19與DRB1*09：01：02核苷酸序列比對

圖3 DRB1*09：19與DRB1*09：01：02氨基酸序列比對

3 討 論

HLA系統是目前已知人類最復雜的遺傳多態性系統，HLA系統的高度多態性主要表現在同一基因座位的等位基因的高度多態性[2]；在單核苷酸多態性水平上，HLA區域的基因多態性（5%～17%）遠遠高于人類基因組多態性（0.08%～0.20%）[3]。HLA系統還具有明顯的種族特異性和地域差異性[4]，本實驗室測得岳陽漢族人群DRB1*09的基因頻率為19.41%，與湖北人群比較無顯著性差異，與北方人群比較有顯著性差異[5]。

隨著中華骨髓庫和世界骨髓庫的庫容量的擴大，越來越多的HLA新等位基因被發現[6-7]。2011年全世界僅發現HLA等位基因6 403個[8]；而截止2015年1月31日，HLA等位基因已發現12 542個，各位點基因數都相應增加（http∶//www.ebi.ac.uk/ipd/imgt/hla/stats.html）。岳陽HLA分型實驗室自2004年發現第1例新等位基因并被WHO的HLA因子命名委員會證實命名為HLAB*54∶03以來[9]，截止2014年12月底，又陸續發現異常基因21例，已被WHO的HLA因子命名委員會證實命名新等位基因16例，另5例正在等待證實命名中。

HLA系統中的DR抗原是異基因移植免疫反應中最重要的抗原之一，決定其特異性的主要編碼基因DRB1座位具有高度多態性[10]。不少學者研究發現，HLA-DRB1位點與疾病的發生具有相關性，如HLA-DRB1*08為新疆漢族人群再生障礙性貧血的易感基因[11]，HLADRB1*12∶02與新生兒溶血病的發生呈正相關[12]等。HLA新等位基因的研究極大地豐富了人類遺傳學寶庫，隨著研究人員的不斷努力，將得到不同種族、不同地域人群的HLA基因型，而中國人特異的HLA新等位基因將更多地被發現，這對人類家系調查、法醫鑒定、器官移植特別是造血干細胞移植、疾病的防治將起到重要作用。

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[7]Klitz W，Hedrick P，Louis E.Understanding the new allele problem[J]. Tissue Antigens，2011，77（5）∶370.

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[10]龔非力.醫學免疫學[M].2版.北京∶科學出版社，2003∶118-121.

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[12]孫昂，方奎明，粟玉萍，等.新生兒溶血病與HLA-DRB1相關性研究[J].實用預防醫學，2014，21（6）∶649-651.

10.3969/j.issn.1009-5519.2015.13.032

：B

：1009-5519（2015）13-2009-02

∶2015-02-17）

∶孫昂（1972-），男，湖南岳陽人，碩士研究生，副主任技師，主要從事HLA分型、親子鑒定、疑難血型鑒定等工作；E-mail∶sunang1992@163.com。

∶蘇湘暉（E-mail∶921998392@qq.com）。