苦蕎二氫黃酮醇4－還原酶的原核表達與多克隆抗體制備

李 蒙，陳芳霞，呂 寧，陳 鵬

（西北農林科技大學 生命科學學院，陜西楊陵712100）

苦蕎（Fagopyrum tataricum）作為一種健康食 品資源正風靡世界，主要在于其含有高生物價的蛋白質和豐富的維生素 ，近年來的研究表明，黃酮類化合物是苦蕎中重要的營養保健功能因子，蘆丁、兒茶素、花青素作為主要黃酮類化合物，具有抗氧化［2］、抗癌［3－4］、降血脂［5］等一系列藥理功效。

在植物類黃酮代謝途徑中，無色花青素是花青素、兒茶素以及原花色素的共同前體。二氫黃酮醇4－還原 酶（dihydroflavonol 4－reductase，DFR）可 將二氫黃酮醇還原為無色花青素，是調控植物體內類黃酮代謝物積累的關鍵功能基因和重要的限速酶之一，催化立體結構專一的三種黃酮醇（二氫山奈酚、二氫槲皮素和二氫楊梅素）生成花色素的前體物［6］，進而通過花色素合成酶（ANS）和類黃酮糖基轉移酶（3－GT 或5－GT）形成各種花青素苷［7］。由于它的重要性，研究發現不同物種的DFR 對3種底物的偏愛性也存在差異，但DFR 氨基酸序列在很多區域有較高的同源性，而且在植物的進化過程中DFR 的功能沒有變化［8］。研究釀酒葡萄DFR 三維結構發現，底物特異性結合區域由26個氨基酸組成，其中任何一個氨基酸的突變都會改變酶對底物的特異性［6］，根據特異區133位氨基酸的不同，可分為Asn型、Asp型和非Asn／Asp型［9］。

目前已基本探明類黃酮花青素的生物合成途徑，由于DFR 編碼基因是花色改良和提高生物脅迫的關鍵基因之一，該基因已經在不同種得到分離，在擬南芥、大麥、金魚草、葡萄、水稻、番茄中以單拷貝存在，毛果楊、非洲菊，苜蓿是以功能特性不同的多拷貝存在［10－11］。……