攜氧技術在肝移植供肝保存中的應用

賈俊君 李建輝，2 張靜 周燕飛 周琳 鄭樹森，2

肝移植是終末期肝病最有效的治療方法，雖然心臟死亡器官捐獻(donation after cardiac death，DCD)、劈離式供肝等應用擴大了供肝來源，但相對于不斷增加的肝移植等候名單，供肝來源仍然嚴重不足［1］。供肝保存技術是保證并進一步擴展供肝來源的關鍵，發展供肝保存技術的關鍵是避免移植物損傷，尤其是缺血再灌注損傷(ischemic perfusion injury，IRI)。我們前期對減少供肝IRI 做了較系統的研究及綜述［2-3］。隨著2013 年“杭州宣言”的發布和2015 年起我國人體器官來源只能采用公民逝世后器官捐獻，我國供肝短缺形勢更加嚴峻，以DCD 供肝和脂肪肝為代表的擴大標準器官捐獻(expand criteria donor，ECD)供器官得到越來越廣泛的應用，并且逐漸成為主要供肝來源，但這些供肝對缺血、缺氧更加不耐受［4-5］。

目前，靜態冷保存(static cold storage，SCS)是肝移植供肝保存的金標準，機械灌注是供肝保存的新途徑，越來越受到肝移植學者的重視［6］。針對肝臟離體保存過程中是否需要額外加氧一直存在爭議，組織在深低溫的時候需氧量非常少，在0 ～4 ℃時細胞代謝活力大約降至正常的5% ～10%。部分學者認為溶解在保存液中的氧氣已經能夠滿足器官氧耗的需求［7］。而另一部分學者則認為即使在0 ～4 ℃環境中，離體肝臟仍需要0.27 mol·min-1·g-1的氧氣，而SCS 并不能滿足這個氧耗需求［8］。另外，研究表明低溫機械灌注(hypothermic machine perfusion，HMP)過程中肝細胞缺少氧氣容易導致缺氧空泡產生，而在灌流液中加入氧氣該現象就會消除［9］。

大量研究表明，合適的氧濃度供給有利于增加抗氧化物、維持三磷酸腺苷(ATP)水平和線粒體功能，尤其對于DCD 和ECD 供肝［8，10-11］。攜氧技術對ECD 供肝顯得尤為重要，本文就攜氧技術在供肝保存中的應用及相關機制做一綜述。

1 攜氧載體

醫用級攜氧載體一般有兩類:(1)血紅蛋白類，包括人類自身及其他物種改良的血紅蛋白;(2)人造血液，主要是指全氟化碳類物質(perfluorocarbon，PFC)，包括全氟正辛烷、全氟三丁胺、全氟十氫萘、全氟十四氫菲以及全氟溴辛烷等。

1.1 血紅蛋白類

血紅蛋白類攜氧載體最為常用，但較為稀缺，一直都處于供不應求狀態。目前，許多公司致力于緩解這一矛盾，將現有血紅蛋白進行加工或者其他物種血紅蛋白進行基因改造，以實現血制品的長時間保存和增加血紅蛋白來源，但是這些產品大多在臨床試驗階段，真正用于臨床的還很少。這類產品簡要進展如下(詳見表1):(1)HBOC-201，是基于牛血紅蛋白改造而來，目前已經應用于臨床非心臟手術患者，并取得理想效果［12］;(2)Hemopure，為牛血紅蛋白多聚體，是第1 個批準用于臨床的血液代用品［13］，在大鼠DCD 供肝體外保存中效果顯著，優于SCS［14］;最近基于Hemopure 配制的攜氧灌流液應用于大動物肝移植過程中供肝的機械灌注，結果顯示這項氧合技術供肝保存效果明顯優于SCS［15］;(3)M101，由海洋無脊椎動物的血紅蛋白改造而來，有文獻報道在UW 液中加入M101 可以減少大動物腎移植術后移植腎纖維化和無功能的發生［16］，隨后又有文獻報道M101 結合UW 液在大動物供肝保存方面優于單獨使用UW 液［17］;(4)此外，血紅蛋白類攜氧載體還包括因為不良反應顯著而被終止臨床試驗的DCLHb-HemAssist 等。

表1 血紅蛋白類攜氧載體介紹

1.2 PFC

血液及血液制品存在HIV、肝炎病毒交叉感染的潛在風險［21］。由于輸血安全性問題、需血量增多以及獻血量減少等原因，迫使人們努力去尋找一種具有與血液功能相同的代用品。PFC 是研究最多的血液代用品，其黏度低于血液而稍高于水，溶氧能力是血液的20 ～25 倍，并且不同于血紅蛋白的溶氧曲線，PFC 遵循亨氏線性法則(Henry＇s linear law)，溫度對PFC 攜氧能力影響并不大，這一點使其尤其適合用于肝臟低溫保存。PFC 最初作為血液代用品用于治療急性出血和貧血，目前其用途已由單獨血液代用品逐漸擴展為需氧治療的輔助劑，在臨床各科室均有潛在的應用價值。PFC 的發展已歷經半個世紀，但其臨床應用尚非常有限。

目前開發的氟碳乳劑已有3 代:(1)第1 代氟碳乳劑為Fluosol-DA20，美國食品和藥品管理局許可用于臨床冠狀動脈血管成形術中，以增加機體氧氣供應，臨床觀察能減少術中心臟損傷［22］;(2)第2 代氟碳乳劑為Oxygent 和Oxyfluor［23-24］，攜氧能力和穩定性均較第1 代有所提高，半衰期24 ～48 h，室溫下可存放1 年多，不影響血液動力學;目前Oxygent在美國、歐洲、加拿大已完成了Ⅲ期臨床試驗，但結果發現使用Oxygent 的冠狀動脈旁路移植術患者腦血管事件發生率升高，試驗因此而停止;近期俄羅斯獲準氟碳類產品Perftoran 為醫用［25］，其主要成分為氟萘烷和氟甲基一環己基哌啶;(3)第3 代產品正處在臨床前期開發階段［26］。詳見表2。

PFC 產品也有一些缺點和不良反應［22］:(1)PFC是一種氧溶解劑，必須使用高濃度氧氣(70% ～100%)才能提供足夠的氧氣溶解量;(2)循環時間短，使用高濃度(70% ～100%)PFC 可致血黏度升高;(3)流感樣癥狀，輸入時可出現急性和短暫的面色潮紅、背痛，隨之發熱和寒戰;(4)激活補體系統和吞噬細胞(第1 代明顯，第2 代產品中尚未發現)，大劑量PFC 可導致肝淤血和短暫的免疫防御功能受損。

表2 全氟化碳類物質攜氧載體介紹

2 攜氧方式

2.1 靜脈系統吹氧

最簡單的供氧方式是直接通過靜脈系統向供肝吹入氧氣(venous systemic oxygen persufflation，VSOP)。這種方法一般將肝臟浸沒于冷保存液中，通過肝上下腔靜脈置管接入氧氣，肝下下腔靜脈端暫時結扎。利用氧氣進入靜脈產生壓力，竇后型小靜脈擴張，用27 G 小注射器刺破這些小靜脈釋放氧氣［35］。有兩項大鼠實驗研究證明VSOP 相比于其他供氧方式可以改善肝功能，降低肝酶水平，減少組織壞死、線粒體產生的凋亡，并且可以減少內質網應激［36-37］，臨床試驗也證實VSOP 可以保護供肝結構及功能［38-39］。

2.2 氧合器灌流液氧合

最常見的氧合方式是通過氧合器在灌流液中進行氧合。根據氧合器不同又可以分為鼓泡式氧合器和膜式氧合器。一般認為膜式氧合較鼓泡式氧合更適用于臨床，因為鼓泡式氧合容易產生氣泡導致氣栓形成。此外，如果用紅細胞作為攜氧物質，鼓泡式氧合容易造成紅細胞破壞繼而引發溶血。

2.3 PFC 單層法和雙層法

PFC 為親脂性物質，不溶于血液、水及其他介質，密度高，表面張力低，因此有其特殊的攜氧方式，學術上分為雙層法和單層法:(1)雙層法最常用，應用這種方法的器官保存液由兩層組成，上層為常用器官保存液(如UW 液)，下層為PFC，器官置于雙層液體之間，通過不斷給下層PFC 補充氧氣，使氧氣能夠彌散進入器官;已有多個移植中心采用雙層法保存胰腺［40-41］，肝移植領域也有零星報道［42］;(2)單層法，顧名思義就是將整個器官置于PFC 中保存，動物實驗表明單層法更有利于器官的保存，尤其是胰腺、胰島保存［43-44］;單層法用于肝臟保存還未見報道。

3 攜氧技術相關機制和應用

氧是ATP 產生的必需物質，是細胞活動的驅動因素。在肝臟獲取的過程中，血流一旦阻斷，氧氣和營養等物質就停止供應，ATP 持續消耗導致鈉鉀泵失功、細胞內外電解質濃度差消失，繼而引起細胞水腫、鈣離子內流、磷酸酶活化，最終導致炎癥產生和細胞死亡［45］。隨著缺氧的持續，在缺血、缺氧的環境下，黃嘌呤脫氫酶轉化為黃嘌呤氧化酶，而黃嘌呤氧化酶在再灌注階段氧氣存在時，將堆積的酸性產物轉化為黃嘌呤、次黃嘌呤及活性氧自由基，引起脂質過氧化甚至細胞破壞［46］。對于DCD 供肝，在供肝血流阻斷與肝臟灌洗之間有額外的熱缺血時間，導致更加嚴重的ATP 消耗和更長時間的缺血、缺氧。

過多的活性氧(reactive oxygen species，ROS)是IRI 的核心環節，主要包括O2-、H2O2及脂質過氧化自由基(ROO-)等。適量的ROS 作為體內第二信使，能夠調節轉錄因子活化、細胞生長、凋亡及粘附等生理過程［47］。嚴重缺氧條件下，導致大量的ATP被消耗殆盡，大量的次黃嘌呤在缺氧組織中不斷積累;與此同時，內源性抗氧化劑如超氧化物歧化酶被大量消耗，積累的次黃嘌呤氧化酶催化產生大量ROS。另外，Kupffer 細胞和中性粒細胞的激活、細胞色素系統功能的失調以及兒茶酚胺氧化產物的增加，也大大增加了ROS 的釋放，繼而引起細胞核損傷，最終導致細胞凋亡、壞死。ROS 導致的細胞凋亡機制不詳，可能與以下4 種途徑相關［48］:(1)ROS導致脂質過氧化，繼而引起促凋亡基因開始活化，誘導細胞凋亡;(2)大量ROS 攻擊細胞內正常蛋白質，引起酶喪失活力;(3)ROS 可直接造成DNA 損傷，導致染色體畸變，DNA 結構發生改變;(4)ROS 影響細胞內核基因轉錄，細胞表型特征改變，誘導細胞凋亡。

臨床實踐中SCS 往往不進行額外供氧，而對常溫和亞低溫機械灌注提供額外氧氣可增加抗氧化產物、恢復線粒體功能已經基本達成共識，有研究認為應維持氧分壓為19.2 kPa 或55.0 kPa，但何為最優參數，還需要進一步數據支持［49-50］。HMP 過程與SCS 類似，目前對于HMP 過程中的氧合問題仍存在爭議，但對于DCD 或ECD 而言，普遍認為添加額外的氧氣有利于供肝保存，總計為412 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa，下同)的氧分壓可以滿足肝臟代謝需求［50］。由于肝臟由門靜脈(35%)和肝動脈(65%)同時供氧，因此有學者認為肝動脈268 mmHg和門靜脈144 mmHg 的氧分壓符合肝臟耗氧的生理需求［49］。甚至有學者提倡用純氧，因其在減少氧化應激和改善肝功能方面要優于濃度為20%的氧［51-52］。

4 展 望

隨著供肝供需矛盾的加劇，DCD 和ECD 供肝所占比重逐年增加，攜氧技術的應用也必將越來越廣泛。此外，PFC 作為一種有效的攜氧載體用于SCS、肝臟灌洗以及機械灌注逐漸得到認可。越來越多的研究表明應用PFC 灌洗供肝或者保存肝臟優于傳統的保存液。盡管第1 代PFC 的各種不良反應導致其未能在臨床廣泛應用，但是隨著PFC 第2 代、第3 代產品的出現及機械灌注越來越受到重視，今后PFC 在肝臟保存中一定會發揮越來越重要的作用。進一步克服其局限性、拓寬臨床應用領域是PFC 今后努力的方向。目前亟需加強臨床和實驗研究，予以證實PFC 的安全性和有效性。

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