浙江南部地區漢族人群腎移植術后糖尿病患者KIR 基因多態性分析

高小民 吳琦 張巖 梁勇 戚小剛 陳必成 蔡勇 楊亦榮 鄭少玲 夏鵬

移植術后糖尿病(post-transplantation diabetes mellitus，PTDM)是腎移植術后長期并發癥之一，發病率為2.5% ～24.0%［1-2］，其發生發展將會引起移植腎排斥反應及敗血癥的發生，嚴重影響移植腎存活，導致腎移植受者病死率及心血管事件發生率升高。因此，隨著腎移植受者生存期的不斷延長，PTDM 作為影響受者預后的重要因素之一，日益受到關注［3］。PTDM 具有2 型糖尿病的高度遺傳異質性特點［4］，因此推測2 型糖尿病的易感基因也有可能是PTDM 的易感基因。2 型糖尿病的易感性被認為與復雜的遺傳因素相關，其發病機制與炎癥和免疫反應密不可分，國外文獻報道在免疫應答中起重要作用的自然殺傷細胞免疫球蛋白樣受體(killer cell immunoglobulin-like receptor，KIR)基因多態性與2 型糖尿病發病相關［5］。本研究采用病例對照研究的方法，探討浙江南部地區漢族人群腎移植受者KIR 基因多態性與PTDM 的相關性。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選取在溫州醫科大學附屬第一醫院器官移植中心行腎移植，且2009 年12 月至2010 年12 月期間在本中心隨訪的170 例浙江南部地區漢族腎移植受者。排除標準:少數民族，移植術前已確診糖尿病，多器官移植或再次腎移植，處于急性應激期、感染狀態或極度衰弱狀態，移植術后1 年后確診糖尿病的受者。共有146 例受者入組本研究。研究方案經本院醫學倫理委員會批準，研究對象均簽署了知情同意書。

采用1999 年世界衛生組織或美國糖尿病協會的糖尿病診斷標準［6-7］:腎移植術前無糖尿病，移植術后血糖持續升高，且達到一天中任意時刻血糖≥11.1 mmol/L，或空腹至少8 h 后血糖≥7.0 mmol/L，即診斷為PTDM。如受者無明顯糖尿病癥狀，可行口服葡萄糖耐量試驗，服用后2 h 血糖≥11.1 mmol/L即診斷為PTDM。結果需在非同日重復測量核實。

146 例腎移植受者術后均使用甲潑尼龍沖擊治療3 d，劑量分別為500、300、200 mg。術后免疫抑制維持期，25 例受者采用環孢素+ 嗎替麥考酚酯(mycophenolate mofetil，MMF)+甲潑尼龍三聯免疫抑制方案，121 例受者采用他克莫司+MMF +甲潑尼龍三聯免疫抑制方案。環孢素起始劑量為6 ～8 mg·kg－1·d－1，他 克 莫 司 起 始 劑 量 為0. 05 ～0.15 mg·kg－1·d－1，隨后根據血藥濃度谷值調整劑量。MMF 起始劑量為1.5 ～2.0 g/d，最后維持在0.5 ～1.0 g/d。甲潑尼龍起始劑量為64 mg，隨后每日遞減8 mg，最后維持在4 ～6 mg/d。

1.2 研究方法

1.2.1 腎移植受者血液標本基因組DNA 抽提

抽取受者前臂靜脈血2 mL，置于乙二胺四乙酸二鉀抗凝管中，用DNAfast200 微量基因組DNA 極速抽提試劑盒(購自上海飛捷生物技術有限公司)提取外周血總DNA，置于－20 ℃下保存備用。

1.2.2 KIR 基因分型檢測和計算

采用聚合酶鏈反應－序列特異性引物技術(PCRSSP)進行KIR 基因分型檢測，共檢測16 個KIR 基因，包括KIR 2DL1 ～5、2DS1 ～5、3DL1 ～3、3DS1、2DP1 和3DP1。根據NCBI Gen Bank 2009 年公布的KIR 等位基因編碼序列設計，并經過BLAST 驗證;依據人類生長激素基因保守片段設計內參引物;引物均由上海捷瑞生物工程有限公司公司合成(見表1)。

表1 KIR 基因PCR-SSP 分型法引物

取KIR 基因分型檢測試劑盒(天津市秀鵬生物技術開發有限公司)配套的濃縮Buffer 70 μL，加90 μL 去離子水，6 U Taq DNA 酶和10 μL DNA，混勻離心后分別向16 個孔中(孔內含引物)加入10 μL 上述混合液，封膜后進行PCR 反應。

PCR 循環參數:96 ℃預變性2 min;96 ℃變性20 s，62 ℃退火60 s，72 ℃延伸45 s，35 個循環;72 ℃延伸5 min。將PCR 產物轉移到2%的瓊脂糖凝膠孔中電泳，在紫外凝膠成像系統(美國UVP 公司)下觀察電泳結果并拍攝成像，保存結果。

KIR 基因型頻率(f)=觀察到的KIR 基因陽性個數/被研究人數;KIR 基因頻率(gene frequency，GF)=1 －。

1.3 統計學方法

采用SPSS 19.0 統計軟件處理數據。正態分布計量資料以均數±標準差()表示，采用t 檢驗進行比較;非正態分布計量資料以中位數表示。計數資料以百分數表示，采用χ2檢驗進行比較。P ＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結 果

截至2010 年12 月，146 例腎移植受者共確診PTDM 45 例，余101 例受者未發現血糖異常，作為正常對照組。PTDM 組45 例患者男性30 例，女性15 例，平均年齡(51 ±9)歲，中位確診時間為腎移植術后3.8 個月(1 ～12 月);8 例患者采用環孢素+MMF+甲潑尼龍三聯免疫抑制方案，37 例采用他克莫司+MMF +甲潑尼龍三聯免疫抑制方案。正常對照組101 例受者男性71 例，女性30 例，平均年齡(49 ±9)歲;中位隨訪時間為4.5 年(1 ～10 年);17 例采用環孢素+MMF +甲潑尼龍三聯免疫抑制方案，84 例采用他克莫司+MMF+甲潑尼龍三聯免疫抑制方案。兩組患者性別、年齡、免疫抑制方案比較差異均無統計學意義(t =0.34、χ2=0.192、χ2=0.020，P 均＞0.05)。

兩組患者KIR 基因頻率及基因型頻率見表2。其中，KIR 2DL4、3DL2、3DL3 和3DP1 為框架基因，在兩組所有個體中均表達，基因頻率和基因型頻率均為100%。KIR 2DL1、2DL3、2DS4、3DL1 和2DP1在兩組受體中的基因型頻率均超過90%。KIR 2DS2、2DS3 和2DS5 在兩組受體中的基因型頻率均小于30%。與正常對照組相比，PTDM 組KIR 2DL2、2DS2、2DS4 基因型頻率增高，其中KIR 2DL2 基因型頻率差異有統計學意義(χ2=5.004，P ＜0.05)。與正常對照組比較，PTDM 組KIR 2DL1、2DL3、2DL5、2DS1、2DS3、2DS5、3DL1、3DS1 和2DP1 基因型頻率均降低，但差異均無統計學意義(P 均＞0.05)。KIR基因擴增產物瓊脂糖凝膠電泳圖結果示例見圖1。

圖1 KIR 基因擴增產物瓊脂糖凝膠電泳圖示例

表2 PTDM 組患者與正常對照組患者KIR 基因頻率和基因型頻率分布(%)

3 討 論

PTDM 的發病機制主要與使用免疫抑制劑導致胰島B 細胞受損、胰島素分泌減少和胰島素抵抗等因素有關，涉及復雜的免疫和炎癥反應過程，因其病理生理學特點與2 型糖尿病相似，且具有高度遺傳異質性，可以將其視為2 型糖尿病［8-9］。研究認為，2 型糖尿病實質是一種全身性、慢性、低度炎癥狀態，炎性標志物能預測2 型糖尿病及其相關代謝紊亂的發生［10-11］，提示2 型糖尿病的發生發展與免疫和炎癥反應密不可分。同時，2 型糖尿病是一種具有明顯遺傳易感性的多基因復雜性疾病。既往研究表明，與其發病相關的易感基因主要包括鈣蛋白酶10基因、葡萄糖轉運蛋白10 基因、胰島素受體基因、胰島素受體底物-1 基因、脂聯素基因及胰島素降解酶基因等［12-15］。近年來，天然免疫及NK 細胞在1 型糖尿病發病機制中的作用得到廣泛研究［16-18］，而在2 型糖尿病或PTDM 方面的研究甚少。NK 細胞是來源于骨髓的大顆粒淋巴細胞，是天然免疫系統的核心，同時也是獲得性免疫應答重要的調節細胞，在炎癥和免疫反應過程中起重要作用，故NK 細胞數量或功能異常可能參與2 型糖尿病或PTDM 的發生。

KIR 基因定位于人類染色體19q13.4 的白細胞受體復合物中［19］，有著高度多態性，KIR 基因數目在不同NK 細胞克隆和不同個體有差異，其編碼產物KIR 主要表達于NK 細胞及部分T 細胞表面，通過特異性識別靶細胞表面HLA-Ⅰ類分子(HLA-A/B/C，主要為HLA-C)［20］，傳遞活化或抑制信號，從而調節NK 細胞和相應T 細胞的活性，使機體處于不同的免疫應答狀態。關于KIR 與疾病相關性的研究發現，1 型糖尿病、強直性脊柱炎、系統性紅斑狼瘡、硬皮病、銀屑病等自身免疫性疾病和腎癌、乳腺癌、黑色素瘤、肺癌等腫瘤相關性疾病，以及病毒感染等疾病的發生發展均與KIR 基因多態性相關［21-23］。Zuniga 等［5］對95 例患有2 型糖尿病的波多黎各患者進行KIR 基因分型，發現KIR 2DL3/2DL3 純合基因型頻率增加，提示KIR 2DL3 可能為2 型糖尿病的易感基因;此外，研究結果還提示在2 型糖尿病患者中抑制性KIR 受體增加。

本研究結果顯示，PTDM 組患者KIR 2DL2 基因型頻率顯著升高，提示KIR 2DL2 可能為浙江南部地區漢族人群患PTDM 的易感基因。結合Zuniga等的研究，推測NK 細胞及部分T 細胞表面的KIR受體可能是以抑制性受體為主導參與PTDM 的發生，并通過抑制NK 細胞和T 細胞的活性，降低其抗感染和免疫應答的能力，導致免疫調節紊亂，從而促進疾病的發生發展。然而，鑒于佐證文獻過少及本研究樣本量較小，且缺少KIR 配體研究，使結果存在一定誤差，因此在下一步研究中我們需要擴大研究人群的樣本例數并結合KIR 配體進行多層次分析。

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