轉(zhuǎn)酪氨酸激酶C 基因神經(jīng)干細(xì)胞移植對(duì)脊髓損傷后熱休克蛋白的影響

李嘉欣 朱小蘭 周正芳，3 黃煥雷 郭惠明 范瑞新 鄭少憶范小平 陳寄梅 莊建 朱平

心臟大血管手術(shù)并發(fā)的缺血再灌注損傷可引起脊髓損傷，嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致患者術(shù)后輕癱或截癱，是影響手術(shù)預(yù)后的嚴(yán)重問(wèn)題［1］。目前，脊髓損傷仍無(wú)有效的預(yù)防及治療方法，神經(jīng)干細(xì)胞(neural stem cells，NSCs)移植有望恢復(fù)受損脊髓的神經(jīng)功能［2］。然而，一般的NSCs 移植后不僅生存率低，而且會(huì)分化成膠質(zhì)細(xì)胞參與膠質(zhì)瘢痕的形成［3］。因此，有必要改造或調(diào)節(jié)NSCs 在脊髓中的分化和遷移。酪氨酸激酶C(tyrosine kinase C，TrkC)是神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)素-3(neurotrophin-3，NT-3)的高親和力受體［2］，NT-3 與NSCs 的TrkC 受體結(jié)合可促進(jìn)NSCs 分化和遷移［4］。在脊髓缺血再灌注損傷過(guò)程中，應(yīng)激反應(yīng)是主要的損傷機(jī)制［5］，應(yīng)激狀態(tài)刺激熱休克蛋白70(heat shock protein 70，HSP70)快速大量合成與釋放［6］。研究發(fā)現(xiàn)，在應(yīng)激反應(yīng)中，HSP70 有抑制脂質(zhì)氧化、保護(hù)線粒體以及維持蛋白自穩(wěn)等作用，能發(fā)揮抗氧化應(yīng)激的作用［7］。因此，我們通過(guò)將轉(zhuǎn)TrkC 基因NSCs 移植至受損脊髓內(nèi)，觀察HSP70 的濃度改變以及脊髓的病理改變，初步探討轉(zhuǎn)TrkC 基因NSCs移植對(duì)脊髓損傷的作用及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 NSCs 的培養(yǎng)和鑒定

選擇孕14 d Wistar 大鼠(購(gòu)自中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)，所有實(shí)驗(yàn)方案經(jīng)廣東省人民醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)通過(guò)。取出Wistar 大鼠胎腦海馬組織，機(jī)械消化成單細(xì)胞懸液。加入NSCs 全培養(yǎng)液，懸浮培養(yǎng)、傳2 代后使用。為了對(duì)照和區(qū)別本研究真正需要的NSCs，首先在無(wú)血清培養(yǎng)基中觀察細(xì)胞開始分化的時(shí)間、數(shù)量及形態(tài);此后再使用含生長(zhǎng)因子的無(wú)血清培養(yǎng)基，使NSCs 分裂而不分化。NSCs 鑒定:原代培養(yǎng)細(xì)胞均為圓形亮球狀，第3 天開始貼壁分化，細(xì)胞漸漸變?yōu)樗笮危斐鐾黄?第6 天出現(xiàn)大量神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，突起交織成網(wǎng)狀。細(xì)胞共有4 種不同形態(tài):懸浮圓形亮球狀NSCs 樣細(xì)胞;具有1 ～2 個(gè)突起的神經(jīng)元樣細(xì)胞;多個(gè)細(xì)突起且不斷分支的少突膠質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞;多個(gè)粗長(zhǎng)突起的星形膠質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞。含生長(zhǎng)因子培養(yǎng)基中的NSCs 大多為圓形亮球狀，于第3 天可見正在分裂細(xì)胞，并在第4 天可見神經(jīng)球;亦可見有貼壁分化伸出突起的細(xì)胞，但這些細(xì)胞活力漸漸減小，于第5 天完全凋亡。

1.2 轉(zhuǎn)TrkC 基因NSCs 的制備

(1)TrkC 引物設(shè)計(jì)和合成:根據(jù)GenBank TrkC cDNA 全長(zhǎng)序列設(shè)計(jì)合成引物(Invitrogen 公司)，片段長(zhǎng)度249 bp;(2)提取鼠腦總RNA:取0.1 ～0.5 g Wistar 胎鼠腦組織，用Trizol 法(Life Technologies 公司)提取細(xì)胞總RNA，在紫外分光光度計(jì)上測(cè)定230 nm 處吸光度(A)值，并以瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA 完整;(3)用逆轉(zhuǎn)錄PCR 試劑盒(Takara 公司)，將mRNA 逆轉(zhuǎn)率成cDNA，回收目的片段;(4)外源性TrkC cDNA 的連接:將pMD18-T 質(zhì)粒(Takara 公司)和回收目的cDNA 片段用Kpn Ⅰ+Hind Ⅲ(Invitrogen 公司)雙酶切，T4 DNA 連接酶(Invitrogen 公司)連接，獲得pMD18-T-TrkC 質(zhì)粒;(5)轉(zhuǎn)化、擴(kuò)增與提取pMD18-T-Trkc 質(zhì)粒;(6)TrkC基因測(cè)序;(7)pECFP-C1-TrkC 質(zhì)粒的構(gòu)建:同步驟(3);(8)脂質(zhì)體2 000(Invitrogen 公司)/pMD18-TTrkC 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染NSCs;(9)免疫熒光檢測(cè)TrkC 的表達(dá):一抗為兔抗TrkC，二抗為羊抗兔IgM-羅丹明(均購(gòu)自伯信生物科技有限公司)。

1.3 脊髓缺血損傷大鼠模型的建立與分組

90 只清潔級(jí)Wistar 大鼠(購(gòu)自中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)，雌雄不拘，9 周齡，300 ～350 g。實(shí)驗(yàn)在室溫25 ～28 ℃的環(huán)境中進(jìn)行，大鼠以苯巴比妥(40 mg/kg)腹腔注射麻醉后安裝人工呼吸器，切開胸部，在左鎖骨下動(dòng)脈末梢處給降主動(dòng)脈纏膠帶。隨后經(jīng)皮將溫度探頭放置在腰椎椎管內(nèi)，監(jiān)測(cè)脊髓溫度。全身肝素化后，在體外循環(huán)下于左鎖骨下動(dòng)脈末梢處阻斷降主動(dòng)脈，50 min 后解除阻斷，閉合胸部切口，繼續(xù)飼養(yǎng)。整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，持續(xù)監(jiān)測(cè)脊髓溫度和誘發(fā)電位，脊髓溫度逐漸下降提示降主動(dòng)脈阻斷處以下部位的循環(huán)已停滯，脊髓發(fā)生缺血;體感誘發(fā)電位P1 潛伏期和波幅出現(xiàn)明顯變化提示脊髓發(fā)生缺血再灌注損傷。90 只大鼠均建模成功，將大鼠模型隨機(jī)分為3 組(每組30 只):(1)單純阻斷組，只進(jìn)行單純阻斷降主動(dòng)脈;(2)NSCs 移植組，阻斷降主動(dòng)脈術(shù)后1 d 進(jìn)行單純NSCs 移植;(3)TrkC-NSCs 移植組，阻斷降主動(dòng)脈術(shù)后1 d 進(jìn)行轉(zhuǎn)TrkC 基因NSCs 移植。

1.4 NSCs 移植

固定大鼠，自腰、骶椎處做約0.5 ～1.0 cm 皮膚切口，暴露皮下組織，于L5 ～L6 或L6 ～L7 間隙沿下一棘突上方用毛細(xì)穿刺針穿刺，針尖斜向頭端，針體與水平線約呈40°角進(jìn)針約1.5 ～2.0 mm 到達(dá)蛛網(wǎng)膜下腔，仔細(xì)體會(huì)有落空感。用10 μL 的Hamilton 注射器經(jīng)微量注射泵以1.5 μL/min 的注射速度進(jìn)行移植，注射1.5 μL 細(xì)胞懸液，細(xì)胞總數(shù)為2×105個(gè)。注射完畢后保持注射器于原位約1 min，再緩慢退出。單純阻斷組則注射等量等滲NaCl 溶液。

1.5 脊髓組織取材和染色

每組于移植術(shù)后24 h、48 h、72 h、1 周、2 周分別處死3 只大鼠，將其以俯臥位固定于實(shí)驗(yàn)臺(tái)上，背部備皮，依次切開皮膚、皮下組織、肌肉，分離椎旁肌，充分暴露L2 ～L4 段脊椎棘突及椎板。以咬骨剪和咬骨鉗去除棘突及椎板，暴露脊髓組織，以鑷子迅速輕輕取出脊髓組織，分段送檢。采用HE 染色觀察大鼠脊髓組織病理學(xué)改變，采用TUNEL 染色觀察脊髓細(xì)胞凋亡情況，采用Nissl 染色觀察神經(jīng)元尼氏小體變化;染色方法均同參考文獻(xiàn)8。

1.6 ELISA 檢測(cè)HSP70 水平

每組于移植術(shù)后24 h、48 h、72 h、1 周、2 周分別取3 只大鼠割尾靜脈采血，室溫靜置2 h 后離心(3 000 rpm，10 min)分離出血清，置于室溫下充分混勻。根據(jù)大鼠HSP70 ELISA 試劑盒(Enzo Life Sciences公司)說(shuō)明書準(zhǔn)備試劑，按照要求將標(biāo)準(zhǔn)品或待測(cè)樣本加入酶標(biāo)板，并做好標(biāo)記;溫育后加入底物，充分混勻;在室溫下避光反應(yīng)15 min 后，加入終止液，充分混勻;在30 min 內(nèi)使用酶標(biāo)儀(SpectraMax M5，美國(guó)Molecular Devices 公司)在450 nm 處讀取A 值。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 20. 0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(ˉx ±s)表示，組間比較采用單因素方差分析，P ＜0.01 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

術(shù)后5 個(gè)時(shí)間點(diǎn)中，3 組大鼠脊髓組織細(xì)胞形態(tài)在術(shù)后1 周時(shí)差異最為明顯。

2.1 HE 染色結(jié)果

術(shù)后1 周，單純阻斷組可見神經(jīng)細(xì)胞受損、變性、壞死，形態(tài)腫脹，出現(xiàn)空泡化，有核固縮、核溶解現(xiàn)象;NSCs 移植組部分神經(jīng)細(xì)胞腫脹，可見嗜酸性細(xì)胞核，部分細(xì)胞漿呈空泡狀，但不及單純阻斷組嚴(yán)重;TrkC-NSCs 移植組神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)接近正常，染色均勻(見圖1)。

2.2 TUNEL 染色結(jié)果

術(shù)后1 周，單純阻斷組可見廣泛分布的呈棕色顆粒細(xì)胞核的凋亡細(xì)胞，其細(xì)胞質(zhì)減少;NSCs 移植組可見一定量的凋亡細(xì)胞，其細(xì)胞質(zhì)減少;TrkCNSCs 移植組只見散在的凋亡細(xì)胞(見圖2)。

2.3 Nissl 染色結(jié)果

術(shù)后1 周，單純阻斷組可見尼氏小體溶解成沙粒狀，核溶解及空泡現(xiàn)象比較嚴(yán)重;NSCs 移植組可見核溶解現(xiàn)象，但程度較單純阻斷組輕;TrkC-NSCs移植組可見尼氏小體呈塊狀，染色較正常，神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)較完整(見圖3)。

2.4 ELISA 檢測(cè)結(jié)果

3 組大鼠移植術(shù)后HSP70 水平均升高，于術(shù)后72 h 達(dá)到峰值，TrkC-NSCs 移植組各時(shí)間點(diǎn)的HSP70 水平均高于另外兩組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均＜0.01)。詳見表1。

3 討 論

圖1 神經(jīng)干細(xì)胞移植術(shù)后1 周3 組大鼠脊髓組織標(biāo)本HE 染色結(jié)果(×400)

圖2 神經(jīng)干細(xì)胞移植術(shù)后1 周3 組大鼠脊髓組織標(biāo)本TUNEL 染色結(jié)果(×400)

圖3 神經(jīng)干細(xì)胞移植術(shù)后1 周3 組大鼠脊髓組織標(biāo)本Nissl 染色結(jié)果(×400)

表1 NSCs 移植術(shù)后不同時(shí)間點(diǎn)3 組大鼠HSP70 水平(，pg/mL)

表1 NSCs 移植術(shù)后不同時(shí)間點(diǎn)3 組大鼠HSP70 水平(，pg/mL)

注:NSCs. 神經(jīng)干細(xì)胞;TrkC. 酪氨酸激酶C;HSP70. 熱休克蛋白70

在心臟大血管手術(shù)中，阻斷主動(dòng)脈血流導(dǎo)致的脊髓缺血再灌注損傷可引起術(shù)后輕度癱瘓，甚至截癱［9］。及時(shí)預(yù)防并治療脊髓損傷是提高患者預(yù)后的關(guān)鍵。目前已知脊髓缺血再灌注損傷是一個(gè)多因素參與的過(guò)程，包括應(yīng)激反應(yīng)、氧自由基損傷、興奮性氨基酸毒性損傷以及炎癥等［9-11］。熱休克蛋白家族具有調(diào)控細(xì)胞周期、調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、調(diào)節(jié)細(xì)胞存活與凋亡等多種功能［12］。研究發(fā)現(xiàn)，在脊髓缺血再灌注損傷過(guò)程中，尤其是在應(yīng)激反應(yīng)中，HSP70 快速大量釋放，發(fā)揮對(duì)抗氧化應(yīng)激及保護(hù)細(xì)胞的作用［7］。而且，HSP70 在神經(jīng)細(xì)胞及神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中差異表達(dá)，因此可利用HSP70 作為心臟大血管手術(shù)引起的早期缺血及神經(jīng)細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)的標(biāo)志物［6，12］。

NSCs 移植可通過(guò)細(xì)胞替代等機(jī)制治療脊髓損傷［2］。然而，普通的NSCs 移植到受損脊髓內(nèi)不僅存活率低，而且易分化成膠質(zhì)細(xì)胞從而形成瘢痕，不能有效發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用［3］。研究發(fā)現(xiàn)，只需改造NSCs 或調(diào)節(jié)其在脊髓中的分化和遷移，即找到合適的靶點(diǎn)并提供足夠的底物，就有可能恢復(fù)受損的神經(jīng)功能［13-14］。TrkC 受體是NT-3 的高親和力受體［2］。NT-3 通過(guò)與TrkC 受體的胞外區(qū)結(jié)合，將神經(jīng)細(xì)胞存活和分化的信號(hào)傳遞到細(xì)胞內(nèi)部，促進(jìn)NSCs 分化為神經(jīng)細(xì)胞［15］。轉(zhuǎn)TrkC 基因NSCs 能高表達(dá)TrkC 受體，可提高其與內(nèi)源性NT-3 的結(jié)合，從而提高NSCs 在大鼠受損脊髓中的存活率［14］。

本實(shí)驗(yàn)脊髓缺血損傷大鼠術(shù)后1 周脊髓組織病理學(xué)結(jié)果顯示，單純阻斷組脊髓神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)腫脹，大量凋亡，尼氏小體減少;TrkC-NSCs 移植組神經(jīng)細(xì)胞及其細(xì)胞器的形態(tài)最接近正常，凋亡細(xì)胞最少;NSCs 移植組神經(jīng)細(xì)胞及凋亡數(shù)量介于上述兩組之間;提示NSCs 移植有保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞作用，轉(zhuǎn)TrkC基因NSCs 移植的神經(jīng)保護(hù)作用更明顯。ELISA 檢測(cè)結(jié)果顯示，術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)單純阻斷組HSP70 濃度均為3 組中最低，NSCs 移植組HSP70 濃度高于單純阻斷組，TrkC-NSCs 移植組HSP70 水平最高;提示NSCs 移植能促進(jìn)HSP70 釋放，轉(zhuǎn)TrkC 基因NSCs移植促進(jìn)HSP70 釋放的效果更明顯。

綜上所述，NSCs 移植對(duì)脊髓缺血再灌注損傷有保護(hù)作用，轉(zhuǎn)TrkC 基因NSCs 移植的治療效果更佳，可能是通過(guò)替代受損神經(jīng)細(xì)胞，促進(jìn)HSP70 釋放從而減輕應(yīng)激反應(yīng)，繼而起到神經(jīng)保護(hù)的作用。但轉(zhuǎn)TrkC 基因NSCs 移植對(duì)大鼠脊髓保護(hù)的具體機(jī)制仍不清楚，有待進(jìn)一步的研究和探索。

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