根皮素對胃癌細胞SGC-7901凋亡的影響及可能機制

王會，吳漢東，劉政

(遼寧醫學院 食品科學與工程學院，遼寧 錦州 121001)

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根皮素對胃癌細胞SGC-7901凋亡的影響及可能機制

王會，吳漢東，劉政

(遼寧醫學院 食品科學與工程學院，遼寧 錦州 121001)

目的 研究根皮素對胃癌細胞SGC-7901凋亡的影響及可能機制。方法 以人胃癌細胞SGC-7901為研究對象，檢測不同濃度根皮素(40、80、160 mg/L)對細胞的影響，包括細胞形態學分析、細胞活力檢測、流式細胞術檢測細胞凋亡率、細胞周期、線粒體膜電位、細胞內鈣離子濃度的變化。結果 不同濃度根皮素處理細胞24 h后，人胃癌細胞SGC-7901發生凋亡形態改變；不同濃度根皮素對SGC-7901細胞有抑制增殖作用和誘導凋亡作用；能將細胞周期阻滯于G1期；細胞線粒體膜電位降低；細胞內鈣離子濃度增大，呈時間和濃度依賴性。結論 根皮素可通過阻滯細胞周期進程，降低線粒體膜電位，干擾胞內鈣離子穩態來誘導胃癌細胞SGC-7901凋亡。

根皮素；胃癌細胞；細胞凋亡；細胞增殖

根皮素是存在于蘋果、梨等水果及多種蔬菜汁液中的天然活性物質，具有抗氧化、抗腫瘤、抗糖尿病、抗菌以及雌激素樣作用等活性。根皮素能激活蜂窩蛋白激酶，能抑制細胞無序增殖，具有抗誘變功能，可用于多種腫瘤的治療[1-2]。根皮素可通過抑制糖的跨膜運輸來促進小鼠腫瘤B16-4A5細胞凋亡[3]。根皮素可以嵌入 DNA 分子中，干擾 B16 腫瘤細胞 DNA 復制，使細胞中蛋白激酶 C (protein kinase C，PKC)的活性受到抑制，從而促進細胞凋亡[4]。胃癌是常見的消化道惡性腫瘤，具有發病隱匿、早期臨床癥狀不明顯，早期診斷率低等特點, 絕大多數患者一經發現已處于臨床晚期，嚴重威脅患者的生命和健康[5]。迄今為止，胃癌的發病機制并未完全闡明，不能滿足臨床對胃癌實施有效的預防及治療，因此，胃癌的預防及治療仍然是臨床上急需解決的問題。目前關于根皮素誘導胃癌細胞凋亡的研究非常少。本實驗旨在以人胃癌細胞 SGC-7901 為研究對象，探討根皮素對其增殖和凋亡的影響，為胃癌的預防及治療提供實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 材料 人胃癌細胞 SGC-7901 細胞株購于中科院細胞庫提供；根皮素(純度：99.99%；批號：P7912-100MG)；甲基噻唑藍(MTT)、碘化丙啶(PI)、吖啶橙(AO)、溴乙錠(EB)、二甲基亞砜(DMSO)均購自Sigma 公司；RPMI1640培養基和胎牛血清購于GIBCO公司；Annexin V-FITC Apoptosis Detection試劑盒購于BD公司；Caspase酶活性試劑盒購于上海碧云天生物技術有限公司。

1.2 儀器 FC500流式細胞儀(BECKMAN)；TE2000-E激光共聚焦顯微鏡(Nikon)；IX-71倒置相差顯微鏡(Olympus)。

1.3 方法

1.3.1 藥物配制：根皮素用DMSO(終濃度小于0.5%)溶解，再用基礎培養基稀釋成濃度為8 mg/mL的母液，分裝，置-20 ℃冰箱避光保存備用。在實驗中DMSO的終濃度要小于0.1%。

1.3.2 細胞培養：SGC-7901細胞用含10% 標準胎牛血清的RPMI1640培養基，于37 ℃、5% CO2的培養箱培養，當培養液顏色變黃時換液，待細胞呈80%～90% 融合后，作傳代處理。取對數生長期SGC-7901細胞進行實驗。

1.3.3 Hoechst33258染色觀察凋亡細胞核：取滅菌的蓋玻片置于6孔板中，按1.0×106個/mL接種胃癌細胞1 mL。培養24 h后分別用含有40、80、160 mg/L的根皮素處理細胞，同時設立細胞對照組。繼續培養24 h后，輕輕移除上清，用4%多聚甲醛固定細胞，加入5 mg/L的Hoechst33258染色液避光染色5 min，去染色液，滴抗熒光淬滅封片液于載玻片上，將6孔板內玻片取出蓋在載玻片上，在激光共聚焦顯微鏡下觀察并拍照。

1.3.4 MTT檢測細胞活力：取180 μL對數生長期細胞，按1.0×105/mL接種于 96 孔培養板，培養24 h后分別加入40、80、160 mg/L根皮素進行處理，同時設細胞對照組。每組設 8 個重復，繼續培養12、24、36、48 h后每孔加入 20 μL 5 mg/mL MTT(PBS溶解)，繼續培養4 h，棄上清，每孔加入 200 μL DMSO，搖勻，利用酶標儀在490 nm波長處測量OD值。實驗重復3次。

1.3.5 Annexin V-FITC/PI雙染檢測細胞凋亡率：細胞培養和處理同1.3.4。收集各組培養12、24、36、48 h后的細胞，PBS洗滌3次，向沉淀的細胞樣品中加入100 μL PBS懸浮細胞，隨即加入5 μL AnnexinV-FITC和5 μL PI，混勻。避光常溫反應10 min，400目篩網過濾，流式細胞儀檢測各組細胞凋亡情況。實驗重復3次。

1.3.6 細胞周期檢測：細胞培養和處理同1.3.4。收集各組培養12 h后的細胞，調整細胞濃度為1.0～5.0×105個/樣品，加入預冷的70% 無水乙醇，4 ℃ 放置12 h。離心棄乙醇，PBS漂洗1次。加入1 mL PI染液，4 ℃ 避光反應20 min。400目篩網過濾，流式細胞儀檢測各組細胞周期分布情況。實驗重復3次。

1.3.7 線粒體膜電位檢測：細胞培養和處理同1.3.4。收集各組培養12 h后的細胞，調整細胞濃度為1.0×106個/樣品，加入0.5 mL JC-1染色液，在CO2培養箱避光孵育20 min， PBS

洗滌1次，0.5 mL PBS重懸細胞。400目篩網過濾，流式細胞儀檢測各組線粒體膜電位情況。

1.3.8 細胞內鈣離子濃度的測定：細胞培養和處理同1.3.4。收集各組培養12 h后的細胞，調整細胞濃度至(1～2)×106個/mL。加入Fluo-3/Am至終濃度為8 μM，置5% CO2，37 ℃培養箱避光孵育30 min，期間振蕩3次，并設置陰性對照(不加Fluo-3/Am)。離心，去掉多余染料，用無鈣緩沖液PBS洗滌2次，無鈣PBS重懸至0.5 mL，流式細胞儀上機檢測。

2 結果

2.1 Hoechst33258染色觀察凋亡細胞核 對照組細胞核呈卵圓形，染色質均勻著色，分布于整個細胞核，熒光強度較強。根皮素各濃度處理組細胞染色質凝聚、斷裂，呈點狀，著色不均勻呈亮點狀。見圖1。

圖1 各濃度根皮素處理SGC-7901 24 h后的Hoechst33258 染色結果(×100)Fig.1 Morphology of SGC-7901 cells after 24 h treatment by phloretin stained by Hoechst33258(×100)

2.2 細胞活力檢測 MTT檢測結果顯示：根皮素處理 SGC-7901細胞 12、24、36、48 h后，隨著根皮素濃度的增大活細胞數量逐漸降低，呈現量效和時效關系。

表1 根皮素對SGC-7901細胞生長的影響Tab.1 Inhibition effect of phloretin on SGC-7901 ±s, n=8)

*P<0.05，**P<0.01，與對照組比較，compared with control group

2.3 各組細胞凋亡率測定結果 流式檢測結果顯示：隨著根皮素作用時間的延長和濃度的增大，細胞凋亡逐漸增多，且呈時間依賴性和濃度依賴性。見表2、圖2。

組別細胞凋亡率(%)12h24h36h48h對照組3.20±0.885.71±1.258.11±1.579.56±1.49根皮素40mg/L4.23±1.38*9.30±1.39**20.15±1.46**27.00±1.43**根皮素80mg/L6.49±1.53**21.66±2.24**31.20±2.49**30.38±3.59**根皮素160mg/L11.53±1.67**27.33±3.42**35.99±3.29**41.23±3.19**

*P<0.05，**P<0.01，與對照組比較， compared with control group

圖2 根皮素SGC-7901細胞凋亡的影響(n=3) Fig.2 Apoptosis rate of SGC-7901 after treatment by phloretin(n=3)

2.4 各組細胞周期檢測結果 根皮素處理細胞24 h后，隨著根皮素濃度的增大，G1期細胞數百分比增大，S期細胞百分比下降，G2期細胞百分比下降，表明細胞經根皮素處理后增殖停滯在G1期，細胞的DNA合成受到阻滯，且隨著根皮素劑量的增加而愈加明顯，呈現劑量依賴性。見表3。

表3 根皮素對SGC-7901細胞周期的影響Tab.1 Cell cycle of SGC-7901 cells treatment by phloretin ±s，%, n=3)

*P<0.05，**P<0.01，與對照組比較， compared with control group

2.5 細胞線粒體膜電位的檢測 采用JC-1標記流式細胞儀檢測線粒體膜電位變化，結果表明經不同濃度根皮素作用24 h后的SGC-7901細胞的線粒體膜電位下降，與對照組比較，差異均有統計學意義(P<0.01)。見圖3。

圖3 根皮素對SGC-7901細胞線粒體膜電位變化情況**P<0.01，與對照組比較Fig.3 Mitochondrial membrane potential of SGC-7901 cells after 24 h treatment by phloretin**P<0.01,compared with control group

2.6 細胞內鈣離子濃度的測定 由結果可知：隨根皮素濃度增大，細胞內Ca2+濃度逐漸升高，與對照組相比，差異均有統計學意義(P<0.01)。見圖4。

圖4 根皮素對SGC-7901細胞胞內Ca 2+濃度的影響*P<0.05，**P<0.01，與對照組比較Fig.4 Concentrations of intracellular calcium of SGC-7901 cells after 24 htreatment by phloretin*P<0.05,**P<0.01,compared with control group

3 討論

根皮素是一種具有治療腫瘤功能的多酚類天然化合物，可抑制腫瘤細胞生長, 誘導腫瘤細胞凋亡[6]。根皮素能夠通過抑制Ⅱ型葡萄糖轉運蛋白來誘導肝癌細胞凋亡[7]。根皮素能通過線粒體途徑誘導肝癌細胞 BEL-7402凋亡，還可通過干預與肝癌細胞侵襲力密切相關的細胞粘附、運動及侵襲等作用抑制腫瘤細胞轉移潛能[8-9]。

研究認為腫瘤是一種細胞周期性疾病，細胞無限增殖，周期失控導致細胞惡性轉化和腫瘤形成[10]。根皮素分子結構中具有 4 個羥基，與葡萄糖結構相似，與葡萄糖運輸形成非競爭性抑制，抑制能量來源，促使細胞發生凋亡。根皮素為芳香環結構，可插入到 DNA雙螺旋分子中，從而阻止 DNA 合成，影響細胞周期的分布，誘導細胞發生凋亡。

本研究結果表明，經根皮素作用的SGC-7901細胞發生了G1期阻滯，且細胞增殖被抑制。隨著根皮素濃度的增加，G1期細胞增加，S期細胞減少，呈現濃度依賴性關系。推測根皮素通過影響細胞周期的分布促凋亡作用，這為開展根皮素誘導胃癌細胞凋亡機理的研究提供了實驗依據。

細胞凋亡與線粒體密切相關，線粒體在細胞凋亡的過程中起著重要作用，多種細胞凋亡因素可誘導細胞發生凋亡，在受到凋亡誘導后膜通透性增大，跨膜電位下降，這些是細胞凋亡級聯反應過程中最早發生的事件，它發生在細胞核凋亡特征出現之前。利用流式細胞儀檢測線粒體膜電位的變化，其機制為線粒體存在內負外正膜電位。根皮素是一種解偶聯試劑，可以抑制線粒體的氧化磷酸化作用[11]，ATP合成受阻，能量缺乏，促使細胞凋亡。本實驗采用 JC-1標記結合流式細胞儀檢測線粒體膜電位變化，發現經根皮素作用后的 SGC-7901細胞，線粒體膜電位降低。推測根皮素誘導SGC-7901凋亡與細胞凋亡線粒體途徑有關。

在正常細胞中，Ca2+主要與蛋白質結合封存在內質網和線粒體中，游離的 Ca2+很少，只是在收到外界刺激時才被釋放出來充當信號分子。游離 Ca2+在細胞內的過度積累可以直接導致細胞凋亡的發生[12]。當根皮素誘導SGC-7901細胞凋亡時，細胞質內游離鈣離子濃度升高，Ca2+穩態發生變化。結合線粒體膜電位降低的結果推測與內質網上鈣離子的釋放有關，但其具體的機制有待進一步的研究。

根皮素通過抑制細胞DNA合成，降低線粒體膜和干擾鈣離子穩態來誘導 胃癌細胞SGC-7901細胞凋亡。根皮素誘導肝癌細胞凋亡及其機制有待進一步探討。

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(編校：譚玲)

Effects of proliferation and apoptosis of phloretin on human gastric cancer cells SGC-7901

WANG Hui, WU Han-dong, LIU Zheng

(College of Food Science and Engineering, Liaoning Medical University, Jinzhou 121001, China)

ObjectiveTo investigate the proliferative and apoptotic effects of phloretin on gastric cancer cell andthe possible mechanisms.MethodsSGC-7901 were treated with different concentrations of phloretin(40,80,160 mg/L), and the cell morphological alterations were detected by using Hoechst33258 staining, cell activity were detected by MTT assay, cell apoptosis, cell cycle progression, mitochondrial trans-membrane potential and intracellular calcium homeostasis were detected by flow cytometry.ResultsAfter treated with different concentrations of phloretin at different times, SGC-7901 cell showed morphological alterations. Phloretin could inhibite the proliferation of SGC-7901 cell line, and induced its apoptosis in a dosage and duration dependent manner. Cell cycle was arrested at G1 phase, mitochondrial trans-membrane potential dropped, intracellular free Ca2+increased.Conclusionphloretin can induce apoptosis of SGC-7901 via arresting cell cycle progression, reducing mitochondrial trans-membrane potential and disturbing intracellular calcium homeostasis.

phloretin; gastric cancer cell; apoptosis; proliferation

王會，男，博士，講師，研究方向：細胞凋亡，E-mail: yxlwhx077@163.com。

R735.7

A

1005-1678(2015)08-0034-04