Zn(PMFPCl)2對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞的抑制作用及其機(jī)制

趙成亮，宋有鑫，趙龍，張四喜，李連泰

(1.承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 骨六科，河北 承德 067000；2.吉林大學(xué)第一醫(yī)院 藥劑科，吉林 長春 130021；3.承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 骨傷科，河北 承德 067000)

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Zn(PMFPCl)2對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞的抑制作用及其機(jī)制

趙成亮1，宋有鑫1，趙龍1，張四喜2，李連泰3Δ

(1.承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 骨六科，河北 承德 067000；2.吉林大學(xué)第一醫(yī)院 藥劑科，吉林 長春 130021；3.承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 骨傷科，河北 承德 067000)

目的 探究Zn(PMFPCl)2對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞的抑制作用及其機(jī)制。方法 HepG2細(xì)胞分組為對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)組(10、30、70 μmol/L)。MTT法檢測Zn(PMFPCl)2對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞增殖的影響，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期，倒置顯微鏡下觀察Zn(PMFPCl)2作用后腫瘤細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化，Western blot檢測凋亡蛋白p53、p21、caspase-3、bax、bcl-2的表達(dá)情況。結(jié)果 各實(shí)驗(yàn)組(10、30、70 μmol/L)在24、48、72 h對(duì)細(xì)胞的抑制率均顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。當(dāng)Zn(PMFPCl)2濃度70 μmol/L，作用72 h時(shí)細(xì)胞的抑制率最高，達(dá)63.29%。各實(shí)驗(yàn)組在48 h時(shí)的細(xì)胞凋亡率顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。Zn(PMFPCl)2使細(xì)胞的生長停滯在G1期，阻礙細(xì)胞增殖。當(dāng)Zn(PMFPCl)2作用細(xì)胞后貼壁細(xì)胞數(shù)量減少，細(xì)胞皺縮，細(xì)胞膜出現(xiàn)突起，細(xì)胞變圓、變亮。Western blot法檢測p53、p21、caspase-3、bax隨配合物濃度的增加而增加，而bcl-2隨之減少(P<0.05)。結(jié)論 Zn(PMFPCl)2對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞具有抑制增殖及促進(jìn)凋亡的作用，其機(jī)制與促進(jìn)p53、p21、caspase-3、bax表達(dá)而降低bcl-2表達(dá)有關(guān)。

Zn(PMFPCl)2；HepG2細(xì)胞；增殖；細(xì)胞周期；凋亡相關(guān)蛋白

過渡金屬配合物作為一種重要的DNA靶向化合物，其抗腫瘤、抗菌等作用逐漸被人們發(fā)覺，并希望其能代替鉑成為殺傷腫瘤的一大利器。銅配合物具有極強(qiáng)的生物活性及多樣的結(jié)構(gòu)，之后的研究也證實(shí)了銅配合物能夠抑制有絲分裂進(jìn)而抑制細(xì)胞增殖[1-3]。但相比之下同樣作為過渡金屬的鋅，其配合物的研究卻較少。Zhong等[4]發(fā)現(xiàn)了一種席夫堿的鋅配合物對(duì)腫瘤細(xì)胞具有一定程度的抑制作用。本實(shí)驗(yàn)中同樣合成一種二-(1-對(duì)甲苯基-3-甲基-4-呋喃甲酰基吡唑啉酮-5縮對(duì)甲苯胺)合鋅(II)[Zn(PMFPCl)2]，并對(duì)其抗腫瘤活性及機(jī)制進(jìn)行了探討。為證明鋅配合物具有抗腫瘤特性提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 細(xì)胞株：肝癌HepG2細(xì)胞由吉林大學(xué)微生物實(shí)驗(yàn)室提供。

主要試劑：胎牛血清、DMEM高糖培養(yǎng)基、青鏈霉素、PBS、RPMI-1640培養(yǎng)液(Hyclone)；DMSO(上海生工生物工程公司)；噻唑藍(lán)(Amersco)；PI染色試劑盒、FITC/PI細(xì)胞凋亡試劑盒(上海貝博生物)。

主要儀器：微孔濾器(Millipore)；96孔培養(yǎng)板(Coring)；CO2培養(yǎng)箱(Forma)；680型酶標(biāo)儀(Bio-Rad)；FaCS CantoTM II system流式細(xì)胞儀(Becton-Dickinson Bioscience)。倒置顯微鏡IX71(OLYMPUS)；RNApure高純總RNA快速提取試劑盒(北京BioTeke生物技術(shù)有限公司)；辣根過氧化物酶標(biāo)記p53、p21、caspase-3、bcl-2、bax和β-actin鼠抗IgG、辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗小鼠二抗(江蘇碧云天生物技術(shù)有限公司)；BCA法蛋白質(zhì)定量測定試劑盒、SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液(江蘇碧云天生物技術(shù)有限公司)；垂直電泳裝置及轉(zhuǎn)膜裝置(Bio-rad)。

Zn(PMFPCl)2的制備：本實(shí)驗(yàn)中使用的Zn(PMFPCl)2由張恒強(qiáng)博士惠贈(zèng)，其結(jié)構(gòu)式見圖1。

圖1 Zn(PMFPCl)2結(jié)構(gòu)式Fig.1 The chemical structural formula of Zn(PMFPCl)2

細(xì)胞培養(yǎng)：將HepG2肝癌細(xì)胞懸浮于含有10%滅活胎牛血清的無菌RPMI1640培養(yǎng)液中，再將細(xì)胞株裝于5 cm×5 cm懸浮細(xì)胞培養(yǎng)瓶中。置于37 ℃、5%CO2及100%飽和濕度的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每48～72 h更換一次培養(yǎng)液。

1.2 檢測指標(biāo)

1.2.1 MTT法檢測Zn(PMFPCl)2對(duì)HepG2肝癌細(xì)胞增殖

的影響：使用胰蛋白酶消化處于對(duì)數(shù)生長期的HepG2肝癌細(xì)胞，使其成為細(xì)胞懸液。將細(xì)胞接種于96孔板中，確保每孔細(xì)胞數(shù)為4×105個(gè)；再加入濃度為10、30、70 μmol/L的Zn(PMFPCl)2為各實(shí)驗(yàn)組，對(duì)照組中為0.1%DMSO，設(shè)置5個(gè)復(fù)孔；相互作用24、48、72 h后加入MTT試劑(5 mg/ml，20 μL)，37 ℃，5%CO2條件下培養(yǎng)4 h。加入DMSO溶解后，酶標(biāo)儀上測定A570，同時(shí)設(shè)置空白孔。計(jì)算細(xì)胞抑制率(%)=1-實(shí)驗(yàn)孔A值/對(duì)照孔A值。

1.2.2 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期和凋亡：將上述各組細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶中，待隔夜細(xì)胞貼壁并呈指數(shù)生長時(shí)更換含藥物Zn(PMFPCl)210、30、70 μmol/L的培養(yǎng)液，并同時(shí)設(shè)置對(duì)照組，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。作用48 h后，收集細(xì)胞，常溫1000 r/min離心5 min，棄去培養(yǎng)液，使用預(yù)冷PBS重懸細(xì)胞后再次按上述條件離心，重復(fù)2次。將收集細(xì)胞用預(yù)冷的75%乙醇固定。再次離心后棄去固定液，用PBS洗滌2次。加入200 μL PI，置于4 ℃環(huán)境25 min。使用400目篩網(wǎng)過濾1次后使用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡及周期。

1.2.3 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察：將上述各組細(xì)胞置于37 ℃，5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，利用倒置顯微鏡(×200)觀察細(xì)胞形態(tài)并拍照。

1.2.4 Zn(PMFPCl)2對(duì)凋亡蛋白的影響：細(xì)胞分組及培養(yǎng)如1.2.1，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，一抗目的蛋白按1:1000，內(nèi)參按 1:2000 比例稀釋，4 ℃孵育過夜，二抗按1:1000，內(nèi)參按1:2000比例稀釋，室溫?fù)u床孵育膜1 h。參照張小年[5]的方法利用Western blot檢測Zn(PMFPCl)2對(duì)HepG2肝癌細(xì)胞中p53、p21、caspase-3、bcl-2、bax 5種凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)情況的影響。

2 結(jié)果

2.1 Zn(PMFPCl)2對(duì)HepG2肝癌細(xì)胞增殖的影響 細(xì)胞抑制率隨Zn(PMFPCl)2濃度增加而逐漸增加，同時(shí)相同濃度 Zn(PMFPCl)2， 隨作用時(shí)間的延長，對(duì)細(xì)胞的抑制率也逐漸增強(qiáng)。各實(shí)驗(yàn)組對(duì)細(xì)胞的抑制率均顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。當(dāng) Zn(PMFPCl)2濃度70 μmol/L，作用72 h時(shí)細(xì)胞的抑制率最高，達(dá)63.29%。見表1。

表1 MTT法觀察Zn(PMFPCl)2對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞增殖的影響

*P<0.05，與對(duì)照組比較，compared with control group

2.2 流式細(xì)胞儀檢測Zn(PMFPCl)2對(duì)細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期的影響

2.2.1 Zn(PMFPCl)2對(duì)細(xì)胞凋亡的影響：流式細(xì)胞儀檢測Zn(PMFPCl)2作用肝癌HepG2細(xì)胞48h后的凋亡情況。對(duì)照組與各實(shí)驗(yàn)組(10、30、70 μmol/L)的凋亡率分別為(12.63±1.18)%、(17.65±1.44)%、(29.36±1.33)%、(70.13±1.29)%，各實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖2。

圖2 流式細(xì)胞儀檢測Zn(PMFPCl)2對(duì)細(xì)胞凋亡的影響(n=3)*P<0.05，與對(duì)照組比較Fig.2 Effect of Zn(PMFPCl)2 on cell apoptosis by flow cytometry instrument(n=3)*P<0.05，compared with control group

2.2.2 Zn(PMFPCl)2對(duì)細(xì)胞周期的影響：流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示，當(dāng)Zn(PMFPCl)2濃度逐漸增加時(shí)，各組處于G1期的細(xì)胞所占百分比逐漸增加，S期細(xì)胞百分比明顯減少，而G2期細(xì)胞百分比變化卻不明顯。故Zn(PMFPCl)2使肝癌HepG2細(xì)胞的生長停滯在G1期，使細(xì)胞周期由G1期向S期的移行受到阻滯，細(xì)胞生長速率也因此降低。見圖3、表2。

圖3 流式細(xì)胞儀檢測Zn(PMFPCl)2對(duì)細(xì)胞周期的影響Fig.3 Effect of Zn(PMFPCl)2 on cell cycle by flow cytometry 表2 Zn(PMFPCl)2對(duì)細(xì)胞周期的影響結(jié)果Tab.

組別細(xì)胞周期G1SG2對(duì)照組1.27±0.2694.50±1.654.23±0.9210μmol/L20.35±1.1158.85±1.5520.80±1.3630μmol/L43.71±3.1742.18±2.7614.11±1.6770μmol/L72.69±2.1512.47±1.5914.84±1.42

2.3 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果 不同濃度Zn(PMFPCl)2作用肝癌HepG2細(xì)胞48 h后細(xì)胞生長的形態(tài)變化，見圖4。對(duì)照組細(xì)胞貼壁良好，細(xì)胞邊緣清晰，能夠融合聚集。當(dāng)Zn(PMFPCl)2作用細(xì)胞后貼壁細(xì)胞數(shù)量減少，細(xì)胞皺縮，細(xì)胞膜出現(xiàn)突起，細(xì)胞變圓、變亮。上述現(xiàn)象隨Zn(PMFPCl)2濃度的增加而逐漸變得明顯。

圖4 倒置顯微鏡觀察Zn(PMFPCl)2對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞形態(tài)的影響(×200)Fig.4 Effect of Zn(PMFPCl)2 on morphology of HepG2 cellsobserved by inverted microscope(×200)

2.4 Zn(PMFPCl)2對(duì)凋亡蛋白的影響 不同濃度 Zn(PMFPCl)2作用于肝癌HepG2細(xì)胞后凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)情況。在p53的表達(dá)中，30 μmol/L(9.53±0.47)和70 μmol/L組(21.72±1.53)與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。在p21的表達(dá)中僅有70 μmol/L組(15.28±0.91)與對(duì)照組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。在Caspase-3中10 μmol/L組(6.31±0.71)、30 μmol/L組(13.27±2.39)、70 μmol/L組(17.66±1.46)與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。在bax中10 μmol/L(6.08±0.35)、30 μmol/L(10.00±0.61)、70 μmol/L組(17.5±1.79)與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。且上述各組隨濃度增加蛋白表達(dá)增加。在bcl-2中30 μmol/L(2.01±0.10)和70 μmol/L組(1.39±0.22)與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，表達(dá)量隨濃度增加而減少。見圖5。

圖5 Western blot檢測Zn(PMFPCl)2對(duì)凋亡蛋白p53、p21、caspase-3、bax、bcl-2表達(dá)的影響(n=3)*P<0.05，與對(duì)照組比較Fig.5 Effects of Zn(PMFPCl)2 on expression of apoptosis proteins of p53, p21, caspase-3, bax and bcl-2 in HepG2 cells by Western blot(n=3)*P<0.05，compared with control group

3 討論

過渡金屬配合物能夠抑制腫瘤細(xì)胞已經(jīng)成為其倍受關(guān)注的特性。近期以來發(fā)現(xiàn)大量銅、釕等過渡金屬配合物具有抗腫瘤的作用[6-7]。但是關(guān)于鋅配合物抗腫瘤作用的報(bào)道極少。本實(shí)驗(yàn)中合成一種配合物Zn(PMFPCl)2，經(jīng)MTT及流式細(xì)胞儀檢測發(fā)現(xiàn)其具有促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用。并且存在劑量依賴性，當(dāng)濃度為70 μmol/L時(shí)其抑制率最高達(dá)63.29%。流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)其能阻滯腫瘤細(xì)胞停留于G1期。

關(guān)于細(xì)胞凋亡往往由多種凋亡蛋白及基因決定。P53能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞周期，使細(xì)胞生長停滯在G1期，同時(shí)修復(fù)受損DNA，若DNA無法修復(fù)則啟動(dòng)細(xì)胞凋亡[8]。P21位于p53下游與p53共同構(gòu)成細(xì)胞周期檢查站，通過降低增殖細(xì)胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)活化DNA聚合酶能力抑制DNA的合成，進(jìn)而減少受損DNA的復(fù)制及積累[9]。Bax是促進(jìn)凋亡的蛋白與bcl-2形成異二聚體后降低bcl-2對(duì)細(xì)胞的凋亡，而bcl-2與其作用相反，通過抑制bax進(jìn)一步抑制細(xì)胞色素C對(duì)caspase串聯(lián)通路的活化途徑保護(hù)細(xì)胞[10-11]。本實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)Zn(PMFPCl)2能使p53、p21、caspase-3、bax促進(jìn)細(xì)胞凋亡的蛋白表達(dá)增加，而bcl-2抑制細(xì)胞凋亡的蛋白減少。從而在機(jī)制上揭示了Zn(PMFPCl)2具有抗腫瘤的作用。

[1] Gandin V,Pellei M,Tisato F,et al.A novel copper complex induces paraptosis in colon cancer cells via the activation of ER stress signalling[J].J Cell Mol Med,2012,16(1):142-151.

[2] Palanimuthu D, Shinde SV, Somasundaram K,et al.In Vitro and in Vivo Anticancer Activity of Copper Bis(thiosemicarbazone) Complexes[J].J Med Chem,2013,56(3):722-734.

[3] Tardito S,Barilli A,Bassanetti I,et al.Copper-Dependent Cytotoxicity of 8-Hydroxyquinoline Derivatives Correlates with Their Hydrophobicity and Does Not Require Caspase Activation[J].J Med Chem,2012,55(23):10448-10459.

[4] Zhong X, Yi J, Sun J, et al.Synthesis and crystal structure of some transition metal complexes with a novel bis-Schiff base ligand and their antitumor activities[J].Eur J Med Chem,2006,41(9):1090-1092.

[5] 張小年.釕配合物抗腫瘤活性及其誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制[M].廣州：暨南大學(xué)，2011.

[6] Bergamo A,Sava G.Ruthenium complexes can target determinants for tumor malignancys [J].Dalton Trans,2007(13):1267-1272.

[7] Das S,Sinha S,Britto R,et al.Cytotoxicity of half sandwich ruthenium(II) complexes with strong hydrogen bond acceptor ligands and their mechanism of Action [J].J Inorg Biochem,2010, 104(2):93-104.

[8] Hock AK, Vousden KH.The role of ubiquitin modification in the regulation of p53 [J].Biochim Biophys Acta,2014,1843(1):137-149.

[9] Wang Y, Fisher JC, Mathew R, et al.Intrinsic disorder mediates the diverse regulatory functions of the Cdk inhibitor p21 [J].Nat Chem Biol,2011,7(4):214-221.

[10] Coultas L, Strasser A.The role of the Bcl-2 protein family in cancer[J].Semin Cancer Biol,2003,13(2):115-123.

[11] Adams JM, Cory S.Bcl-2-regulated apoptosis: mechanism and therapeutic potential [J].Curr Opin Immunol,2007,19(5):488-496.

(編校：王儼儼)

Inhibition of Zn(PMFPCl)2on HepG2 cells and its mechanism

ZHAO Cheng-liang1, SONG You-xin1, ZHAO Long1, ZHANG Si-xi2, LI Lian-tai3Δ

(1.The Sixth Department of Orthopedics, The Affiliated Hospital of Chengde Medical College, Chengde 067000, China; 2.Department of Pharmacy, The First Hospital of Jilin University, Changchun 130021, China; 3.Department of Bone Traumatology, The Affiliated Hospital of Chengde Medical College, Chengde 067000, China)

ObjectiveTo explore the inhibition of Zn(PMFPCl)2on HepG2 cells and its mechanism.MethodsThe HepG2 cells were divided into control group and experimental group of 10, 30 and 70 μmol/L.The cell proliferation was detected by MTT assay, cell apoptosis and cell cycle was analysed by flow cytometry, cellular morphological change was observed with inverted microscope and the expressions of apoptosis-regulated proteins of p53, p21, caspase-3, bax and bcl-2 in HepG2 cells were detected by Western blot.ResultsThe inhibitory rates of experimental groups (10, 30, 70 μmol/L) at 24, 48 and 72h were significantly higher than those of control group (P<0.05), and the highest one was 63.29% of 70 μmol/L Zn(PMFPCl)2at 72 h.The apoptosis rates of each experimental group at 48h was significantly higher than that of control group (P<0.05).The cells were induced a remarkable G1 arrest by Zn(PMFPCl)2which could inhibit proliferation.The number of adherent cells reduced and cells shrank, convex on cytomembrane surface appeared and the cells changed to round and were brighter.Western blot results showed that the protein levels of p53, p21, caspase-3 and bax increased and bcl-2 decreased with the Zn(PMFPCl)2concentration increasing (P<0.05).ConclusionZn(PMFPCl)2could inhibit the proliferation and promote apoptosis of HepG2 cells whose mechanisms are promotation of p53, p21, caspase-3 and bax expressions and inhibition of bcl-2 expression.

Zn(PMFPCl)2; HepG2 cells; proliferation; cell cycle; apoptosis-regulated proteins

河北省衛(wèi)生廳科研基金項(xiàng)目(ZL20140116)；吳階平醫(yī)學(xué)基金會(huì)臨床科研專項(xiàng)基金(320.6750.14119)

趙成亮，男，主治醫(yī)師，研究方向：腫瘤及藥物化學(xué)，E-mail：38221965@qq.com；李連泰，通信作者，男，碩士，副主任醫(yī)師，研究方向：脊柱腫瘤，E-mail：liliantai369@163.com。

R735.7

A

1005-1678(2015)10-0011-04