冬凌草對酒精性肝損傷模型大鼠炎性因子及肝功能的影響

宋琪雯，劉智，孫為民，譚蓉，黃勇

(1.貴州醫科大學 藥劑教研室，貴州 貴陽 550004；2.貴州醫科大學附屬醫院 藥劑科，貴州 貴陽 550004；3.貴州醫科大學 制劑工程教研室，貴州 貴陽 550004)

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冬凌草對酒精性肝損傷模型大鼠炎性因子及肝功能的影響

宋琪雯1，劉智2，孫為民2，譚蓉2，黃勇3Δ

(1.貴州醫科大學 藥劑教研室，貴州 貴陽 550004；2.貴州醫科大學附屬醫院 藥劑科，貴州 貴陽 550004；3.貴州醫科大學 制劑工程教研室，貴州 貴陽 550004)

目的 研究冬凌草對酒精性肝損傷模型大鼠炎性因子及肝功能的影響。方法 選擇SD大鼠120只，隨機分為對照組、模型組以及治療組，各40只，采用酒精灌胃的方式建立酒精性肝損傷模型，給予冬凌草治療。采用電化學發光法檢測血清中AST、ALT、α-GST、GLDH含量，熒光定量PCR檢測肝臟組織中NF-κB、TNF-α、IL-6、IL-8的含量。結果 模型組大鼠血清中AST、ALT、α-GST、GLDH含量及肝臟組織中NF-κB、TNF-α、IL-6、IL-8的含量均顯著高于對照組(t=12.030～37.417，P<0.05)；治療組大鼠血清中AST、ALT、α-GST、GLDH含量及肝臟組織中NF-κB、TNF-α、IL-6、IL-8的含量均顯著低于模型組(t=5.128～32.325，P<0.05)。結論 酒精灌胃能夠造成肝損傷，冬凌草治療有助于減輕肝損傷，緩解炎癥反應。

酒精性肝損傷；冬凌草；轉氨酶；炎性因子

酒精性肝損傷是因長期大量飲酒所致肝臟損傷性疾病，近年來的發病率不斷升高，已經成為僅次于病毒性肝炎的第二大肝病類型[1]。酒精攝入過量是造成酒精性肝損傷的主要原因，采用酒精灌胃的方式能夠模擬酒精性肝損傷的疾病特征。根據相關研究，對酒精性肝損傷發生機制的認識，炎癥反應增強、炎性因子大量產生是造成肝損傷的重要環節[2]。因此，在臨床實踐中，治療酒精性肝損傷的最主要思路是保護肝細胞免受炎癥反應的損傷。冬凌草Rabdosiarubescens(Hemsl.)Hara 是唇型科茶菜屬植物，具有清熱解毒、抗腫瘤、保肝降酶的作用，國內外學者在這方向的文獻報道較多[3-4]。本研究采用冬凌草來治療酒精性肝損傷大鼠，旨在從肝功能指標以及炎性因子含量進行分析，初步探討其作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物：成年SD雄性大鼠120只購自貴州醫科大學(合格證號131210)，平均體質量(224.65±32.14)g，按照常規光照、飲水、飼料條件飼養在本院動物房。將其隨機分為對照組、模型組以及治療組，每組40只。本研究取得實驗動物倫理委員會批準，動物實驗嚴格遵照《實驗動物保護條例》。

1.1.2 藥材：冬凌草購自貴陽市藥材公司，經貴州醫科大學藥劑教研室宋琪雯鑒定為唇型科茶菜屬植物Rabdosiarubescens(Hemsl.)Hara。

1.1.3 藥品與試劑：Trizol總RNA提取試劑、RT-PCR試劑盒均購自大連定生物技術有限公司；甘草酸二銨膠囊購自正大天睛藥業股份有限公司(批號141015)；四氯化碳購自北京化工石(批號141010)；谷丙轉氨酶、超氧化物歧化酶、丙二醛均購自南京建成生物工程研究所(批號141015)。其他試劑均為分析純。

1.1.4 實驗儀器：全自動生化分析儀購自美國Abbortt Arrosset公司；紫外可見分光光度計購自上海科學精密儀器有限公司(UV-754)。

1.2 方法

1.2.1 冬凌草提取物制備：參照閻納新等[5]文獻資料制備，取冬凌草全草2 kg，采用95%工業乙醇回流提取，將提取液合并減壓濃縮，置于丙酮中溶解，用醋酸乙酯萃取2次，濃縮干燥獲取冬凌草粉末49.3 g，采用HPLC法檢測冬凌草甲素含量，用0.5%CMC-Na溶液制備冬凌草提取液。

1.2.2 酒精性肝損傷模型制作方法：采用56%二鍋頭灌胃的方式制作酒精性肝損傷模型，模型組和治療組大鼠均給予二鍋頭灌胃，參照姚會枝等[6]文獻資料：第一周劑量為8 mL/kg，而后每周增加1 mL/kg，最高劑量15 mL/kg，連續灌胃8周。對照組大鼠同期給予相同體積的生理鹽水灌胃。

1.2.3 治療方法：用0.5%CMC-Na溶液將冬凌草提取物稀釋為4.0 g/(kg·d)濃度的溶液， 治療組在灌胃前給予冬凌草提取物溶液4.0 g/(kg·d)灌胃。

1.2.4 血清肝酶指標：模型建立和藥物治療后1周、2周、3周和4周時，每組大鼠各取10只，采用脫頸椎方法處死大鼠后取血2 mL，3 000 r/min離心10 min，收集上層血清，采用電化學發光法檢測血清丙氨酸氨基轉移酶(alanine aminotransferase， ALT)、天門冬氨酸氨基轉移酶(aspartate aminotransferase， AST)含量，采用酶聯免疫吸附試劑盒檢測人α谷胱甘肽S轉移酶(α-glutathione S-transferase， α-GST)、谷氨酸脫氫酶(glutamate dehydrogenase， GLDH)含量。

1.2.5 肝臟組織炎性因子含量：模型建立和藥物治療后4周，處死大鼠，采集肝臟標本100 mg至EP管，加入Trizol液1 mL剪碎-混勻靜置5 min-加0.2 mL氯仿-4 ℃冰箱靜置10 min-3 000 r/min離心10 min-取清液至EP管-加異丙醇-混勻靜置10 min-3 000 r/min離心10 min-棄上清液-加75%冰乙醇洗滌-3 000 r/min離心10 min-棄上清液-加純凈水溶解。

RT-PCR反轉錄：反應條件：42 ℃ 20 min，95 ℃ 5 min， 5 ℃ 5 min；聚合酶反應：5×PCR Buffer 10 μL， Takara Ex Taq HS 0.25 μL；上游PCR與下游PCR引物均為0.5 μL，滅菌蒸餾水28.65 μL，加入反轉錄反應液10 μL。反應條件：94 ℃ 2 min， 94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min， 共35個循環。檢測NF-κB、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白細胞介素-6 (interleukin-6，IL-6)、白細胞介素-8(interleukin-6，IL-8)的mRNA含量。

2 結果

2.1 肝功能指標 模型建立后1周、2周、3周和4周時，模型組大鼠血清中AST、ALT、α-GST、GLDH含量均顯著高于對照組(P<0.05)；治療后1周、2周、3周和4周時，治療組大鼠血清中AST、ALT、α-GST、GLDH含量均顯著低于模型組(P<0.05)。見表1。

表1 3組大鼠血清中肝損傷ALT、AST指標比較

*P<0.05，與對照組比較，compared with control group；#P<0.05，與模型組比較，compared with model group

2.2 肝臟組織中炎性因子含量 模型建立后4周時，模型組大鼠肝臟組織中NF-κB、TNF-α、IL-6、IL-8的mRNA含量均顯著高于對照組(P<0.05)；治療后4周時，治療組大鼠肝臟組織中NF-κB、TNF-α、IL-6、IL-8的mRNA含量均顯著低于模型組(P<0.05)。見表2。

表2 建模后4周3組大鼠肝臟組織中炎性因子含量比較±s，n=40)

*P<0.05，與對照組比較，compared with control group；#P<0.05，與模型組比較，compared with model group

3 討論

過度飲酒是造成酒精性肝損傷最常見的原因，本研究通過酒精灌胃的方式來制作酒精性肝損傷的模型[6]。丙氨酸氨基轉移酶(ALT)和天門冬氨酸氨基轉移酶(AST)是臨床上用于評價肝功能的最常用指標，是位于肝細胞胞漿內的2種參與氨基酸代謝的重要酶類[7]；當肝細胞發生酒精性損傷后，細胞破裂，胞漿中的ALT和AST會釋放進入血液循環，造成血清中轉氨酶含量升高[8]。除了ALT和AST外，α-谷胱甘肽-S轉移酶(α-GST)和谷氨酸脫氫酶(GLDH)是新發現的2類特異性存在于肝細胞中的酶類，前者存在于肝小葉中心細胞中，后者存在于肝小葉內的線粒體中，血清中α-GST和GLDH含量能夠反映肝細胞損傷程度[3]。在建立酒精性肝損傷模型后，模型組大鼠血清中ALT、AST、α-GST和GLDH含量高于對照組，說明酒精性肝損傷模型建立成功。

冬凌草是臨床常用的中藥材，味甘苦、性微寒。該藥材提取物的主要化學成分是貝殼杉烯類二萜，活性成分是冬凌草甲素，具有殺滅抑制腫瘤細胞的作用，多用于清熱解毒、抗腫瘤、健胃活血等[9]。已有研究顯示，冬凌草能夠減輕四氯化碳所造成的肝損傷，具體表現為穩定肝細胞的細胞膜結構、減輕過氧化反應和炎癥反應所造成的肝細胞損傷[10]。尹波等[11]通過冬凌草甲素注射液的研究認為，冬凌草具有對肉瘤S180、白血病L12103腫瘤細胞增殖的抑制作用； Liu等[12]實驗表明，冬凌草甲素對MG63、U2OS、SaOS-2骨肉瘤細胞抑制率達60%，且具有明顯的量-效與時-效關系。本研究采用冬凌草來治療酒精性肝損傷，通過分析接受冬凌草治療后大鼠血清中的肝酶指標可知，治療組大鼠血清中ALT、AST、α-GST和GLDH含量低于模型組，其他學者也有類似的文獻報道[13-14]，提示冬凌草治療能夠減輕酒精性肝損傷的程度，具有保護肝功能的作用。

近年來關于酒精性肝損傷發生機制的研究認為，內源性LPS激活肝臟庫普弗細胞后產生的炎性因子是造成肝細胞損傷的重要環節[15]。核轉錄因子NF-κB是肝細胞內調節炎癥反應、免疫反應、細胞周期等重要的一種轉錄因子[16]。當細胞處于靜息狀態時，細胞中的NF-κB位于胞漿中；當細胞發生酒精性損傷時，LPS能夠激活NF-κB并轉位進入細胞核，通過與靶基因啟動子區域結合來增加炎性因子TNF-α、IL-6、IL-8等的表達[17]。研究表明大量炎癥介質及炎性細胞因子是引起重型肝炎肝臟微循環障礙的重要原因[18]，其中TNF-α是重要的炎性介質，能夠造成肝細胞損傷和壞死； IL-8在其多種生物特性中，具有一種趨化中性粒細胞的作用；IL-6是一種多功能的細胞因子，涉及感染、炎癥等急性期反應[19]，IL-6、IL-8是重要的趨化因子，能夠在局部招募多種炎性細胞并釋放炎性因子。本研究的分析顯示，模型組肝臟組織中NF-κB、TNF-α、IL-6、IL-8的mRNA含量高于對照組，治療組肝臟組織中NF-κB、TNF-α、IL-6、IL-8的mRNA含量低于模型組。提示冬凌草治療能夠減輕酒精性肝損傷組織中的炎癥反應程度。

本文研究表明，酒精灌胃能夠造成肝損傷，冬凌草治療能夠減輕肝損傷，緩解炎癥反應。其作用機制有待于進一步基礎研究與臨床研究證實。

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(編校：王冬梅)

Effect of rubescens on inflammatory cytokines and liver function in rat with alcoholic liver injury model

SONG Qi-wen1, LIU Zhi2, SUN Wei-min2, TAN Rong2, HUANG Yong3Δ

(1.Pharmacy Teaching and Research Office, Guiyang Medical University, Guiyang 5500042, China; 2 Department of Pharmacy, Hospital Affiliated to Guiyang Medical College, Guiyang 550004, China; 3 Preparation Engineering, Guiyang Medical University, Guiyang 550004, China)

ObjectiveTo study effect of rubescens on inflammatory cytokines and liver function of alcoholic liver injury rat model.Methods120 SD rats were chosed for studied, randomly divided into control group， model group and treatment group,40 rats per group.Alcoholic liver injury rat model was made by ethanol feeding approach, rubescens were given for treatment.Then serum AST， ALT， α-GST， GLDH content and liver tissue NF-κB，TNF-α, IL-6, IL-8 levels were detected by electrochemiluminescence and fluorescent quantitation PCR,respectively.ResultsModel group serum AST, ALT, α-GST, GLDH contents and NF-κB, TNF-α, IL-6, IL-8 contents in liver tissue were higher than control group(t=12.030～37.417,P<0.05). Treatment group serum AST,ALT, α-GST, GLDH contents and NF-κB, TNF-α, IL-6, IL-8 contents in liver tissue were lower than model group (t=5.128～32.325,P<0.05).ConclusionAlcohol feeding can cause liver damage, rubescens therapy can reduce liver injury, relieve inflammation.

alcoholic liver injury; rubescens; transaminase;inflammatory cytokines

宋琪雯，女,碩士，主管藥師,研究方向：中藥藥效物質基礎研究及新藥開發，E-mail：gzsongqiwen@163.com；黃勇，通信作者,男，博士，教授，研究方向：中藥藥效物質基礎研究及新藥開發，E-mail:1907097890@qq.com。

R575

A

1005-1678(2015)10-0015-04