補腎強精顆粒改善特發性弱精子癥患者DNA完整性的臨床研究

姚文亮，陳勝輝

(南昌市醫學科學研究所附屬醫院 男科，江西 南昌 330001)

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補腎強精顆粒改善特發性弱精子癥患者DNA完整性的臨床研究

姚文亮Δ，陳勝輝

(南昌市醫學科學研究所附屬醫院 男科，江西 南昌 330001)

目的 探討補腎強精顆粒改善特發性弱精子癥患者DNA完整性的臨床效果。方法 選取南昌市醫學科學研究所附屬醫院男性不育門診特發性弱精子癥患者110例，采用隨機數字表法將患者分為3組，治療組(n=40)采用補腎強精顆粒治療，對照組(n=40)采用五子衍宗丸治療，空白對照組(n=30)給予安慰治療，比較3組間精液參數與精子DNA碎片化指數(DNA fragmentation index，DFI)的差異。結果 治療組治療有效率明顯高于對照組與空白對照組，對照組治療有效率明顯高于空白對照組，差異均具有統計學意義(P<0.05)。治療前后，3組間患者精液量、液化時間、a、a+b、a+b+c級精子百分率、精漿果糖與酸性磷酸酶水平比較差異無統計學意義。治療前，3組間患者精子密度、精子畸形率、α-糖苷酶與DFI比較差異無統計學意義，治療后，治療組精子密度明顯高于對照組與空白對照組，精子畸形率、DFI明顯低于對照組與空白對照組，對照組DFI明顯低于空白對照組，組間比較差異均有統計學意義(P<0.05)。Pearson相關性分析顯示，精子密度與DFI呈明顯的負相關(r=-0.354)，精子畸形率與DFI呈正相關(r=0.324)。結論 DNA完整性異常的主要原因為腎功能失調，補腎強精顆粒可作為改善精子DNA完整性的有效藥物。

補腎強精顆粒；特發性弱精子癥；DNA碎片化指數

特發性弱精子癥是常見的男性不育疾病之一，世界衛生組織(WHO)研究表明，不育夫婦中，男性存在生殖缺陷占50%以上[1]。精子DNA損傷與男性生育能力緊密相關，精子DNA損傷嚴重影響受精比率、胚胎發育與子代健康等。精子DNA碎片化指數(DNA fragmentation index，DFI)成為了男性生育能力的主要影響因素[2]。南昌市醫學科學研究所附屬醫院采用中藥(補腎強精顆粒)治療有助于改善特發性弱精子癥患者輔助生殖技術結局、男性生育能力與精子DNA完整性中具有重要的意義，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2014年1月～2015年1月期間南昌市醫學科學院附屬醫院男性不育門診特發性弱精子癥患者110例，采用隨機數字表法將患者分為治療組(n=40)，對照組(n=40)與空白對照組(n=30)。3組在年齡、病程與DFI等一般資料間比較差異無統計學意義。

診斷標準：參照WHO制定的特發性弱精子癥診斷標準[3]：①育齡男性與女性同居1年以上，有正常性生活，不采用任何避孕措施，女性生殖功能正常，男性精液異常導致不能生育者；② 2周內2次以上精液常規參數顯示精子活力低于正常標準值，而無明顯病因。

納入標準：23～45歲，已婚男性，符合特發性弱精子癥診斷標準，DFI%≥10%，同意參加本試驗研究并簽署知情同意書。本研究經本院倫理委員會批準。

排除標準：輸精管阻塞或缺如、成人雙側隱睪、兩性畸形、免疫因素、VCⅡ°以上、睪丸萎縮、先天性精路梗阻等原因導致不育患者;有生殖道感染，性傳播疾病，降壓降糖，抗癲癇與抗腫瘤等影響生精藥物服用史；癌癥放化療患者，合并造血系統、肝腎、心血管、精神病等疾病患者；藥物過敏，不遵醫囑服藥，臨床資料不完整、試驗期間退出等影響療效與安全性評估患者。

1.2 方法

1.2.1 治療方法：治療組患者采用補腎強精顆粒(南昌市男科醫院生產，批號：2011Z0037)10 g、溫水沖服，2次/天；對照組患者采用五子衍宗丸(通藥制藥股份有限公司生產,國藥準字Z20043603)6 g，2次/天，空白對照組給予安慰治療，不采用藥物治療。

1.2.2 檢測方法：①精液參數：禁欲3～7 d，手淫取精，室溫下靜置30 min后采用FT-9200DNA熒光染色精子動(靜)態圖像分析系統(北京航天瑞琪科技發展有限公司)測定精液量、pH值、液化時間、精子密度、精子運動級別[活率(a+b+c)級精子百分率、活力(a+b)級精子百分率]、精漿果糖、α-糖苷酸、酸性磷酸酶，采用瑞-吉氏染色法計算精子畸形率。②DFI：服藥前后3個月內分別檢查DFI，檢測步驟如下：精液標本室溫下液化，采用PBS緩沖液洗滌3次，離心，精液沉淀物混懸至50×106/mL。15 μL重懸液涂片。空氣干燥，采用Carnoy’s液(乙酸/甲醇，1:3)固定精液涂片3 h或整夜。沖洗、空氣干燥后采用新鮮AO染色液(Sigma公司)染色5 min，AO染色液需每天配置：1%AO原液10 ml+0.1 mmol/L枸櫞酸40 mL+0.3 mmol/L，pH 2.5 Na2HPO4·7H2O 2.5 mL。避光條件下，1%AO原液、0.1 mmol/L枸櫞酸可儲存4周，輕柔沖洗，干燥，熒光顯微鏡(AxioskopZplus,Carl zeiss, Thronwooa, NY, USA)下觀察。

1.2.3 觀察指標

① 臨床療效[4]：DFI降至正常范圍且女方懷孕者評定為治愈；DFI降至正常范圍且女方未懷孕者評定為顯效；DFI較治療前明顯降低，下降幅度≥10%者評定為有效；DFI較治療前無明顯改變或升高者評定為無效，治療總有效率=治愈率+顯效率+有效率。

② 精液常規參數：服藥前后3個月內，比較3組特發性弱精子癥患者精液常規參數[精液量、液化時間、精子密度、a級精子百分率、(a+b)級精子百分率、(a+b+c)級精子百分率、畸形率]與精漿成分(精漿果糖、α-糖苷酶、酸性磷酸酶)的差異。

③ 精子DNA完整性：DNA正常精子百分比：400倍熒光顯微鏡450～490 nm下觀察精子200個以上，正常雙鏈DNA精子熒光呈綠色，DNA受損精子熒光呈紅色、橙色、黃色。DFI=(受損DNA精子數)/精子總數)×100%。精子DNA完整性異常診斷標準：DFI%≥10%，輕度異常10%～19%，中度異常 20%～29%，重度異常≥30%[5]。

2 結果

2.1 3組間一般資料比較 3組在年齡、病程與DFI等一般資料間比較差異無統計學意義。

表1 3組間一般資料情況比較

2.2 3組間臨床療效比較 治療組治療有效率明顯高于對照組與空白對照組，對照組治療有效率明顯高于空白對照組，差異均有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 3組間臨床療效比較

*P<0.05，與空白對照組比較，compared with blank control group；#P<0.05，與對照組比較，compared with control group

2.3 3組間精液常規參數比較 治療前后，3組間患者精液量、液化時間與精子百分率比較差異無統計學意義，治療前，3組間患者精子密度、精子畸形率比較差異無統計學意義。治療后，治療組精子密度明顯高于對照組與空白對照組(P<0.05)，精子畸形率明顯低于對照組與空白對照組(P<0.05)，且治療組精子密度明顯高于同組治療前，精子畸形率明顯低于同組治療前，治療前后比較差異有統計學意義(P<0.05)。見表3。

表3 3組間精液常規參數比較

*P<0.05，與空白對照組比較，compared with blank control group；#P<0.05，與對照組比較，compared with control group；△P<0.05，與治療前比較，compared with pre-treatmant

2.4 組間精漿成分與DFI比較 治療前后，3組間精漿果糖、酸性磷酸酶水平比較差異無統計學意義。治療前，組間α-糖苷敏、DFI比較差異無統計學意義。治療后，治療組α-糖苷敏明顯高于對照組與空白對照組(P<0.05)；DFI明顯低于對照組與空白對照組，對照組DFI明顯低于空白對照組，差異均有統計學意義(P<0.05)。治療組α-糖苷敏明顯高于同組治療前，DFI明顯低于同組治療前，治療前后比較差異有統計學意義(P<0.05)。見表4。

表4 3組間精漿成分與DFI比較

*P<0.05，與空白對照組比較，compared with blank control group；#P<0.05，與對照組比較，compared with control group；△P<0.05，與治療前比較，compared with pre-treatmant

2.5 精液參數與DFI的關系 Pearson相關性分析結果表明：精子密度、畸形率與DFI相關，其中精子密度與DFI呈負相關(r=-0.354)，精子畸形率與DFI呈正相關(r=0.324)。見表5。

表5 精液參數與DFI的關系

續表

3 討論

環境污染與醫源性措施等因素均能導致精子DNA損傷，嚴重影響精子DNA完整性。精子發生獨特而復雜，精子形成過程中，組蛋白逐漸被魚精蛋白替代。魚精蛋白通過中和DNA電荷，降低DNA分子間的靜電作用，與二硫鍵交聯形成致密胞核；在精子轉運過程中，魚精蛋白與精子DNA的保護和抵抗卵細胞胞質內形成成熟促進因子(mature promoting factor, MPF)，從而確保遺傳物質完整性。但特發性弱精子癥患者精子DNA完整性異常，其精子DNA變性程度明顯高于正常生育人群，其中精子質量與精子DNA損傷呈負相關，精液常規參數異常者精子DNA變性程度明顯高于精液常規參數正常者[6]。同時，特發性弱精子癥患者生精細胞系XY非整倍體與XY二倍體、精子DNA斷裂、精子染色質異常水平升高，提示特發性弱精子癥患者存在多精子水平缺陷，而非單純性精子數量減少導致的[7]。精子DNA完整性影響妊娠率與受精率，精子DNA斷裂水平與精子質量與呈負相關，其中精子DNA斷裂水平>20%，妊娠率與受精率的顯著下降[8]。因此，DNA完整性對男性生育功能具有重要的預測價值。相關研究表明，口服藥物、體外培養與精子制備技術均能有效改善精子DNA完整性[9]。其中口服藥物簡便易行，有助于臨床推廣應用，藥物干預通過顯著改善患者DFI，恢復精子DNA完整性，提高精子質量與數量，是治療精子DNA損傷的有效手段，但目前尚未發現最為顯著有效的口服藥物。中醫學認為特發性弱精子癥與腎功能具有明顯的相關性，參照“陰成形、陽化氣”，“內腎外腎”、“精血同源”等理論，通過采用補腎強精療法有效調理腎功能，有助于改善精子發育與成熟的環境[10]。因此，中醫藥在改善特發性弱精子癥的臨床治療中發揮重要的作用，并積累了豐富的經驗。本院通過長期治療特發性弱精子癥所累積的臨床經驗，制備了補腎強精顆粒。大量臨床實踐證實，補腎強精顆粒在治療特發性弱精子癥的臨床療效顯著，但目前尚缺乏對精子DNA完整性的影響研究[11]。

本研究通過觀察補腎強精顆粒對特發性弱精子癥患者精液參數[精液量、液化時間、精子密度、a級精子百分率、(a+b)級精子百分率、(a+b+c)級精子百分率、畸形率]、精漿成分(精漿果糖、a-糖苷酶、酸性磷酸酶)與精子DNA完整性的影響，結果顯示：補腎強精顆粒患者治療有效率最高，其次為五子衍宗丸，揭示了補腎強精顆粒治療特發性弱精子癥患者的臨床療效顯著；其中中藥治療后，全部患者精液量、液化時間、a、a+b、a+b+c級精子百分率、精漿果糖與酸性磷酸酶等精液參數指標均有明顯改善，而補腎強精顆粒治療患者精子密度明顯升高，精子畸形率、DFI明顯降低，其中補腎強精顆粒DFI降低幅度最為顯著，其次為五子衍宗丸。Pearson相關性分析顯示，精子密度與DFI呈明顯的負相關，精子畸形率與DFI呈明顯的正相關，提示補腎強精顆粒在改善DFI中的作用最為顯著。補腎強精顆粒主要成分為甘草、皂角刺、沙苑子、肉蓯蓉、杜仲、山茱萸、枸杞子、肉桂、熟地、黃芪等，具有溫腎益精、填髓壯陽之功效，皂角刺具有排膿消腫、活血化瘀之功效，沙苑子具有補腎益精之功效，肉蓯蓉具有壯陽之功效，杜仲具有補腎虛之功效，山茱萸具有澀精補腎之功效，枸杞子具有補腎精、滋養腎陰之功效，肉桂具有壯陽、抗腫瘤、抗菌等功效，甘草調和諸藥，諸藥配伍共發揮益腎壯陽之功效。同時，枸杞子具有抗氧化作用，避免高濃度活性氧對精子DNA的損傷；熟地能促進內皮細胞增殖功能，促進正常細胞凋亡，有助于清除DNA受損的精子[12]。因此，補腎強精顆粒對特發性弱精子癥患者精子DNA完整性具有重要的改善作用，可改善輔助生殖治療的結局，有效解決不孕不育問題。

綜上所述，DNA完整性異常的主要原因為腎功能失調，補腎強精顆粒可作為改善精子DNA完整性的有效藥物。

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(編校：吳茜)

Clinical study on effect of kidney essence granule on improvement of DNA integrity in patients with idiopathic weak sperm

YAO Wen-liangΔ, CHEN Sheng-hui

(Pepartmenf of Andrology,Nanchang Institute of Medical Sciences, Nanchang 330001, China)

ObjectiveTo investigate clinical effect of kidney essence granule on DNA intergrity in patients with idiopathic weak sperm.Methods110 cases of idiopathic weak sperm disease in outpatient service of male infertility were selected, and divided into 3 groups using random number table method, treatment group (n=40) treated with strong kidney essence granule and control group (n=40) by Wuzi Yanzong pill treatment, blank control group (n=30) given placebo treatment.Semen parameters and sperm DNA fragmentation index (DFI) differences were compared within groups.ResultsThe efficacy of treatment group was significantly higher than control group and blank control group, and control group was significantly higher than blank control group, the differences were all statistically significant (P<0.05).There was no significant difference among the 3 groups of patients within semen volume, liquefaction time, a,(a+b),(a+b+c) grade sperm percentage, seminal plasma fructose and acid phosphatase level pre-and post-treatment. Pre-treatment, sperm density, sperm abnormality rate, α-glycosides and DFI were not significantly different among the 3 groups.Post-treatment, sperm density in treatment group was significantly higher than that in control group, and sperm deformity rate and DFI were significantly lower than that in control group, and that in control group was significantly lower than that in blank control group (P<0.05).Pearson correlation analysis showed that the sperm density was negatively correlated with DFI(r=-0.354), and the sperm deformity rate was positively correlated with DFI(r=0.324).ConclusionThe main reason for abnormal DNA integrity are renal dysfunction, and kidney essence granule can be used as an effective medicine to improve the integrity of sperm DNA.

kidney essence granule; idiopathic weak sperm disease; DNA fragmentation index

江西省衛計委中醫藥科研基金，南昌市科技支撐項目(2014A153)

姚文亮，通信作者，男，碩士，副主任中醫師，研究方向：男性不育癥的診斷與治療，E-mail：jiangxiywl@163.com。

R277.5

A

1005-1678(2015)10-0025-04