拉莫三嗪微透析體內外回收率及其影響因素的研究

俞安安，袁芳，楊智承，夏自花，范凱燕，楊帆

(廣東藥學院 藥科學院，廣東 廣州 510006)

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拉莫三嗪微透析體內外回收率及其影響因素的研究

俞安安，袁芳，楊智承，夏自花，范凱燕，楊帆Δ

(廣東藥學院 藥科學院，廣東 廣州 510006)

目的 建立高效液相色譜(high performance liquid chromatography，HPLC)測定血管微透析樣品中拉莫三嗪含量的方法，測定拉莫三嗪微透析體外回收率并考察其影響因素，篩選適用于體內實驗的微透析條件。方法 采用正、反透析法測定拉莫三嗪血管微透析的體外回收率，并考察流速、濃度、溫度、時間對回收率的影響，驗證反透析法用于測定體內回收率的可行性并篩選出體內實驗的最佳灌流速度和平衡時間；采用反透析法測定血管探針的體內回收率并考察其體內穩定性。結果 在相同條件下探針相對回收率與相對損失率近似相等，并隨流速增加而降低，隨溫度升高而增高；在相同流速下，回收率與藥物濃度無關；當灌流速度為2 μL/min，平衡時間為1.5 h時，探針的體內回收率可維持6.5 h穩定。結論 微透析采樣技術可用于拉莫三嗪的血藥濃度研究，反透析法可作為拉莫三嗪血管微透析體內回收率的測定方法。

拉莫三嗪；微透析；體外回收率；體內回收率

微透析技術(microdialysis technique)是一種在不破壞生物體內環境的前提下，對生物體細胞間液的內源性或外源性物質進行連續取樣和分析的檢測技術[1]，它是利用半透膜對小分子物質具有通透性以及小分子物質可以跨濃度梯度擴散的原理設計的[2]，其基本操作過程是通過手術將具有半透膜的微透析探針植入待測組織中，體外微量泵使灌流液按一定的流速持續流經探針，組織中的小分子物質如藥物順濃度梯度跨過半透膜進入灌流液，這樣就完成了在半透膜兩端灌流液與組織液之間的物質交換。通過測定流出液中待測物的濃度，研究組織細胞外液中待測物的濃度及變化過程。在取樣過程中由于灌流液持續灌流，探針膜內外物質的交換是不充分的，透析液中的藥物濃度僅為細胞外液中藥物濃度的一部分，其比值被定義為相對回收率(relative recovery，RR)，而微透析探針的相對回收率又受很多因素的影響，如探針膜長、灌流速度、濃度、溫度等[3]。因此對探針回收率的考察是將微透析技術應用于藥動學研究的一個關鍵問題。

拉莫三嗪(lamotrigine，LTG)，是一種廣譜的抗癲癇藥物，用于12歲以上兒童及成人，具有簡單部分性發作、復雜部分性發作、繼發性全身強直陣攣性發作及原發性全身強直陣攣性發作等癲癇的治療。拉莫三嗪尤其對老年女性癲癇患者具有顯著療效[4]。由于微透析采樣技術具有組織損傷小、操作簡單、可實現在線分析[5]、節約動物等優點，近年來微透析采樣技術運用于藥物代謝動力學的研究已成為目前微透析研究的熱點。為了考察使用反透析法測定拉莫三嗪體內回收率的合理性及將微透析采樣技術應用于拉莫三嗪相關制劑體內藥物代謝動力學研究的可行性，本研究對拉莫三嗪微透析體內外回收率及其影響因素進行研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器：Agilent 1260高效液相色譜儀(美國安捷倫公司)；BASi微透析系統(CULEX Fraction Collector，Syringe Pump，MDN0100 Syringe 1.0 mL，5 mm線性探針，美國BASi公司)；RET basic 數顯加熱磁力攪拌器(德國IKA公司)；AUW220D型電子天平(日本島津公司)。

1.1.2 藥品與試劑：拉莫三嗪對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號：100775-200401，純度≥99.0%)。屈臣氏蒸餾水(廣州屈臣氏有限公司)；醋酸銨(HPLC級，上海麥克林公司)；乙腈(HPLC級，德國默克公司)；其他試劑為分析純。灌流液為枸櫞酸-葡萄糖(anticoagulant citrate dextrose，ACD)溶液，為實驗室自制，含枸櫞酸3.5 mM、枸櫞酸鈉7.5 mM、葡萄糖13.6 mM，使用前過0.22 μm微孔濾膜。

1.1.3 實驗動物：Sprague-Dawley大鼠，SPF級，雄性，體質量180～220 g，購于廣東省醫學實驗動物中心，許可證號SCXK(粵)2013-0002，所有動物實驗均遵循《實驗動物保護條例》。

1.2 方法

1.2.1 微透析液中LTG含量測定方法的建立

① 色譜條件：色譜柱為Phenomenex C18柱(25 mm×4.6 mm，5 μm)(美國菲羅門公司)；流動相為乙腈-20 mmol/L醋酸銨(V:V=28:72)；流速為0.8 mL/min；進樣量為20 μL；柱溫為40 ℃；測定波長為310 nm；運行時間為10 min。

② 專屬性考察 ：分別取空白ACD透析樣品、LTG標準品溶液透析樣品適量，按①中所建立的色譜方法進樣，記錄色譜圖。

③ 線性關系考察：精密稱取拉莫三嗪標準品適量，置于100 mL容量瓶中，加ACD溶液溶解定容，制成濃度為100 μg/mL的拉莫三嗪對照品母液。分別吸取上述母液5、10、30、50、100、200、300、400、500 μL于5 mL容量瓶中，加ACD溶液定容，制得一系列對照品溶液，按配制濃度為0.1、0.2、0.6、1、2、6、8、10 μg/mL的標準品溶液依次進樣，按①中色譜條件進樣，記錄色譜峰面積，以色譜峰面積(Y)為縱坐標，樣品質量濃度(X)為橫坐標，進行線性回歸。

④ 精密度考察： 分別取0.1、1、10 μg/mL的低、中、高3種質量濃度的拉莫三嗪標準品溶液，按① 中色譜條件在1 d內各進樣6次，得日內精密度；連續3 d進樣測定，得日間精密度。

⑤ 穩定性考察：取同一供試品溶液分別在0、2、8、12、24、48，72 h進樣，按①中色譜條件進樣。

⑥ 檢測限和定量限考察：分別配制不同濃度的對照品溶液，按①中色譜條件各進樣20 μL，根據檢測限的信噪比S/N=3及定量限的信噪比S/N=10來確定該方法的檢測限與定量限。

1.2.2 體外回收率的測定及其影響因素考察

① 體外回收率的測定：體外回收率的測定采用正、反透析的方法。

正透析法測定相對回收率(relative recovery，RR)：將探針置于帶有磁力攪拌器的燒杯內，燒杯置于37 ℃恒溫水浴中，杯中加入1 μg/mL的拉莫三嗪ACD溶液。用空白ACD溶液以2 μL/min的流速灌注探針，收集樣品前探針先平衡1.5 h，隨后收集6份微透析樣品。HPLC測定燒杯中拉莫三嗪的濃度C和透析樣品中拉莫三嗪的濃度C透析，按公式計算相對回收率RR=C透析/C×100%；

反透析法測定相對損失率(relative loss，RL)：將探針置于帶有磁力攪拌器的燒杯內，燒杯置于37 ℃恒溫水浴中，杯中加入空白ACD溶液。用1 μg/mL的拉莫三嗪ACD溶液以2 μL/min的流速灌注探針，收集樣品前探針先平衡1.5 h，隨后收集6份微透析樣品。HPLC測定透析樣品中拉莫三嗪的濃度C透析和灌流液中拉莫三嗪的濃度C灌流，按公式計算相對損失率RL=(C灌流-(C透析)/C灌流×100%。

② 流速對回收率的影響：灌流速度是影響探針回收率大小的重要因素之一，流速越快，灌流液流經半透膜時膜內外藥物的平衡時間就越短，膜內外藥物交換就越不充分，回收率就越低。按照1.2.2項下①中的正、反透析方法考察流速對體外回收率的影響，其中灌流速度依次設定為1、1.5、2、2.5、3 μL/min，每更換一種流速，探針先平衡1.5 h，每種流速下收集6份透析樣品。其他條件同1.2.1項下①。

③ 濃度對回收率的影響：在進行體內藥動學研究的過程中，探針周圍細胞外液中的藥物濃度是動態變化的，為了保證透析液中藥物濃度的變化能夠準確反應組織中藥物濃度的變化，探針的回收率大小必須與藥物濃度無關，這是微透析技術應用的理論前提[6]。按照1.2.2項下①中的正、反透析方法考察濃度對體外回收率的影響，其中正透析時燒杯中的拉莫三嗪濃度依次為0.1、1、10 μg/mL，反透析時灌流液中拉莫三嗪的濃度依次為0.1，1，10 μg/mL。每種濃度下先平衡1.5 h，再收集6份透析樣品。其他條件同1.2.1項下①。

④ 溫度對回收率的影響：溫度升高，分子熱運動增加，物質擴散進微透析膜中的幾率增大，回收率則增加。按照1.2.2項下①中的正、反透析方法考察溫度對體外回收率的影響，其中燒杯依次置于20、37、50 ℃的恒溫水浴中，每種溫度下先平衡1.5 h，再收集6份透析樣品。其他條件同1.2.1項下。

⑤ 時間對回收率的影響：在微透析實驗中一根探針往往需要連續取樣多個小時，如果在取樣過程中，探針的回收率發生變化，則會失去微透析技術本身的意義[7]，因此有必要考察其回收率隨時間的變化關系。按照1.2.2項下①中的正、反透析方法考察時間對體外回收率的影響，從時間為0時開始收集微透析樣本，每30 min收集一個樣品，持續收集8 h。

1.2.3 體內回收率的校正及其穩定性的考察

① 血管探針的植入：生理鹽水配置20%烏拉坦溶液，大鼠稱重后按0.7 mL/100 g劑量腹腔注射進行麻醉。麻醉成功后將大鼠仰臥位固定于鼠板保溫墊上，頸部頸靜脈處剃毛，酒精消毒手術區。于頸靜脈處用剪刀剪開皮膚，鈍性分離黏膜、肌肉至暴露頸靜脈，將頸靜脈游離出約1 cm。用手術線遠心端結扎血管，近心端用手術線從下方穿過但不結扎；將血管探針及引導管用肝素浸潤，使用眼科手術剪在血管中間位置做斜行切口。將引導管插入血管切口，然后將血管探針由引導管緩慢推送入頸靜脈，拔出引導管。近心端手術線結扎固定探針，隨即灌流ACD溶液用于平衡，流速為2 μL/min。

② 體內回收率的測定及其穩定性：采用反透析法測定血管探針的體內回收率，探針成功植入后，用含1 μg/mL的拉莫三嗪ACD溶液作為灌流液，以2 μL/min的流速灌注探針，從時間為0時開始收集透析樣本，每30 min收集一個樣品，持續收集8 h。HPLC測定透析樣品中拉莫三嗪的濃度C透析和灌流液中拉莫三嗪的濃度C灌流，按公式計算體內相對損失率RL=(C灌流-C透析)/C灌流×100%，即為體內回收率。

2 結果

2.1 HPLC測定微透析液中LTG含量

2.1.1 專屬性考察：微透析液中LTG峰形良好，大約在8.7 min時出峰，分離度及對稱因子均符合要求，見圖1。可知在本實驗條件下的分析方法具有良好的專屬性，空白ACD溶液并不影響LTG的測定。

圖1 拉莫三嗪微透析樣品HPLC色譜圖A：空白ACD溶液；B：拉莫三嗪微透析樣品；1：拉莫三嗪Fig.1 HPLC chromatograms of lamotrigine dialysateA：blank ACD solution; B：lamotrigine dialysate;1：lamotrigine

2.1.2 線性關系考察：回歸方程為Y=39.62537X-0.83244(R2=0.9999)，結果表明拉莫三嗪在0.1～10 μg/mL線性關系良好，該線性方程可用于拉莫三嗪的含量測定。

2.1.3 精密度考察：低、中、高3種濃度標準品溶液的日內精密度RSD分別為0.52%，0.89%和1.04%；日間精密度RSD分別為1.36%，1.77%，1.98%，該結果表明本HPLC方法精密度良好。

2.1.4 穩定性考察： LTG標準品溶液在72 h內的RSD為1.59%，結果表明LTG在測定條件下72 h內穩定性良好。

2.1.5 檢測限和定量限考察：拉莫三嗪的檢測限為20 ng/mL (信噪比S/N=3)；定量限為50 ng/mL(信噪比S/N=10)。

2.2 體外回收率的測定及影響因素考察

2.2.1 流速對回收率的影響：同一流速下，探針正透析與反透析的回收率基本一致；并且隨著灌流速度的增加，探針回收率呈下降趨勢，見表1、圖2。因此選擇較低的灌流速度越有利于藥物的回收，但低流速下取樣間隔勢必增長，從而丟失部分藥物濃度變化信息，最終選擇在體動物實驗時的灌流速度為2 μL/min。

表1 灌流速度對拉莫三嗪體外回收率的影響(n=6)

圖2 灌流速度對拉莫三嗪體外回收率的影響(n=6)Fig.2 Influence of flow rate on LTG in vitro recovery(n=6)

2.2.2 濃度對回收率的影響：3種不同質量濃度的透析媒介中，正、反透析所得的回收率均很接近，表明在0.1～10 μg/mL內，探針的回收率穩定，其大小與藥物的質量濃度無關。見表2、圖3。

表2 藥物濃度對拉莫三嗪體外回收率的影響(n=6)

圖3 藥物濃度對拉莫三嗪體外回收率的影響(n=6)Fig.3 Influence of concentration on LTG in vitro recovery(n=6)

2.2.3 溫度對回收率的影響：在20 ℃～50 ℃時，隨著溫度的升高，探針的回收率也升高，但高于37 ℃時探針回收率的升高并不明顯。見表3、圖4。在進行動物實驗時，由于麻醉劑的使用會使動物體溫下降，因此要使用恒溫墊盡量保證動物體溫維持在37 ℃左右，但過高的溫度也沒有必要，不僅影響動物的正常生命活動，對提高探針回收率的作用也不大。

表3 溫度對拉莫三嗪體外回收率的影響(n=6)

圖4 溫度對拉莫三嗪體外回收率的影響(n=6)Fig.4 Influence of temperature on LTG in vitro recovery(n=6)

2.2.4 體外回收率的穩定性：探針的回收率在0～1 h是呈下降趨勢；從第1.5 h開始時，回收率持續穩定在一定的范圍內，RL為(66.81±0.17)%，RSD為0.26%(n=14)，RR為(67.25±0.24)%，RSD為0.36%(n=14)；并且正、反透析的回收率變化也相似，見圖5。因此，在進行體內動物實驗時，要先將探針平衡至少1.5 h后再開始采集樣本。

圖5 拉莫三嗪體外回收率的穩定性Fig.5 Stability of LTG in vitro recovery

2.2.5 體內回收率的測定及其穩定性：探針的體內回收率在0～1 h是呈下降趨勢；在1.5～8 h探針的回收率較穩定，為(58.27±0.62)%，RSD為1.06%(n=14)，見圖6。可見在灌流速度為2 μL/min，平衡時間為1.5 h的條件下，探針的體內回收率至少可以維持6.5 h穩定，可以滿足相關制劑的血藥濃度研究。

圖6 拉莫三嗪體內回收率的穩定性Fig.6 Stability of LTG in vivo recovery

3 討論

3.1 探針體外回收率測定的必要性 在體內微透析實驗中，由于待測組織中藥物的濃度是未知的，所以一般是通過反透析法測定藥物經半透膜時的損失量來間接計算探針的回收率。因此，探針的回收率等于探針的損失率是反透析法的理論基礎[8]。在一般情況下，藥物的回收率是等于其損失率的，但也有特殊情況[9]，因此在利用反透析法測定某種藥物的回收率之前，必須先驗證其回收率與損失率是否相等，否則利用反透析法測定回收率的結果是不可信的。同時回收率與透析媒介的濃度無關也是反透析法測定體內回收率的基礎。本研究通過體外實驗證明了這2點，確定了在體內研究中反透析法可作為拉莫三嗪回收率的測定方法。

3.2 灌流液的選擇 微透析灌流液有多種，常用的有林格液、枸櫞酸-葡萄糖溶液、人工腦脊液、磷酸鹽緩沖液等，其中除了人工腦脊液常作為腦探針灌流液，其他3種均可以作為血管探針灌流液。本實驗選擇枸櫞酸-葡萄糖溶液作為血管探針灌流液，一方面是因為拉莫三嗪在該溶液中溶解度較好，溶液澄清透明，另一方面是因為該溶液具有一定的抗凝作用，可以減少血凝對探針回收率的影響。

3.3 體內回收率較體外回收率低 本實驗結果表明，在同一流速、同一濃度下，探針的體內回收率約為58.26%，體外回收率約為66.78%。體內回收率較體外回收率低的原因可能有以下2點：(1)體內實驗時，動物在麻醉的情況下，代謝較低，血流速度較慢，血管中藥物濃度不能及時趨于均勻，與探針內的藥物濃度梯度較小，因此擴散較慢；而體外實驗時，燒杯中的擴散媒介始終有磁力攪拌器將擴散進入的藥物攪拌均勻，與半透膜內的藥物濃度梯度大，因此擴散較快。研究者在前期實驗時發現，體積較小的磁力攪拌子、較慢的攪拌速度、底面積較小的燒杯都會使探針的回收率降低，這一現象可以很好的證明上述觀點；(2)血液中的一些大分子物質如蛋白質等雖不會穿過半透膜，但會黏附于半透膜上，因此藥物擴散受到阻礙，回收率降低。由此可見，體外回收率的校正并不能完全代替體內回收率的校正，實驗者在進行完體外回收率測定時，仍應測定體內回收率。

3.4 探針的使用次數 本實驗的前期研究表明，在體外實驗時，一根探針可以持續使用7次以上，其回收率都相對穩定，但在體內實驗時，每使用一次，探針的回收率就會有所下降，當探針使用3次以上，其回收率就會降低到20%左右，究其原因，應該是體內一些大分子物質吸附在半透膜表面上，阻礙了藥物的擴散，而這種吸附是不可逆的，不能通過不斷灌流蒸餾水及超聲清洗來解除。因此，為了保證探針的體內回收率，一根探針盡量只用3次，并且每次實驗結束后都要進行探針體內回收率的測定，作為該次實驗的回收率校正。

微透析技術是近年發展起來的一項活體生物取樣技術，其最大優點是在基本不干擾體內正常生命過程的情況下進行在體(in vivo)、實時(real time)和在線(on line)取樣[10]。通過本次研究表明，反透析法可用于拉莫三嗪血管探針體內回收率的校正，其微透析采樣的條件可以通過體外實驗來確定，在相同的條件下，探針的回收率隨灌流速度增加而降低、隨溫度升高而增加，并與探針周圍的藥物濃度無關。該血管微透析采樣技術可以用于拉莫三嗪相關制劑血藥濃度的研究。

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(編校：王冬梅)

Invitroandinvivorecovery assessment of lamotrigine in microdialysis probe and its influencing factors

YU An-an, YUAN Fang, YANG Zhi-cheng, XIA Zi-hua, FAN Kai-yan, YANG FanΔ

(School of Pharmacy, Guangdong Pharmaceutical University, Guangzhou 510006, China)

ObjectiveTo establish a high performance liquid chromatography method to detect the concentration of lamotrigine in blood dialysate and investigateinvitrorecovery of lamotrigine and the factors. Select the microdialysis conditions that apply to the animal experiment and guide the stability study of in vivo recovery.MethodsPositive dialysis and retrodialysis were used for the examination of lamotrigineinvitrorecovery and the influencing factors such as flow rate, concentration, temperature and time. Filtered out the best conditions that apply to theinvivoexperiment. Used the retrodialysis to determine theinvivorecovery and its stability.ResultsThere was no significant difference between relative recovery and relative loss in the same flow rate. The concentration had no obvious effect on relative recovery. At the same condition，relative recovery decreased with the increase of the flow rate and increased with the temperature．Theinvivorecovery had a good stability of 6.5 hours when the flow rate and stabilization time were set at 2 μL/minand 1.5 h, respectivily.ConclusionMicrodialysis technique can be used for the pharmacokinetic study of lamotrigine. Retrodialysis can be used for the determination of the lamotrigineinvivorecovery.

lamotrigine; microdialysis;invitrorecovery;invivorecovery

廣東省省級科技計劃項目(2013B021800091)

俞安安，女，碩士在讀，研究方向：藥物新劑型及藥代動力學， E-mail：yuanan924@126.com；楊帆，通信作者，女，博士，教授，碩士生導師，研究方向：藥物新劑型與生物藥劑學研究，E-mail：gzyangfan@hotmail.com。

R284

A

1005-1678(2015)10-0122-05